Name: Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a medir a síntese de RNA usando marcação com bromouridina e imunoprecipitação em culturas celulares. Este método permite quantificar alterações na síntese de RNA e investigar dinâmicas do metabolismo de RNA.

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A Fundação Lundbeck, Universidade de Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s com suporte a este trabalho.

Nota: Executar todas as etapas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário e manter buffers no gelo ou na geladeira (exceto a partir da eluição de buffer contendo SDS). O protocolo é dividido em 5 seções: amostras de preparação do RNA; preparação dos grânulos para IP; ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos; eluição e purificação do RNA acoplado com rótulo BrU, pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos; análise do RNA (no exemplo usando RT-qPCR)
1. preparação de amostras do RNA
<ol><li>HEK293T contagem de células usando uma célula automatizada counter e sementes 3.500.000 células em um prato de petri de 10 cm em meios de crescimento de 10 mL (meio modificado águia de Dulbecco suplementada com 10% de soro fetal bezerro e 50 µ g/mL penicilina/estreptomicina) para obter um total de > 40 µ g de RNA Após 48 h extração mais tarde. Manter as células em 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>48 h após a semeadura, Aspire o meio de crescimento de 8 mL e deixar 2 mL para trás para evitar que sequem as células. Adicionar 2 mM BrU e qualquer tratamento para os 8 mL aspirado meios de crescimento e remover o resíduo 2 mL das células antes de reaplicar o 8ml BrU contendo meio de crescimento. Evite o uso de mídia fresco a pedido do BrU às células, pois isto pode induzir alterações na expressão gênica.</li>
	<li>Incube as celulas por 1h com BrU e tratamento. Lavar as células no buffer do Hank 5ml e trypsinize as células usando a tripsina 0,05% de 2 mL. Adicione mídia de crescimento de 8 mL para parar a reação, transfira as células para um tubo de 15 mL e spin para baixo as células por 2 min a x 1.000 g.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e extrair o centrifugado usando um isolamento de RNA RNA total kit (veja a Tabela de materiais) ou qualquer outro método preferencial e eluir em livre de RNase H2O. loja o RNA a-80 ° C até que esteja pronto para prosseguir.</li>
</ol>2. preparação dos grânulos para IP
<ol><li>Prepare-se para o número de amostras a ser investigado mais um extra para contabilizar a perda durante a pipetagem e girar a mistura grânulos em lotes. Resuspenda grânulos magnéticos do IgG anti-rato completamente através da mistura de turbilhão e tirar 20 grânulos µ l por amostra em um tubo de 1,5 mL RNase-livre. O tubo de 1,5 mL em um carrinho magnético e deixar aproximadamente 20 s para os grânulos de lugar para recolher no lado.</li>
	<li>Remover o sobrenadante, retire o tubo do suporte magnético e Resuspenda em buffer de BrU-IP 400 µ l 1 x pipetando. Girar o tubo muito brevemente para 2 s em uma centrífuga de mesa, colocá-lo de volta no suporte magnético e remover o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem uma vez.</li>
	<li>Vinculação inespecífica de bloco para as contas usando heparina. Resuspenda as contas em 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL de tampão heparina e deixe o rotacionando para lavagem de 30 min. as contas de uma vez, como no passo 2.2. Nota: A heparina é um polímero carregado negativamente, que irá competir com RNAs para vinculação. tRNA ou outros RNAs irrelevantes também podem ser usados se o aplicativo a jusante não é sequenciamento.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 1 mL 1 x buffer de BrU-IP e adicionar 1,25 µ g/amostra anticorpo anti-α-Bromodeoxyuridine, que também reconhece o BrU. Incubar os grânulos por 1h rodando, ou durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os grânulos três vezes, como no passo 2.2. Resuspend os grânulos no buffer de BrU-IP 50 µ l da amostra/1X suplementado com 1 mM BrU e deixar rotação por 30 min diminuir a sensibilidade do anticorpo ligado aos talões e por este meio o risco de ligação inespecífica durante o IP.</li>
	<li>Lave os grânulos três vezes como na etapa 2.2 e ressuspender em buffer de 50 µ l da amostra/1xBrU-IP.</li>
</ol>3. ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos
<ol><li>Medida de concentrações de RNA nos extratos do RNA da etapa 1.3 utilizando espectrofotometria ultravioleta-visível e diluir a 40 µ g/ml RNA de cada amostra livre de RNase H2O para um volume total de 200 µ l.</li>
	<li>Calor de amostras do RNA por 2 min a 80 ° C para desnaturar o RNA e spin brevemente em uma centrífuga do tabletop. Adicione 200 µ l 2 x inibidor de RNAse/BrU-IP + BSA.</li>
	<li>Adicione 50 µ l resuspended e preparado grânulos da etapa 2.6 para cada amostra e deixar a rotação lavagem de 1 h. os grânulos quatro vezes como no passo 2.2.</li>
</ol>4. eluição e purificação de RNA pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos
<ol><li>
Eluir RNA e realizar a extração do fenol
	<ol>
<li>Resuspend os grânulos no tampão de eluição 200 µ l para Eluir o RNA e rapidamente posteriormente adicionar 200 fenol µ l, pH 6,6 (cuidado: tóxica, ver nota abaixo passo 4.1.2) para remover todas as moléculas de RNA não-da amostra.</li>
		<li>Giro mix a amostra e rotação 3 min a 25.000 x g em uma centrífuga do tabletop. Nota: O fenol é tóxico e deve ser tratada em uma coifa usando a proteção da pele. O pH ligeiramente ácido garante que apenas RNA e não o DNA, é extraído. O RNA permanecerá na fase aquosa superior devido à natureza hidrofílica das acusações. Os núcleos hidrofóbicos das proteínas irão Vincular de fenol e mover-se para a fase orgânica fenol inferior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar a extração do fenol-clorofórmio
	<ol>
<li>Aspirar o máximo superior-fase quanto possível (aproximadamente 190 µ l de 200 µ l, dependendo da experiência na manipulação) e movê-lo para um tubo com 200 µ l fenol/clorofórmio, pH 6,6 (cuidado: tóxica, ver nota). Certifique-se de aspirar a mesma quantidade através de amostras.</li>
		<li>Giro misturar a amostra e rotação por 3 min a 25.000 x g. Nota: Clorofórmio é tóxico e deve ser tratado em uma coifa usando a proteção da pele. Clorofórmio é adicionado para remover o fenol, que pode afetar a análise a jusante do RNA inibindo a transcrição reversa14 e polymerase de reacções em cadeia15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar a extração de clorofórmio aspirando a fase aquosa superior como antes (agora aproximadamente 180 µ l) e transferir para um tubo contendo 200 clorofórmio µ l. Redemoinho misturar a amostra e girar 3 min a 25.000 x g.</li>
	<li>Aspire a fase aquosa superior como antes (agora aproximadamente 170 µ l) e transferir para um tubo contendo 17 µ l (volume de 1/10) M 3 CH3COONa, pH 6.0. Para neutralizar e precipitar o RNA a partir da solução aquosa, adicione 2 µ l o glicogénio (20 mg/mL), que precipita juntamente com RNA e torna mais visível, a pelota do RNA.</li>
	<li>Adicione etanol a 96% 500 µ l para aumentar a ligação entre os íons de sal e RNA e misture por inversão do tubo algumas vezes. Deixe o tubo durante a noite a-20 ° C ou 15 min no gelo seco.</li>
	<li>Girar a amostra a 25.000 x g, 4 ° C por 30 min. Discard sobrenadante sem perturbar o sedimento e lave o pellet em 185 µ l 75% de etanol para remover qualquer sal residual. Girar a 25.000 x g, 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento e deixar a pelota para secar 5-10 min com uma tampa aberta. Resuspenda em 10 µ l livre de RNase H2O aplicado na lateral do tubo para evitar perturbar a pelota.</li>
</ol>5. análise do RNA
<ol><li>Preparar o cDNA usando uma transcrição reversa do cDNA kit (veja a Tabela de materiais) ou qualquer outro preferido método usando 2 µ l da amostra do RNA e RNA total de 1 µ g fermento como portador do RNA para a reação de síntese de cDNA (não é usada se o cDNA é usado para sequenciamento de próxima geração). Use 1 µ g RNA sem fermento do RNA para a preparação de cDNA de entrada correspondente.</li>
	<li>CDNA diluído 01:25 e mistura 9 µ l diluída cDNA com 10 µ l de qPCR mestre mistura e 1 µ l da sonda fluorogenic, ambos especificados na Tabela de materiais. Nota: A diluição do cDNA depende da preparação do cDNA e qPCR método usado.</li>
	<li>Execute o seguinte programa de qPCR (por exemplo, em um sistema rápido de real-time PCR 7500 ou equivalente): 2 min a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 ciclos de 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
<li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+%CE%B1-synuclein+genomic+multiplications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li>
<li>Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+alpha-synuclein+with+a+microRNA-embedded+silencing+vector+in+the+rat+substantia+nigra%3A+Positive+and+negative+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects.</a> Brain Res. , 47-60 (2014).</li>
<li>Cooper, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+exosomal+siRNA+delivery+reduced+alpha-synuclein+aggregates+in+brains+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mov.+Disord%22%5BJournal%5D)">Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice.</a> Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li>
<li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li>
<li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li>
<li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose%3F+How+to+evaluate+its+activity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-2253-6_19">Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology</a>. 1262, 305-320 (2015).</li>
<li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Alkynyl-2%27-deoxyuridines%3A+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li>
<li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li>
<li>Dölken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li>
<li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
<li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve o uso de BrU-IP para determinação da produção de RNA pela rotulagem dos recém produzido RNA 1 h com BrU, seguido pela extração de RNA imediata e imunoprecipitação de RNA com rótulo BrU. Este método tem sido descrito anteriormente na referência16, e este artigo inclui algumas etapas adicionais para aumentar a especificidade do IP e pureza de RNA, por grânulos de pré-tratamento com baixas concentrações de BrU, bem como uma etapa de purificação de fenol-clorofórmio para Aument...

5-Bromouridine (BrU) imunoprecipitação (IP) permite o estudo da produção de RNA em células com n ou efeitos muito limitados na fisiologia de células durante o breve período1,2de rotulagem. O método baseia-se a incorporação do derivado sintético uridina BrU em RNA recém sintetizado seguido pelo IP do RNA rotulado usando anticorpos anti-BrU (Figura 1).
Tem sido conhecido por décadas a síntese de proteínas pode ser transcriptionally regulado, e a existência de factores de transcrição foi hipotetisada há mais de 50 anos3. Hoje, é conhecido que várias doenças são causadas pela desregulação de transcrição e a estabilidade do RNA (S1 Figura complementar em referência4), e a capacidade de medir as mudanças na produção do RNA é de grande importância na doença de compreensão desenvolvimento.
Por outro lado, ferramentas para regular a produção de RNA fornecem novas possibilidades para o tratamento de doenças causadas pela expressão de proteína muito pouco ou demais, ou acúmulo de proteína, como na doença de Parkinson (PD). A proteína predominante acumulando agregados como insolúveis em PD é α-synuclein, e o nível de α-synuclein está diretamente ligado à doença, como a multiplicação de gene do gene da α-synuclein causa familiar PD5. Além disso, α-synuclein agrega de forma dependente de concentração. Downregulation dos níveis de mRNA de α-synuclein, portanto, é uma estratégia terapêutica interessante, que tem sido conseguida com êxito usando a interferência do RNA para diminuir a perda de célula neuronal em modelos de roedores de PD6,7.
É importante ser capaz de medir as mudanças na produção de RNA causada por doença ou intervenções terapêuticas. Métodos de última geração para medição níveis de estado estacionário de RNA, como a transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), não são capazes de distinguir entre alterações causadas por regulamento transcriptional ou alterados Estabilidade do RNA. Um método amplamente utilizado para a investigação de taxas de decaimento de RNA está bloqueando da maquinaria transcricional usando compostos tais como α-amanitin ou actinomicina D, seguido por medições de RNAs os decadentes. No entanto, existem alguns problemas associados com um bloqueio geral da transcrição em células, como a indução de apoptose8,9. Ao lado dos efeitos citotóxicos, inibidores transcriptional também apresentam vários problemas técnicos, como a lenta absorção celular de α-amanitin e falta de especificidade de actinomicina D (revisto em referência10).
Para evitar o bloqueio total da transcrição, têm sido utilizados análogos de nucleotídeos, tais como uridina 5-ethynyl (5-UE), 4-thiouridine (TU-4) e BrU. Estes são prontamente ocupados por células de mamíferos e incorporadas RNA recém sintetizado, permitindo pulso-rotulagem do RNA dentro de um intervalo de tempo específico. BrU é menos tóxico do que o 5-UE e 4-TU, tornando-se o preferido análogo escolha11,12.
BrU-IP pode ser usado para investigar tanto a taxa de síntese de RNA e estabilidade e, portanto, distinguir entre as causas de alterações no RNA total. Este artigo incidirá sobre a medição de síntese de RNA e refere-se a referência2 para obter detalhes sobre a investigação da estabilidade do RNA. Para investigar a síntese do RNA, as células são brevemente rotuladas com BrU , por exemplo, para 1 h, seguido por BrU-IP1 (Figura 1). Isso permite que as medições do RNA sintetizado no curto prazo rotulagem e mudanças observadas dará uma melhor estimativa de regulamentos na síntese de RNA do que através da medição de alterações no RNA total por RT-qPCR. Deve ser mencionado, no entanto, que, apesar do tempo de rotulagem, por exemplo, apenas 1 h, degradação ainda pode ter uma influência sobre os níveis de RNA observada.
RNA de experimentos de BrU-IP são adequados para análise a jusante por tanto RT-qPCR1 ou próxima geração sequenciamento2,13. Outros métodos de detecção de RNA padrão, tais como a mancha do Norte ou ensaio da proteção ribonuclease, podem também ser aplicáveis para certos RNAs.

<table><tbody><tr><td>Ribolock Rnase inibidor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Ovelha anti-rato IgG</td><td>Life Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bromodeoxiuridina anticorpo de camundongo</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Espectrofotometria ultravioleta-visível</td></tr><tr><td>Fenol saturado de água pH 6,6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio:IAA 25:24:1 pH 6,6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>Sondas de RNA Taqman</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td><td>Sondas flurogênicas</td></tr><tr><td>7500 Sistema de PCR rápido em tempo real</td> Linha celular de HEK293T da <td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de Hank <td>5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 e 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoclavado.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>0,1% de dietilpirocarbonato tratado com H2</td></tr><tr><td>O 2xBrU-IP Tampão</td><td></td><td></td><td>40 mM Tris-HCl pH 7,5 e 500 mM NaCl em DEPC H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inibidor</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP tampão suplementado com 1 &mu; g/&mu; L BSA e 80 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+ 1 mg/mL de heparina</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP tampão diluído 1:1 DEPC-H2O e suplementado com 1mg/mL de heparina</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP tampão diluído 1:1 em DEPC-H2O e suplementado com 0,5 &mu; g/&mu; L BSA e 20 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de eluição <td>0,1% SDS em H2O livre de RNAse</td></tr></tbody></table>

investigação da síntese do rna usando 5-bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Quando os níveis de estado estacionário do RNA são comparados entre duas condições, não é possível distinguir se as alterações são causadas por alterações na produção ou degradação do RNA. Este protocolo descreve um método para a medição da produção de RNA, usando 5-Bromouridine de rotulagem do RNA seguido por imunoprecipitação, que permite a investigação do RNA sintetizado dentro de um curto espaço de tempo (por exemplo, 1 h). A vantagem de 5-Bromouridine-rotulagem e imunoprecipitação sobre o uso de inibidores de transcriptional tóxicos, tais como α-amanitin e actinomicina D, é que não há nenhum ou muito baixos efeitos na viabilidade celular durante o uso a curto prazo. No entanto, porque 5-Bromouridine-imunoprecipitação captura apenas RNA produzido dentro do tempo curto de rotulagem, lentamente produzido, bem como rapidamente degradada RNA pode ser difícil de avaliar por esse método. O RNA 5-Bromouridine-rotulados capturado por imunoprecipitação-5-Bromouridine pode ser analisado por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa na próxima geração de sequenciamento. Todos os tipos de RNA podem ser investigados, e o método não está limitado a medição do mRNA, tal como é apresentado neste exemplo.

Nossos testes iniciais de tempo BrU-rotulagem foram realizados em células AsPC-1. As células foram tratadas com BrU para 0, 1, 2 e 4,5 h, seguido por extração de RNA total e BrU-IP. GAS5 e GAPDH foram medidos em BrU-IP do RNA, que demonstrou que a rotulagem de 1h foi suficiente para atingir uma aproximadamente 9 - e 44 vezes mudança em relação ao fundo (h 0) GAPDH e GAS5, respectivamente.
BrU-IP e a análise descrita acima foram ...

Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.

Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

O objetivo geral deste experimento é medir as mudanças na síntese de RNA por marcação de bromouridina e imunoprecipitação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do metabolismo do RNA, medindo se uma mudança nos níveis de RNA é causada por mudanças na síntese de RNA. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada em qualquer tipo preferido de cultura de células e os materiais utilizados são facilmente acessíveis.Para iniciar o protocolo, semeie 3,5 vezes 10 até o sexto HEK293T células em uma placa de Petri de 10 centímetros em 10 mililitros de meio de crescimento para obter um total superior a 40 microgramas de RNA após a extração 48 horas depois. Mantenha as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2,48 horas após a semeadura, aspire oito mililitros de meio de crescimento e deixe dois mililitros para trás para evitar que as células sequem. Adicione dois milimoles de bromouridina e tratamento ao meio de crescimento e remova os dois mililitros residuais das células antes de reaplicar os oito mililitros de bromouridina contendo meio de crescimento.Em seguida, incube as células por uma hora. Após a incubação, lave as células em cinco mililitros de tampã

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Descrevemos uma abordagem experimental básica para análise da terminação da transcrição pela RNA polimerase II in vivo usando BrUTP pela abordagem run-on de transcrição específica da fita (TRO) em leveduras de brotamento. Este protocolo pode ser estendido para estudar a terminação da transcrição por outras RNA polimerases tanto em leveduras quanto em eucariotos superiores.

Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

O uso do uracil swcnts a purificar sensitivamente e especificamente o RNA recentemente transcrito do fermento Saccharomyces cerevisiae.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

Aprenda a medir a síntese de RNA usando marcação com bromouridina e imunoprecipitação em culturas celulares. Este método permite quantificar alterações na síntese de RNA e investigar dinâmicas do metabolismo de RNA.

Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

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