Name: Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprenda a identificar conexões monossinápticas em neurônios de Drosophila usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina. Este método combina eletrofisiologia de patch-clamp com estimulação optogenética para revelar a natureza química das sinapses.

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Gostaríamos de agradecer Joshua Singer, Jonathan Schenk, bem como os revisores pensativos para comentários sobre o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Ben White e Harold Zakon para discussões sobre a técnica. Jonathan Schenk forneceu os dados para a Figura 3A. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação Whitehall e um R21 NIH ao QG.

1. prepare a moscas e GAL4 identificar linhas de promotor
<ol><li>Selecione uma linha de promotor GAL4 e cruzá-la com moscas carregando tanto o transgene UAS-NaChBac e um optogenetic transgene para ativação. Nota: UAS-CsChrimson11 é selecionado devido a sua alta condutância e a facilidade com a qual ele ativa de potenciais de ação mediada por NaChBac. Tanto UAS-NaChBac e CsChrimson-UAS estão disponíveis no repositório de estoques de Bloomington.</li>
	<li>Prepare-se como uma solução em etanol (35mm) all-trans retinal e armazenar a solução em congelador a-20 ° C.</li>
	<li>Mix 28 µ l desta unidade populacional em cerca de 5 mL de batata rehidratada flake comida e adicione esta mistura na parte superior de um frasco de meio de Drosophila convencional.</li>
	<li>Levante o adultas moscas expressando csChrimson em alimentos contendo 0,2 mM todo-trans-retinal para 1 a 3 dias,11.</li>
</ol>2. prepare o estoque TTX
<ol><li>Crie uma solução stock de 1mm TTX em água destilada ou desionizada. Guarde esta solução em um frigorífico de laboratório durante vários meses. Verificar as instituições políticas a respeito do armazenamento de TTX como muitas instituições classificam TTX como uma substância perigosa ou controlada.</li>
</ol>3. prepare moscas para eletrofisiologia
<ol><li>Colete 1 – 3 dias velho adulto voa que são gerados na comida com all-trans-retinal. Nota: Consulte Murthy e Turner em 2013 para uma descrição detalhada do patch aperto Drosophila neurônios12,13.</li>
	<li>Coloque as moscas em um frasco de cintilação. Coloque o frasco em gelo por 1 min imobilizar as moscas.</li>
	<li>Use pinça grossa para inserir uma mosca em uma câmara de gravação sob medida. A câmara consiste de um 3 ½" círculo cortado a laser de acrílico 1/16". Corte um buraco ¾" é para o centro onde uma folha personalizada é fixada com cola epoxy de 2 partes. A folha contém um triangular em forma de esperança que a mosca é inserida.</li>
	<li>Aplica cera ou UV curável epóxi em torno do animal para fixá-lo firmemente dentro da câmara de gravação.</li>
	<li>Ilumine a preparação com um pescoço de cisne de fibra ótica para visualização sob um estereomicroscópio. Defina as fibras de pescoço de cisne para iluminação oblíqua, ajustando-os para que eles iluminam a voar directamente do lado.</li>
	<li>Ajuste o nível de luz a mais baixa possível que ainda permite a visualização clara de uma mosca. Esta intensidade de luz irá variar através de experiências individuais. Nota: Este protocolo pode ser adaptado usando um em situ cérebro explant método14.</li>
	<li>Recupere a solução salina de gravação externa. O soro contém em mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfônico, 8 trealose, glicose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2e 4 de MgCl2 (ajustada para mΩ 270-275). A solução salina é alternassem com 95% O25% CO2 (carbogênio) e tem um pH ajustado a 7.315.</li>
	<li>Coloque 4 a 6 gotas de solução salina de gravação extracelular sobre a preparação de voar. Neste ponto, aumente o nível de luz para o microscópio de dissecação para melhor visibilidade.</li>
	<li>Afie um fio de tungstênio usando eletrólise. Para fazer o fio, preparar uma solução saturada de KNO3 e aplique aproximadamente 20 V de AC corrente enquanto mergulhando a ponta do fio na solução de 20 vezes para 100 ms cada, até que a ponta é afiada. Use o fio de tungstênio afiada para remover a cutícula na cabeça de mosca e, portanto, expondo o cérebro.</li>
	<li>Ainda mais expor o cérebro removendo a traqueia e os corpos de gordura que o rodeiam. Se acessando os lóbulos da antena, use um fio de tungstênio tortos ou ferramenta semelhante aconchegar-se suavemente antenas debaixo da folha câmara para aumentar a visibilidade de gravação. Use o fórceps afiado a rasgar o invólucro glia cobrindo a área de interesse, onde as gravações serão feitas suavemente.</li>
	<li>Transferi a câmara de gravação para o equipamento de eletrofisiologia. Imediatamente iniciar perfusão com solução salina de gravação externa borbulhava com carbogênio para preservar o cérebro. O reservatório de solução salina é colocado acima do palco do microscópio e gravidade-alimentado à preparação. Use uma linha de vácuo e um frasco de Erlenmeyer de 2L para recolher a resíduos salina.</li>
</ol>4. obter gravação de células inteiras
<ol><li>Puxe um extrator comercial pipeta pipetas de remendo. Consulte o manual de configurações alcançar uma pipeta apropriada com uma resistência de ponta perto de 7 mΩ.</li>
	<li>Adicione 4 µ l da solução de gravação interna para uma pipeta de remendo. O soro fisiológico interno consiste de aspartato de potássio 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl em mM.</li>
	<li>Configure o amplificador de braçadeira do remendo para gravação de células inteiras. Zero offsets do amplificador e definir o amplificador para fornecer pulsos de teste. Aqui, um amplificador de braçadeira de Patch de sistemas AM 2.400 é usado.</li>
	<li>Aplicar pressão positiva através da pipeta e abordagem da célula. Use um micromanipulador para direcionar a pipeta e entre em contato com a célula. Liberar a pressão positiva. Conjunto o potencial de exploração da membrana de -60 mV. A pipeta deve formar um gigaohm selo com a membrana da célula, como evidenciado por um sub-picoamp baixo segurando atual. Nota: Se usar GFP guiado a célula alvo, tente minimizar o uso de luz epifluorescente para impedir ativação ChR2 e potencial depressão sináptica. Também aguarde alguns minutos antes de aplicar o passo 5.</li>
	<li>Definir o amplificador para entregar o teste pulsos de -50 mV a -60 mV. Essa configuração é padrão nos amplificadores da remendo-braçadeira. Pulsos de teste irão revelar um grande transiente capacitiva que representa a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Remova capacitiva transientes ajustando os botões de compensação de capacidade na AM 2400 ou amplificador semelhante.</li>
	<li>Aplica breves pulsos de pressão negativa para a ruptura da membrana celular e obter configuração de células inteiras. Nota: Uma configuração de celular é observada quando há um grande aumento da capacitiva transientes mostrando a capacitância do neurônio. Um pequeno aumento na exploração atual (linha de base) provavelmente será também observado. Definir o amplificador para o atual modo de grampo e ajustar o potencial da célula de -50 a -60 mV.</li>
</ol>5. testar a conectividade sináptica
<ol><li>Configure o sistema de aquisição (DAQ) dados para acionar um driver de LED para gerar pulsos de luz. Aqui, um sistema DAQ de instrumentos nacionais é usado com Matlab para entregar um sinal analógico para um driver de LED. A intensidade do LED é ajustada através do sinal analógico para o motorista. O LED é um comprimento de onda 620-630 nm LED.</li>
	<li>Posicione o alta potência LED vermelho diretamente debaixo de preparação. Ajuste a intensidade da luz para que 0.238 mW/mm2 atinge a mosca.</li>
	<li>Ative os neurônios pré-sináptica durante a gravação da célula pós-sináptica de interesse. Atingir a célula ativação optogenetically, pharmacogentically, ou através da estimulação do nervo. Aqui, breves pulsos de luz vermelha e csChrimson são aplicados. Nota: Conexões sinápticas podem ser monitoradas em braçadeira atual como EPSPs ou grampo de tensão como EPSCs. Uma conexão sináptica deve ser visível antes de aplicar a TTX em resposta a um pulso de luz de 40 ms. Se nenhuma conexão é observado, é improvável que os neurônios estão synaptically ligados ou mono - ou polysynaptically. A potencial de exploração pode ser ajustada para enfatizar conexões excitatórias ou inibitórias em conformidade.</li>
	<li>Se uma conexão é observado em solução salina normal, adicionar TTX no sistema de perfusão para obter uma concentração final de 1 µM. usar uma bomba de recirculação para capturar e reutilizar o soro fisiológico para conservar TTX. A bomba peristáltica irá desenhar a solução salina do banho e devolvê-lo para o reservatório de solução salino.</li>
	<li>Ajuste a velocidade da bomba para fornecer um forte vácuo constante que não permite esse nível salino no banho para subir e descer. Nota: A aplicação da TTX deve resultar na cessação da actividade no neurônio que está sendo monitorado em células inteiras de cravação. Isto confirma que suficiente TTX foi adicionado para o soro.</li>
	<li>Aplica breves pulsos de luz vermelha (40 ms para cada pulso) novamente. Neste ponto, qualquer conexão sináptica que permanece é provável monosynaptic. Adicione antagonistas farmacológicas para testar a natureza química das ligações sinápticas que permanecem em TTX, solução salina a recirculação. Nota: Quando a combinação de optogenetics e direcionamento fluorescente de neurônios, pode ser importante para não ativar persistentemente a população pré-sináptica dos neurônios ao tentar obter uma gravação. Isto pode conduzir à depressão sináptica e torna difícil ver conexões. Porque csChrimson tem uma faixa de excitação longo que se estende amplamente para a gama de proteína verde fluorescente, um fluoróforo vermelho pode ser usado para visualizar os neurônios e channel2rhodopsin (Ch2R) pode ser usado para excitar a populações de células. Fazer isso requer genética específica e um cubo de filtro personalizado. Para gerar moscas adequadas, fazer moscas que expressam o fluoróforo vermelho (RFP ou mCherry) sob os sistemas de expressão binário sistema LexA ou Q. Estas precisará ser cruzados com moscas expressando um promotor Gal4 e UAS-Ch2R e UAS-NaChBac genes efetores. O cubo do filtro ideal para epifluorescência terá uma escala estreita da excitação para excitar o fluoróforo vermelho, mas não excita a Ch2R... Além disso, o conjunto de filtro deve incluir um filtro de emissão de passe longo para coletar tanta luz emitida. Nós usamos um filtro personalizado definido de Chroma que incluía parte números et580/25 x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com um filtro de barreira/emissão de et610lp.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Análise TERPS elogios atuais técnicas usadas para circuito rachando, permitindo a detecção de sinapses entre os neurônios identificados. Especificamente, a abordagem revela conexões monosynaptic por silenciar amplamente os potenciais de ação com TTX enquanto restaura a excitabilidade numa população de neurônios com o canal de sódio TTX diferenciação NaChBac selecione. Liberação sináptica é provocada pela estimulação optogenetic enquanto eventos pós-sinápticos são monitorados com gravações de células inteiras. TERPS disti...

Dos principais objetivos da neurociência é mapear as conexões entre os neurônios para entender como a informação flui através de circuitos. Inúmeros recursos e abordagens tornaram-se disponíveis para testar a conectividade funcional entre os neurônios em uma variedade de sistemas de modelo1,2. Para gerar os diagramas de fiação mais precisos usando eletrofisiologia, é importante resolver se observadas as conexões entre duas células são diretos e monosynaptic versus indireta e polysynaptic. Um padrão de ouro para fazer esta distinção nos neurônios de mamíferos é medir a latência entre action potentials único nas células pré-sináptica e o aparecimento de correntes pós-sináptico excitatórios (EPSCs) no segundo neurônio. Monosynaptic conexões devem ter latências curtas de alguns milissegundos e baixa variabilidade3. Essa abordagem pode ser complicada em neurônios invertebrados porque sinapses podem ocorrer em suas dendrites, longe de ser o local de gravação somática, causando atrasos na deteção devido tempo electrotonic distâncias entre conductances pós-sinápticos e a gravação eletrodo. Esses atrasos podem introduzir ambiguidade poli-contra contribuições monosynaptic. Além disso, pequenos eventos sinápticos podem deteriorar antes de chegar ao local de gravações somática e dirigindo mais forte atividade pré-sináptica, é prováveis que recrutar polysynaptic eventos.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para testar conexões monosynaptic em invertebrados. Uma abordagem utiliza as soluções de alta cátion divalente (Hi-Di) contendo excesso Mg ++ e Ca ++. Esta solução bloqueia conexões polysynaptic por redução de lançamento de probabilidade e limiar de ação potencial crescente para favorecer a deteção de entrada monosynaptic4,5. Determinar a proporção precisa de Mg Ca ++ ++ necessário, no entanto, não é trivial e contribuições polysynaptic podem persistir por estimulação mesmo modesto6. Uma abordagem alternativa, chamada reconstituição GFP entre parceiros sináptica (alcance) aproveita a proximidade entre as membranas pré e pós-sinápticas encontrado em sinapses para inferir uma conexão monosynaptic 7. Aqui, um componente da proteína verde fluorescente (GFP) é expresso em um neurônio, e o fragmento complementar da molécula é expresso em um parceiro pós-sináptica putativo. A presença de fluorescência indica que os dois neurônios estão em proximidade suficiente para permitir a reconstituição da molécula GFP e implica a existência de uma sinapse. ALCANCE pode relatar sinapses falsamente, no entanto, se duas células estreitamente tem Aposto membranas, como em um nervo ou Fascículo. Variantes de alcance eliminam tais falsos positivos por amarrar o fragmento pré-sináptica de GFP diretamente para synaptobrevin da, permitindo assim a reconstituição somente às sinapses ativo8. Enquanto compreensão e suas variantes têm sido fundamentais para determinar a conectividade funcional na drosófila CNS, algumas conexões podem não ser feitas visíveis pelo alcance se as distâncias entre parceiros pré e pós-sinápticas é relativamente grande. Isto é particularmente pertinente na avaliação da transmissão de volume associado a neuromodulação9 ou de inibição GABAérgica10.
Aqui, uma técnica complementar e romance é demonstrada para testar conexões diretas de monosynaptic no CNS da drosófila . Esse método, chamado tetrodotoxina engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS), trabalha pela expressão co da tetrodotoxina (TTX)-canal de sódio resistente, NaChBac e um ativador de optogenetic em uma célula pré-sináptica durante a gravação de putativo parceiros pós-sináptica9. Na presença de TTX, toda a atividade mediada por potencial de ação é suprimida em células diferentes dos expressando NaChBac. O canal NaChBac restaura seletivamente excitabilidade na célula pré-sináptica alvo, permitindo a transmissão sináptica luz-evocada. Este método permite forte ativação dos neurônios pré-sináptica, tal que as conexões podem ser resolvidas pós-sinapticamente pela gravação somática, reduzindo a probabilidade de recrutamento de circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite o estudo da transmissão de volume e revela a propagação do transmissor liberado de um único neurônio ao longo de um circuito. Além disso, TERPS pode revelar a natureza química da conexão através de farmacologia convencional. TERPS é adequado para uso em qualquer modelo de sistema que permite a expressão transgênica da diferenciação de TTX canais de sódio.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Usado como ativador neural</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Excitabilidade dos resotores em células em TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Pode ser necessária permissão especial para comprar TTX, pois é uma substância controlada</td></tr><tr><td>todos os trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Requer co-fator para channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Aço Inoxidável 321 Soldável&nbsp; Folha,&nbsp; 0,002"&nbsp; Grosso,&nbsp; 10"&nbsp; Largo</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Usado para fazer porta-moscas personalizado. A folha personalizada pode ser cortada a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido</td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Usado para dissecação de preparação</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Usado durante a dissecção para fixar a mosca na folha</td></tr><tr><td>Cera de Parafina</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Usado com encerador</td></tr><tr><td>Número 5 fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Usado para dissecação e desmontagem</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>15001-08</td><td>Usado para remover partes da cutícula durante a dissecação</td></tr><tr><td>Fio de tungstênio</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Use com eletrólise para fazer agulhas afiadas para dissecação</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica reciculante</td><td>Simplesmente bombas (Amazon)</td> <td>PM200S</td><td>para recirculação</td></tr><tr><td>Controlador de velocidade TTX para bomba peristáltica</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimming Controller Para Luzes LED ou Fita, 12 Volt 8 Amp,Controlador de Luz de Luz Ajustável DC12V 8A 96W para Led Strip Light B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; Regulador de Ar Comprimido de Precisão</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Para aplicar pressão positiva durante o patching</td></tr><tr><td>Vidro capilaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>Para pipetas de patch</td></tr><tr><td>Medidor Multiuso</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Medidor para regulador de pressão</td></tr><tr><td>Câmera de Eletrofisiologia</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Qualquer câmera que funcione na faixa de infravermelho (850 nm) funcionará. Você não quer usar iluminação vermelha, pois isso pode ativar os LEDs IR da csChrimson</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M850F2</td><td>Para iluminação oblíqua</td></tr><tr><td>fibra óptica para IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Acopla a</td></tr><tr><td>lente objetiva IR LED&nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Isso pode ser usado na maioria dos microscipes e funciona bem para visualizar neurônios de moscas.</td></tr><tr><td>LED âmbar</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>Para visualizar RFP e mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>Para visualizar GFP</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros GFP</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>Para visualizar GFP ou estimular channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros mCherry personalizados</td><td>Chroma</td><td>&nbsp; et580/25x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com uma barreira et610lp/óptica de emissão</td><td>Use apenas se desejar corrigir neurônios identificados com channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic para combinar Thorlabs de LED âmbar e azul</td><td></td><td>DMLP550R</td><td>Use apenas patch sob mCherry e excite channel2rhodopsin com luz azul.</td></tr><tr><td>LED LED vermelhoFornecido</td><td></td> por <td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Usado para acionar o driver de LED csChrimson</td></tr><tr><td></td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Usado para acionar LEDs para estimulação optogenética</td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Usado para posicionar a pipeta durante as gravações</td></tr><tr><td>Amplificador Patchclamp A-M</td><td>Systems</td><td>Modelo 2400</td><td>Um amplificador equivalente é adequado</td></tr><tr><td>Filtro Bessel</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Filtro auxiliar usado para filtrar o traço de corrente para o osciloscópio durante o patching.</td></tr><tr><td>Sistema de Aquisição de Dados&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>Usado para gravar dados do amplificador para o computador Bloco de</td></tr><tr><td>conectores - Terminal BNC BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Usado para conectar o amplificador ao cartão DAQ.</td></tr><tr><td>Folha de aço&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Folha de aço para câmara de gravação personalizada</td></tr><tr><td>Ímãs</td><td>K & J Magnetics</td><td>D42</td><td>Para fixar a câmara de gravação ao suporte de anel</td></tr><tr><td>1/16" Célula Cast Acrílico Transparente</td><td>Pololu</td><td></td><td>Usado para fazer câmara de gravação personalizada. O acrílico pode ser cortado a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido</td></tr></tbody></table>

examinando monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Aqui, uma nova técnica denominada Tetrotoxin (TTX) Engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS) é aplicada para testar monosynaptic conexões entre os neurônios do alvo. O método baseia-se na expressão co de um ativador de transgênico com o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac, em um neurônio específico pré-sináptica. Conexões com parceiros pós-sináptica putativos são determinadas por gravações de células inteiras na presença de TTX, que bloqueia a atividade elétrica de neurônios que expressam não NaChBac. Esta abordagem pode ser modificada para funcionar com qualquer ativador ou imagem latente de cálcio como um repórter de conexões. TERPS adiciona o crescente conjunto de ferramentas disponíveis para determinar a conectividade em redes. No entanto, TERPS é o único que relata também confiantemente em massa ou volume transmissão e transmissão de repercussões.

TERPS é usado para distinguir entre mono e polysynaptic contribuições em conexões sinápticas entre os neurônios. Enquanto fraca estimulação de uma célula pode ser usada para testar conexões diretas, dirigindo a maior atividade pré-sináptica frequentemente recruta polysynaptic conexões (figura 1A). TERPS funciona co, expressando o diferenciação de TTX canal de sódio NaChBac e um ativador de optogenetic e testes de conexões na presença de TTX para eliminar liga...

Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.

Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

O objetivo geral desta técnica é identificar eletrofisiologicamente as conexões monossinápticas em drosófilas usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina. As principais vantagens dessa técnica é que ela é direta e pode revelar a natureza química das sinapses. Também é adequado para o estudo de volume ou transmissão em massa.Geralmente, em vídeos novos para este método, lutamos por causa da dificuldade da dissecação. Simplesmente entendendo o método, no entanto, a lógica é facilmente transferível para outros sistemas modelo, como mouses. Para as gravações, tenha pipetas de remendo para a resistência perto de sete megaohms.Além disso, ter solução salina de gravação externa com pH de 7,3 ou menos aerada continuamente com carbogênio contendo 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Para os sujeitos, tenha um estoque de mosca expressando csChrimson, propagando-se em alimentos contendo 0,2 milimolar de todo trans-retiniano. Para as gravações, selecione adultos de um a três dias de idade.Carregue-os em um frasco de cintilação de vidro e imobilize-o usando um minuto de exposição a condições geladas. Em seguida, abaixe o nível de luz no escopo de dissecação e na pinça grossa para carregar uma mosca anestesiada na câmara de gravação personalizada. Prenda a mosca na câmara cercando com cera ou epóxi curável por UV.Posicione-o com o lado dorsal para cima com a folha aproximadamente na metade do tórax. A chave para obter uma ótima preparação é fazer com que o orifício seja cortado na folha para ter o tamanho certo, para que a mosca não seja espremida nem possa cair. Ilumine a preparação com luzes de fibra óptica de ambos os lados e mantenha-as o mais escuras possível.Em seguida, cubra a preparação com quatro a seis gotas de solução salina de registro. Em seguida, afie o fio ou filamento de tungstênio para a dissecação. Aplique cerca de 20 volts de corrente CA a uma solução saturada de nitrato de potássio e mergulhe repetidamente a ponta do fio muito rapidamente na solução.Após 20 mergulhos, a ponta ficará afiada. Agora, ajuste as luzes para fornecer visibilidade suficiente para usar o fio afiado para expor o cérebro, removendo a cutícula, seguida pela traqueia e corpos gordurosos. Para acessar os lóbulos antenais, use um fio de tungstênio dobrado para dobrar suavemente a antena sob a blindagem de alumínio.Em seguida, use uma pinça afiada para arrancar suavemente o revestimento glial que cobre a área de interesse. Agora transfira a preparação para o equipamento de eletrofisiologia para fazer gravações. Na plataforma, comece imediatamente a perfundir a preparação com solução salina de gravação, borbulhada com carbogênio.Use um reservatório de solução salina alimentado por gravidade colocado acima do microscópio stage. Para coletar a solução salina residual, use uma linha de vácuo e um balão de 2 litros. Em seguida, carregue a pipeta de patch com 4 microlitros de solução de registro interna e conecte a pipeta a um micromanipulador.Em seguida, zere o deslocamento do amplificador e defina o amplificador para fornecer pulsos de teste. Em seguida, ajuste a iluminação oblíqua IR para obter uma visão clara do cérebro. Agora, enquanto aplica pressão positiva à pipeta, aproxime-se da célula com a pipeta.Quando o contato com a célula for feito, libere a pressão positiva para selar a pipeta na membrana. Em seguida, defina o potencial de retenção da membrana para menos 60 milivolts. E a pipeta deve formar uma vedação de gigaohm com a membrana celular.A corrente de retenção deve cair para um nível baixo de sub-picoamperes. Para obter vedações constantes de gigaohm, certifique-se de manter sua pipeta limpa, mantendo pressão positiva e evitando bater no tecido ou se aproximar de suas células. Para continuar, configure o amplificador para fornecer pulsos de teste de menos 50 a menos 60 milivolts.Os pulsos de teste revelarão um grande transiente capacitativo representando a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Para remover a transitoriedade capacitativa, ajuste os botões de compensação de capacidade no amplificador. Agora, aplique breves pulsos de pressão negativa para romper a membrana celular e obter toda a configuração celular.Um grande aumento na transitoriedade capacitativa indica sucesso. Um pequeno aumento na corrente de retenção também deve ser observado. Em seguida, defina o amplificador para corrente clamp modo.E ajuste o potencial da célula entre menos 50 e menos 60 milivolts. Na preparação, configure o sistema de aquisição de dados conforme indicado no protocolo do técnico. O sistema requer um LED vermelho de alta potência posicionado abaixo da preparação, posicionado para iluminar a mosca a 0,238 miliwatts por milímetro quadrado.Agora, ative os neurônios pré-sinápticos optogeneticamente, usando luz vermelha pulsada na expressão de csChrimson. Outros métodos também podem ser usados. Antes de aplicar a tetrodotoxina, uma conexão sináptica deve ser visível em resposta a um pulso de luz de 40 milissegundos.Nenhuma resposta significa que uma conexão é improvável. O potencial de retenção pode ser ajustado para enfatizar as conexões excitatórias ou inibitórias, de acordo. Uma vez verificada a conexão, configure a profusão salina para recirculação na solução salina.Ajuste a bomba para que o nível de solução salina no banho permaneça estável. Em seguida, adicione tetrodotoxina suficiente ao sistema para uma concentração final de um micromolar. Isso deve interromper a atividade de pico do neurônio corrigido.Caso contrário, adicione mais tetrodotoxina ao sistema. Agora, aplique breves pulsos de luz vermelha para ativar o que provavelmente é uma conexão monossináptica. Em seguida, prossiga com a adição de antagonistas farmacológicos à solução salina de recirculação para testar a natureza química das conexões sinápticas.A expressão transgênica da tetrodotoxina no notchback sensível do canal de sódio resgata a excitabilidade nos neurônios e resulta em um grande potencial de platô. Os interneurônios no lobo antenal respondem a odores. No entanto, as correntes pós-sinápticas excitatórias não são facilmente resolvidas no soma.Então, as respostas surgem diretamente da entrada do neurônio do receptor olfativo? O uso de tERPs revela que os neurônios receptores olfativos fazem conexões diretas com os interneurônios locais. A estimulação dos neurônios serotoninérgicos no lobo antenal resulta em uma mistura de excitação e inibição em interneurônios locais.A aplicação de metisergida, um amplo antagonista do receptor 5HT, bloqueou uma hiperpolarização lenta, mas não teve efeito sobre a despolarização, enquanto a mecamilamina bloqueia a despolarização rápida. Isso sugere que a estimulação é colinérgica. Os tERPs foram usados para resolver a transmissão de volume extra-sináptico que ocorre com GABA ou neuromoduladores.Em um exemplo, a aplicação de tetrodotoxina não suprimiu um sinal inibitório no interneurônio local. Essa inibição foi bloqueada usando o antagonista da serotonina, metisergida, sugerindo um sinal direto de um neurônio serotoninérgico específico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter gravações de células inteiras de neurônios drosófilos e avaliar sua condutividade usando tERPs.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser paciente e praticar a difícil dissecção repetidamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como farmacologia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a natureza da sinapse química.Não se esqueça de que trabalhar com tetrodotoxina pode ser extremamente perigoso e devem ser sempre tomadas precauções, como usar luvas e trabalhar com pequenos volumes, durante a realização desses procedimentos.

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

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Channelrhodopsin2 Estimulação Mediated de Potenciais Synaptic em Drosophila Junções Neuromusculares

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Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

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Testando conexões monossinápticas usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina e à tetrodotoxina

Este vídeo demonstra a técnica para registrar correntes sinápticas de um botão sináptico na junção neuromuscular da larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único botão sináptico, o que é importante para o estudo de linhas de mosca mutantes com atividade sináptica espontânea ou assíncrona aumentada.

Registrando correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila

Aqui, descrevemos um método simples e amplamente acessível para ferir nervos segmentares em larvas de Drosophila para visualizar e quantificar neurodegeneração de neurônios motores na junção neuromuscular (NMJ) de larvas de terceiro estádio.

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Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

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Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Este protocolo avalia a atividade sináptica funcional entre parceiros neuronais definidos in vivo no sistema nervoso central das larvas de Drosophila melanogaster , utilizando ferramentas geneticamente codificadas. Estimulação optogenética mediada por CsChrimson de neurônios sensoriais cIVda pré-sinápticos induz fotoconversão dependente de cálcio do CaMPARI em interneurônios pós-sinápticos da Bacia-4.

Caracterização funcional de parceiros pré e pós-sinápticos individuais no sistema nervoso central larvar de Drosophila usando CaMPARI

Aprenda a identificar conexões monossinápticas em neurônios de Drosophila usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina. Este método combina eletrofisiologia de patch-clamp com estimulação optogenética para revelar a natureza química das sinapses.

Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

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