Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso de uma plataforma de diagnóstico multiplexada no local de atendimento que não requer preparação extensiva de amostras e instrumentação cara e é usada em uma variedade de amostras biológicas. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do diagnóstico no local de atendimento, como a detecção de diferentes alvos em um único tubo de reação. Usando amplificação isotérmica mediada por loop juntamente com sondas de deslocamento de fita específica do alvo, três vírus diferentes podem ser detectados com eficiência.

A principal vantagem dessa técnica é que ela usa amplificação isotérmica em vez de PCR e requer preparação mínima de amostra e pode ser aplicada a uma variedade de amostras clínicas. Comece cortando folhas de papel Q em pequenos retângulos de três milímetros por quatro milímetros usando um furador de papel. Em seguida, use um micropilão para esmagar mosquitos fêmeas de Aedes aegypti potencialmente infectados com Zika em cada papel.

Pipetar 20 microlitros de uma solução aquosa de amônia molar em cada pedaço de papel. Após cinco minutos, lave cada papel com 20 microlitros de etanol a 50%, seguidos de 20 microlitros de água livre de nuclease. Seque o papel ao ar em um armário de biossegurança BSL-2 por cerca de uma hora.

Após a secagem, use uma pinça para mergulhar totalmente cada papel em 100 microlitros de mistura de reação RT-LAMP e incube a 65 a 68 graus Celsius por 45 minutos. Leia e registre a fluorescência decorrente do vírus Zika usando uma caixa de observação impressa em 3D com uma fonte de luz LED e um filtro laranja ou amarelo. Comece adicionando 90 microlitros de tampão de reidratação de 1,1 vezes a cada tubo de reação contendo reagentes RT-LAMP liofilizados e dissolva agitando.

Em seguida, gire brevemente a 1.000 vezes a gravidade. Após a centrifugação, adicione 10 microlitros de amostra de urina enriquecida com o RNA viral aos tubos de reação e misture por pipetagem. Se estiver testando mosquitos, adicione um retângulo de papel Q contendo carcaças de mosquitos junto com 10 microlitros de água purificada em vez de urina.

Coloque os tubos fechados em um bloco de calor predefinido a 65 a 68 graus Celsius e incube por 30 a 45 minutos. Após a incubação, manter os tubos fechados para evitar a contaminação de ensaios futuros e colocá-los na caixa de observação. Ligue o interruptor na parte de trás da caixa de observação.

Observe a amostra através do filtro laranja e capture a imagem por uma câmera de celular que é mantida a uma distância onde a imagem preenche 80% do campo de visão. Após a conclusão da visualização, desligue o interruptor. Armazene os tubos selados no escuro, de preferência com refrigeração, se for necessária uma visualização posterior.

Em casos singleplex e multiplex, os produtos RT-LAMP aparecem como uma letra de concatemers quando executados em gel de agarose. As amostras de controle negativo contendo água como amostra forneceram apenas as bandas para os próprios primers, incluindo o controle alvo inespecífico, onde o ácido nucléico total extraído de um mosquito fêmea não infectado foi usado como modelo. A fluorescência verde é observada para o zika usando sondas como cinco NT primos marcados com FAM.

A fluorescência verde claro amarelo é atribuída a Chikungunya, onde a sonda é cinco NT primos marcados com HEX. Uma fluorescência vermelho-alaranjada é usada para Dengue-1, onde sua sonda é cinco NT primos marcados com TAMRA. Dois papéis contendo mosquitos foram submersos diretamente na mistura RT-LAMP e, após incubação a 65 graus Celsius por 30 minutos, foi observada fluorescência verde brilhante na presença do vírus Zika.

Usando nove volumes de tampão de reidratação e um volume de amostra de urina, a fluorescência verde visível pode ser gerada em 30 minutos e a imagem pode ser capturada por qualquer câmera de celular. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do diagnóstico clínico explorarem plataformas de ponto de atendimento para detectar vírus transmitidos por mosquitos na urina, sangue, saliva ou carcaças de mosquitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar um sistema de amplificação isotérmica, neste caso a lâmpada, para detectar Zika e outros arbovírus de forma multiplex em uma variedade de amostras biológicas.