Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

O objetivo geral desta técnica é identificar eletrofisiologicamente as conexões monossinápticas em drosófilas usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina. As principais vantagens dessa técnica é que ela é direta e pode revelar a natureza química das sinapses. Também é adequado para o estudo de volume ou transmissão em massa.

Geralmente, em vídeos novos para este método, lutamos por causa da dificuldade da dissecação. Simplesmente entendendo o método, no entanto, a lógica é facilmente transferível para outros sistemas modelo, como mouses. Para as gravações, tenha pipetas de remendo para a resistência perto de sete megaohms.

Além disso, ter solução salina de gravação externa com pH de 7,3 ou menos aerada continuamente com carbogênio contendo 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Para os sujeitos, tenha um estoque de mosca expressando csChrimson, propagando-se em alimentos contendo 0,2 milimolar de todo trans-retiniano. Para as gravações, selecione adultos de um a três dias de idade.

Carregue-os em um frasco de cintilação de vidro e imobilize-o usando um minuto de exposição a condições geladas. Em seguida, abaixe o nível de luz no escopo de dissecação e na pinça grossa para carregar uma mosca anestesiada na câmara de gravação personalizada. Prenda a mosca na câmara cercando com cera ou epóxi curável por UV.

Posicione-o com o lado dorsal para cima com a folha aproximadamente na metade do tórax. A chave para obter uma ótima preparação é fazer com que o orifício seja cortado na folha para ter o tamanho certo, para que a mosca não seja espremida nem possa cair. Ilumine a preparação com luzes de fibra óptica de ambos os lados e mantenha-as o mais escuras possível.

Em seguida, cubra a preparação com quatro a seis gotas de solução salina de registro. Em seguida, afie o fio ou filamento de tungstênio para a dissecação. Aplique cerca de 20 volts de corrente CA a uma solução saturada de nitrato de potássio e mergulhe repetidamente a ponta do fio muito rapidamente na solução.

Após 20 mergulhos, a ponta ficará afiada. Agora, ajuste as luzes para fornecer visibilidade suficiente para usar o fio afiado para expor o cérebro, removendo a cutícula, seguida pela traqueia e corpos gordurosos. Para acessar os lóbulos antenais, use um fio de tungstênio dobrado para dobrar suavemente a antena sob a blindagem de alumínio.

Em seguida, use uma pinça afiada para arrancar suavemente o revestimento glial que cobre a área de interesse. Agora transfira a preparação para o equipamento de eletrofisiologia para fazer gravações. Na plataforma, comece imediatamente a perfundir a preparação com solução salina de gravação, borbulhada com carbogênio.

Use um reservatório de solução salina alimentado por gravidade colocado acima do microscópio stage. Para coletar a solução salina residual, use uma linha de vácuo e um balão de 2 litros. Em seguida, carregue a pipeta de patch com 4 microlitros de solução de registro interna e conecte a pipeta a um micromanipulador.

Em seguida, zere o deslocamento do amplificador e defina o amplificador para fornecer pulsos de teste. Em seguida, ajuste a iluminação oblíqua IR para obter uma visão clara do cérebro. Agora, enquanto aplica pressão positiva à pipeta, aproxime-se da célula com a pipeta.

Quando o contato com a célula for feito, libere a pressão positiva para selar a pipeta na membrana. Em seguida, defina o potencial de retenção da membrana para menos 60 milivolts. E a pipeta deve formar uma vedação de gigaohm com a membrana celular.

A corrente de retenção deve cair para um nível baixo de sub-picoamperes. Para obter vedações constantes de gigaohm, certifique-se de manter sua pipeta limpa, mantendo pressão positiva e evitando bater no tecido ou se aproximar de suas células. Para continuar, configure o amplificador para fornecer pulsos de teste de menos 50 a menos 60 milivolts.

Os pulsos de teste revelarão um grande transiente capacitativo representando a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Para remover a transitoriedade capacitativa, ajuste os botões de compensação de capacidade no amplificador. Agora, aplique breves pulsos de pressão negativa para romper a membrana celular e obter toda a configuração celular.

Um grande aumento na transitoriedade capacitativa indica sucesso. Um pequeno aumento na corrente de retenção também deve ser observado. Em seguida, defina o amplificador para corrente clamp modo.

E ajuste o potencial da célula entre menos 50 e menos 60 milivolts. Na preparação, configure o sistema de aquisição de dados conforme indicado no protocolo do técnico. O sistema requer um LED vermelho de alta potência posicionado abaixo da preparação, posicionado para iluminar a mosca a 0,238 miliwatts por milímetro quadrado.

Agora, ative os neurônios pré-sinápticos optogeneticamente, usando luz vermelha pulsada na expressão de csChrimson. Outros métodos também podem ser usados. Antes de aplicar a tetrodotoxina, uma conexão sináptica deve ser visível em resposta a um pulso de luz de 40 milissegundos.

Nenhuma resposta significa que uma conexão é improvável. O potencial de retenção pode ser ajustado para enfatizar as conexões excitatórias ou inibitórias, de acordo. Uma vez verificada a conexão, configure a profusão salina para recirculação na solução salina.

Ajuste a bomba para que o nível de solução salina no banho permaneça estável. Em seguida, adicione tetrodotoxina suficiente ao sistema para uma concentração final de um micromolar. Isso deve interromper a atividade de pico do neurônio corrigido.

Caso contrário, adicione mais tetrodotoxina ao sistema. Agora, aplique breves pulsos de luz vermelha para ativar o que provavelmente é uma conexão monossináptica. Em seguida, prossiga com a adição de antagonistas farmacológicos à solução salina de recirculação para testar a natureza química das conexões sinápticas.

A expressão transgênica da tetrodotoxina no notchback sensível do canal de sódio resgata a excitabilidade nos neurônios e resulta em um grande potencial de platô. Os interneurônios no lobo antenal respondem a odores. No entanto, as correntes pós-sinápticas excitatórias não são facilmente resolvidas no soma.

Então, as respostas surgem diretamente da entrada do neurônio do receptor olfativo? O uso de tERPs revela que os neurônios receptores olfativos fazem conexões diretas com os interneurônios locais. A estimulação dos neurônios serotoninérgicos no lobo antenal resulta em uma mistura de excitação e inibição em interneurônios locais.

A aplicação de metisergida, um amplo antagonista do receptor 5HT, bloqueou uma hiperpolarização lenta, mas não teve efeito sobre a despolarização, enquanto a mecamilamina bloqueia a despolarização rápida. Isso sugere que a estimulação é colinérgica. Os tERPs foram usados para resolver a transmissão de volume extra-sináptico que ocorre com GABA ou neuromoduladores.

Em um exemplo, a aplicação de tetrodotoxina não suprimiu um sinal inibitório no interneurônio local. Essa inibição foi bloqueada usando o antagonista da serotonina, metisergida, sugerindo um sinal direto de um neurônio serotoninérgico específico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter gravações de células inteiras de neurônios drosófilos e avaliar sua condutividade usando tERPs.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente e praticar a difícil dissecção repetidamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como farmacologia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a natureza da sinapse química.

Não se esqueça de que trabalhar com tetrodotoxina pode ser extremamente perigoso e devem ser sempre tomadas precauções, como usar luvas e trabalhar com pequenos volumes, durante a realização desses procedimentos.