Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

O objetivo geral deste experimento é medir as mudanças na síntese de RNA por marcação de bromouridina e imunoprecipitação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do metabolismo do RNA, medindo se uma mudança nos níveis de RNA é causada por mudanças na síntese de RNA. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada em qualquer tipo preferido de cultura de células e os materiais utilizados são facilmente acessíveis.

Para iniciar o protocolo, semeie 3,5 vezes 10 até o sexto HEK293T células em uma placa de Petri de 10 centímetros em 10 mililitros de meio de crescimento para obter um total superior a 40 microgramas de RNA após a extração 48 horas depois. Mantenha as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2,48 horas após a semeadura, aspire oito mililitros de meio de crescimento e deixe dois mililitros para trás para evitar que as células sequem. Adicione dois milimoles de bromouridina e tratamento ao meio de crescimento e remova os dois mililitros residuais das células antes de reaplicar os oito mililitros de bromouridina contendo meio de crescimento.

Em seguida, incube as células por uma hora. Após a incubação, lave as células em cinco mililitros de tampão de Hank e tripsinize as células com dois mililitros de 0,05% de tripsina por cinco minutos. Adicione oito mililitros de meio de crescimento para interromper a reação, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e gire as células por dois minutos a 1.000 vezes g.

Em seguida, remova o sobrenadante e extraia o RNA total do pellet celular usando um kit de isolamento de RNA e elua o RNA em água livre de RNase. Esta técnica é muito sensível e, portanto, é importante trabalhar com RNA de alta qualidade. A extração de RNA é, portanto, uma etapa crítica, mas também é facilmente realizada com os kits de extração de RNA atuais.

Prepare os grânulos em um lote para o número de amostras a serem investigadas mais uma extra para contabilizar a perda durante a pipetagem e a mistura por turbilhão. Ressuspenda completamente as esferas magnéticas anti-Mouse IgG por mistura de giro e retire 20 microlitros de esferas por amostra em um tubo de 1,5 mililitro sem RNase. Coloque o tubo de 1,5 mililitro em um suporte magnético por 20 segundos para que as contas se acumulem na lateral.

Remova o sobrenadante, retire o tubo do suporte magnético e ressuspenda os grânulos em 40 microlitros de tampão bromouridina-IP por pipetagem. Gire o tubo por dois segundos em uma centrífuga de mesa, coloque-o de volta no suporte magnético e remova o sobrenadante. Em seguida, bloqueie a ligação inespecífica às contas usando heparina.

Ressuspenda as esferas em um mililitro de uma vez bromuridina-IP mais um miligrama por mililitro de tampão heparina e gire o tubo por 30 minutos. Em seguida, lave as contas uma vez. Ressuspenda as esferas em um mililitro de tampão bromuridina-IP de uma vez e adicione 1,25 microgramas por amostra de anticorpo anti-alfa-bromodeoxiuridina.

Incube as contas por uma hora enquanto gira. Após a incubação, lave as contas três vezes. Ressuspenda as esferas lavadas em 50 microlitros por amostra de tampão bromouridina-IP de uma vez suplementado com uma bromouridina milimolar e deixe as esferas girando por 30 minutos.

Após a rotação, lave os grânulos três vezes e ressuspenda os grânulos em 50 microlitros por amostra de tampão bromoridina-IP de uma vez. Meça as concentrações de RNA nos extratos de RNA usando espectrofotometria ultravioleta-visível e dilua 40 microgramas de RNA de cada amostra em água livre de RNase até um volume total de 200 microlitros. Depois de desnaturar o RNA por dois minutos a 80 graus Celsius, gire as amostras brevemente em uma centrífuga de mesa.

Após a centrifugação, adicione 200 microlitros de duas vezes bromuridina-IP mais BSA, inibidor de RNase. Em seguida, adicione 50 microlitros das esferas ressuspensas e preparadas a cada amostra e gire as amostras por uma hora. Após a incubação, lave as contas quatro vezes.

Ressuspenda as esferas em 200 microlitros de tampão de eluição para eluir o RNA e adicione rapidamente 200 microlitros de fenol de pH 6,6 para remover quaisquer moléculas que não sejam de RNA da amostra. Gire a amostra para misturar e gire-a por três minutos a 25.000 vezes g em uma centrífuga de mesa. Em seguida, aspire o máximo possível da fase superior, aproximadamente 190 microlitros, e mova-o para um tubo com 200 microlitros de fenol-clorofórmio pH 6,6

Certifique-se de aspirar a mesma quantidade entre as amostras. Gire a amostra e gire-a. Após a centrifugação, realizar a extração do clorofórmio aspirando a fase aquosa superior, aproximadamente 180 microlitros, e transferi-la para um tubo contendo 200 microlitros de clorofórmio.

Gire e gire a amostra. Aspirar a fase aquosa superior, aproximadamente 170 microlitros, e transferi-la para um tubo contendo 17 microlitros de acetato de sódio de pH três molares para neutralizar e precipitar o RNA da solução aquosa. Em seguida, adicione dois microlitros de glicogênio, que precipitarão com o RNA e tornarão o pellet mais visível.

Adicione 500 microlitros de etanol a 96% para aumentar a ligação entre os íons de sal e o RNA e misture invertendo o tubo algumas vezes. Deixe o tubo durante a noite a menos 20 graus Celsius ou por 15 minutos em gelo seco. Gire a amostra resfriada, descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet e lave o pellet em 185 microlitros de etanol a 75% para remover qualquer sal residual.

Em seguida, gire a amostra a 25.000 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Eliminar completamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e deixá-lo secar durante cinco a 10 minutos com a tampa aberta. Ressuspenda o pellet em 10 microlitros de água livre de RNase aplicada na lateral do tubo para evitar perturbar o pellet.

As células AsPC-1 foram tratadas com bromouridina por zero, uma, duas e 4,5 horas, seguidas de extração de RNA total e bromuridina-IP. GAS5 e GAPDH foram medidos em RNA bromuridina-IP, o que demonstrou que uma hora de marcação foi suficiente para atingir uma mudança de nove e 44 vezes em comparação com o fundo. Dois milimoles de tratamento com bromouridina não induziram nenhuma alteração morfológica nas células HEK293T por uma hora ou pelo tratamento mais longo de quatro horas.

A inibição de PLK-2 causou um aumento no mRNA de alfa-sinucleína tanto na entrada quanto na bromuridina-IP, sugerindo que o aumento no RNA de estado estacionário é causado por um aumento na síntese de RNA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular o RNA recém-sintetizado com bromouridina e realizar uma imunoprecipitação subsequente da bromouridina e do RNA marcado.