Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli
9 de dezembro de 2017
Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .
Neste trabalho, demonstraremos um protocolo fácil para produzir proteínas acetiladas de forma homogênea em locais específicos, usando E.coli como hospedeiro de expressão. A acetilação reversível de proteínas com lisina é uma das modificações pós-traducionais mais abundantes na natureza. Ele desempenha papéis importantes em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo transcrição de genes, resposta ao estresse, diferenciação celular e metabolismo.
A geração de proteínas puramente acetiladas em posições de design é muito útil para estudar a acetilação de proteínas. No entanto, é difícil para a maioria dos métodos clássicos. Este desafio foi resolvido pela técnica de expansão do código genético.
Ele utiliza uma variável de pirrolisil-tRNA sintetase projetada para carregar tRNA-Pyl com acetillisina, em seguida, utiliza a maquinaria translacional do hospedeiro para suprimir o códon de parada UAG no mRNA e direciona a incorporação de acetillisina na posição de design da proteína alvo. Em primeiro lugar, o códon de parada âmbar precisa ser introduzido na posição correspondente no gene alvo por mutagênese dirigida ao local. Amplificar o plasmídeo molde que contém o gene das proteínas selvagens e inserir a mutação do códon de parada dos primers pela reação de PCR.
Após a PCR, o material amplificado é adicionado diretamente à mistura enzimática quinase-ligase-Dpn1 por uma hora em temperatura ambiente para circularização e remoção do molde. Adicione cinco microlitros da mistura ao tubo de 25 microlitros de células E.coli competentes descongeladas. Agite cuidadosamente o tubo para misturar e coloque a mistura no gelo por 30 minutos.
Choque térmico da mistura a 42 graus Celsius por 30 segundos e coloque no gelo por mais cinco minutos. Pipete 600 microlitros de meio SOC em temperatura ambiente na mistura. Incube a 37 graus Celsius por 60 minutos agitando.
Espalhe 100 microlitros na placa com o antibiótico correspondente e incube durante a noite a 37 graus Celsius. O plasmídeo da colônia única é enviado para sequenciamento. O segundo passo é expressar e purificar a proteína acetilada específica do local.
Pegue uma única colônia da placa, que contém o gene alvo contendo TAG mutado e o sistema de incorporação de acetillisina. Inocular em 15 mililitros de meio LB fresco com antibióticos correspondentes durante a noite a 37 graus Celsius. Transfira a cultura noturna de 15 mililitros para 300 mililitros de meio LB fresco com antibióticos e incube a 37 graus Celsius.
Adicionar acetillisina de cinco milimolares e nicotinamida de 20 milimolares como concentrações finais nos meios de crescimento quando a absorbância atingir 5 a 600 nanômetros. Cultive células por mais uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione o indutor para a expressão da proteína e cultive as células a 25 graus Celsius durante a noite.
Colher as células centrifugando a 3 000 g durante 15 minutos. Descarte o sobrenadante e armazene os pellets celulares a 80 graus negativos. Descongele os grânulos de células congeladas no gelo e ressuspenda com 15 mililitros de tampão de lise, cinco microlitros de beta-mercaptoetanol e um microlitro de nuclease.
As células são quebradas pela sonicação. Centrifugar o extracto bruto a 20 000 g durante 25 minutos a quatro graus. Filtrar o sobrenadante com um filtro de membrana de 45 micrómetros.
Carregue a amostra filtrada em uma coluna contendo um mililitro de resina NTA de níquel, equilibrada com 20 mililitros de tampão de lise. Lave a coluna com 20 mililitros de tampão de lavagem. A proteína-alvo é iludida com dois mililitros de tampão de eluição.
A proteína purificada é dessalinizada pela coluna PD-10 adicionando uma amostra de 2,5 mililitros e coleta a amostra dessalinizada com tampão de dessalinização de 3,5 mililitros. O próximo passo é caracterizar bioquimicamente a proteína acetilada purificada. Desnature as proteínas com o tampão de amostra SDS acima de 100 graus por cinco minutos.
Centrifugue a mistura, carregue no gel SDS-PAGE e deixe funcionar a 200 volts por 30 minutos. Lave o gel com água destilada e agite suavemente. Para fazer o sanduíche para western blotting, do cátodo ao ânodo é esponja, papel de filtro, tampão de transferência, gel SDS-PAGE embebido, membrana PVDF ativada por metanol, outro papel de filtro, remova as bolhas do sanduíche e outra esponja.
Coloque a pilha no tanque de transferência. Opere a uma corrente constante de 350 miliamperes por 45 minutos. Lave a membrana de PVDF com 25 mililitros de tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.
Bloqueie a membrana com 5% BSA e o tampão TBST por uma hora em temperatura ambiente. Incube a membrana com anticorpo acetillisina conjugado com HRP diluído à temperatura ambiente por uma hora ou quatro graus durante a noite com agitação suave. Lave a membrana com 20 mililitros de tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.
Repita esta etapa quatro vezes. Aplique o substrato de quimioluminescência na membrana por um minuto. Capture o sinal com um gerador de imagens de base de câmera CCD.
Os mesmos volumes de frações de eluição e purificação de proteínas foram carregados no gel SDS-PAGE. O rendimento da proteína acetilada é cerca de metade da proteína do tipo selvagem, que é altamente eficiente, e a mesma cepa de expressão sem acetillisina e meio de crescimento não pode produzir proteínas com quantidade detectável, indicando alta pureza da proteína acetilada, uma vez que não há aminoácidos canônicos incorporados nesta posição específica. O Western blotting mostrou que não há acetilação detectável na proteína do tipo selvagem, indicando o baixo fundo de acetilação não específica desse sistema de expressão, enquanto a proteína acetilada tinha uma banda clara.
A espectrometria de massa em tandem confirmou que a acetilação ocorre no local correto, cuja posição correspondente no gene foi mutada para o códon de parada. Para obter bons rendimentos e pureza das proteínas acetiladas, o sistema otimizado de incorporação de acetillisina deve ser usado para alta eficiência e alta pureza. As células BL21 (DE3) devem ser usadas para baixo fundo e acetilação inespecífica para aumentar a pureza.
O sistema de incorporação genética pode ser usado em sistemas eucarióticos para aplicações mais amplas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para gerar proteínas homogeneamente acetiladas em sítios específicos utilizando E. coli como hospedeiro de expressão. A técnica aproveita a expansão do código genético para superar os desafios associados aos métodos tradicionais de acetilação de proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Engenharia de Proteínas
- Modificações Pós-Traducionais
Contexto
- A acetilação de lisina é uma modificação pós-traducional prevalente.
- É essencial para diversos processos biológicos, como transcrição gênica e metabolismo.
- A geração de proteínas acetiladas em sítios específicos auxilia no estudo de suas funções.
- Os métodos tradicionais de acetilação são frequentemente ineficazes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para produzir proteínas acetiladas em E. coli.
- Facilitar o estudo dos mecanismos de acetilação proteica.
- Aprimorar a compreensão do papel da acetilação em processos biológicos.
Métodos Utilizados
- Técnica de expansão do código genético.
- Expressão de proteínas em Escherichia coli.
- Acetilação sítio-específica de proteínas.
- Desenvolvimento de protocolo para acetilação homogênea.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de proteínas homogeneamente acetiladas.
- Demonstrou a eficácia da técnica de expansão do código genético.
- Forneceu uma nova ferramenta para estudar a acetilação de proteínas.
- Aprimorou a compreensão do papel da acetilação em funções biológicas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido simplifica a produção de proteínas acetiladas.
- Este método pode ser aplicado a diversos estudos envolvendo modificações de proteínas.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para explorar processos relacionados à acetilação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A acetilação específica de locais em proteínas em Escherichia coli permite a investigação precisa de modificações pós-traducionais essenciais para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Este protocolo aborda desafios persistentes na geração de proteínas homogeneamente modificadas, apoiando a confiança preditiva e a continuidade translacional em portfólios de P&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite testar diretamente hipóteses dependentes de acetilação em sítios proteicos definidos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao isolar o impacto funcional de eventos específicos de acetilação de lisina.
- Apoia a validação robusta de alvos ao fornecer proteínas puras e modificadas de forma específica em sítios determinados para ensaios subsequentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece reagentes proteicos acetilados padronizados e reproduzíveis para ensaios bioquímicos e biofísicos quantitativos.
- Melhora a confiabilidade dos ensaios ao eliminar a interferência proveniente da acetilação não específica.
- Permite a produção escalável de proteínas modificadas para plataformas de triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas bioquímicas in vitro com modificações pós-traducionais relevantes para doenças observadas in vivo.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo estudos funcionais da acetilação em sistemas modelo.
- Reduz o risco de translação ao esclarecer as consequências biológicas de eventos específicos de acetilação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a geração de proteínas acetiladas de forma específica em sítios determinados para testes de hipóteses, desenvolvimento de ensaios e estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia o teste de hipóteses nulas ao permitir a comparação direta de variantes proteicas selvagens e acetiladas.
- Triagem: Fornece reagentes reprodutíveis e de alta pureza para o desenvolvimento de ensaios quantitativos e avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição precisa de alterações funcionais dependentes da acetilação utilizando blotagem ocidental e espectrometria de massas.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de achados in vitro com padrões de acetilação in vivo relevantes para modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para gerar diversas proteínas modificadas de forma específica em sítios ao longo de múltiplos alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a produção de proteínas modificadas com alta eficiência e pureza.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avançar/não avançar ao esclarecer o impacto funcional da acetilação.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e vias com base em evidências bioquímicas robustas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, expressão proteica e análise de modificações pós-traducionais.
- Necessita de acesso a sistemas de expressão em E. coli, ferramentas de mutagênese direcionada e plataformas analíticas como western blot e espectrometria de massas.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes alvos proteicos ou hospedeiros de expressão, conforme as necessidades do projeto.
- O rendimento e a pureza dependem da otimização do sistema de incorporação de acetil lisina e da seleção da linhagem do hospedeiro.
