Name: Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a detectar variantes raras de transcrição CDH1a em tecidos de câncer gástrico fresco congelado usando PCR digital baseada em chip. Este método oferece maior sensibilidade e precisão para alvos de baixa abundância em pesquisa oncológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores desejam agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana do IRST.
Nota: Este procedimento é projetado especificamente para a detecção de um reduzido número de moléculas de cDNA em tecidos humanos fresco congelado. As secções de tecido foram cortadas em gelo seco, enquanto ainda congelado, previamente validado tumor gástrico paciente-derivado ou amostras de tecido normal.
1. purificação e isolamento de RNA
<ol><li>
Extração de RNA Nota: A isolação do RNA é executada sob o capô, usando um produto específico (ver Tabela de materiais). No entanto, uma variedade de kits de isolamento estão comercialmente disponíveis.<ol>
<li>Homogeneizar 50-100 mg de amostra de tecido finamente cortada de fresco congelado em um tubo de 1,5 mL com 1 mL do reagente de isolamento de RNA e vórtice vigorosamente durante 15 s. Incubar os tubos a-80 ° C durante a noite.</li>
		<li>Incubar o tubo contendo a amostra em temperatura ambiente por 5 min e mistura vortexing por 15 s.</li>
		<li>Mantenha o tubo no gelo, adicionar 200 µ l de clorofórmio e vórtice vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Incubar os tubos à temperatura ambiente por 60 s e centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir a fase aquosa em um tubo de 1,5 mL e adicionar 20 µ g de glicogênio. Nota: É importante evitar cuidadosamente transferir qualquer interfase ou camada orgânica a fim de reduzir a contaminação.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de isopropanol, inversão do tubo para misturar e incubar no gelo por 10 min.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C, para precipitar o RNA. Nota: RNA estará presente em uma pelota gelatinosa do lado e o fundo do tubo, muitas vezes invisível após a centrifugação.</li>
		<li>Remover o sobrenadante sem perturbar o precipitado e lave-a com 1 mL de etanol a 75% por pipetagem.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.</li>
		<li>Deixe o sedimento secar até que o precipitado torna-se transparente e dissolvê-lo em 50 µ l de água livre de RNase.</li>
		<li>Congele as amostras a-80 ° C pelo menos durante a noite antes de quantificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminação de DNA genômica e purificação de RNA Nota: Um passo de digestão de DNase, seguido por uma purificação de RNA baseados em colunas, é recomendado para análises de baixa abundância Alvos para digerir o DNA contaminante.<ol>
<li>Dissolva o liofilizado DNase I (1.500 Kunitz unidades) em 550 µ l de RNase-livre da água utilizando uma seringa, misture gentilmente por inversão do frasco e dividir a solução reconstituída em alíquotas.</li>
		<li>O volume calculado da amostra com 15 µ g de RNA de transferência em um tubo de 1,5 mL, 10 µ l de DNase digestão buffer do kit (listados na Tabela de materiais), 2,5 µ l de DNase solução estoque e RNase-livre da água a 100 µ l. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Adicione 350 µ l de tampão de lise do tecido (do kit, consulte Tabela de materiais) e misture por pipetagem.</li>
		<li>Adicione 250 µ l de etanol 100% e misture por pipetagem.</li>
		<li>Transferir todo o volume (700 µ l) em uma nova coluna de rotação e centrifugar a 12.000 x g por 15 s.</li>
		<li>Transferir o filtro para um novo tubo de coleção, adicionar 500 µ l de etanol a 80% para a coluna e centrifugar a 12.000 x g por 2 min.</li>
		<li>Abra a tampa da coluna de rotação e centrifugar a 12.000 x g por 5 min com um novo tubo de coleta para secar o filtro; Depois de transferir o filtro para um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 14 µ l de água livre de RNase diretamente para a coluna de filtro e centrifugar a 12.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Mantenha as amostras no gelo e proceder à quantificação usando 2 µ l da amostra em um Espectrofotômetro de bancada ou armazenar o RNA a-80 ° C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntese de cDNA
<ol><li>Lugar de 1.000 ng do RNA, 4 µ l do mix mestre, 1 µ l de transcriptase reversa e água livre de RNase, até um volume final de 20 µ l em um tubo estéril de PCR. Misture delicadamente e spin para baixo.</li>
	<li>Incubar a mistura de reação em um termociclador, aplicando as seguintes condições: 5 min a 25 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C.</li>
	<li>Os tubos de centrifuga brevemente e proceder à análise dPCR ou armazenar a-20 ° C até ser necessário.</li>
</ol>3. reação de PCR digital setup
<ol><li>
reação de dPCR misturar e preparação da amostra
	<ol>
<li>Descongele o mestre mix e o ensaio à temperatura ambiente pelo menos 20 min.</li>
		<li>Diluir as amostras de cDNA a uma concentração de 300 ng em 6 µ l de água.</li>
		<li>Delicadamente, vórtice o mestre misturar e preparar a mistura em um tubo estéril com 8.7 µ l do mix mestre, 0,87 µ l do primer personalizado projetado ensaio CDH1a e 1.83 µ l de água livre de nuclease para um volume final de 11,4 µ l. Nota: Para detalhes de primeira demão CDH1a personalizado projetado ensaio consulte a Tabela de materiais.</li>
		<li>Transferência de 11,4 µ l da mistura preparada para a amostra diluída do cDNA, misture delicadamente e brevemente centrifugar. Nota: Os Volumes incluem excesso de 20% para compensar a perda de volume de pipetagem. Prepare a mistura para todas as amostras e um controle modelo não (NTC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da microplaqueta Nota: Para obter melhores resultados carregar os chips mais rápido possível.<ol>
<li>Conecte o carregador a microplaqueta e esperar até que a luz indicadora fica verde.</li>
		<li>Retire a tampa da seringa fluido imersão puxando suavemente o êmbolo 1-2 mm e liberá-lo para facilitar essa etapa e substituí-lo com uma dica.</li>
		<li>Pegue um novo chip e tome nota do código escrito na tampa para associá-la com a amostra.</li>
		<li>Segure a tampa com cuidado, por seu lado, descascar afastado a película protetora e coloque a tampa com a cara pegajosa na orientação correta.</li>
		<li>Cuidadosamente pegue um chip, tomando cuidado para não tocar na parte interna e carregá-lo em ninho chip na posição correta, pressionando para baixo a alavanca para abrir a pinça.</li>
		<li>Carregar uma nova lâmina de carregamento sobre o carregador e empurre suavemente para garantir que é firmemente no lugar.</li>
		<li>Transferência de 14,5 µ l do mix dPCR reação sobre a lâmina de carregamento sem fazer bolhas de ar ou desviando a lâmina, depois que a imprensa o preto carregando o botão para distribuir o volume no chip.</li>
		<li>Use a seringa de fluido de imersão para transferir cerca de 20 gotas na superfície da microplaqueta, tomando cuidado para não tocar na superfície com a ponta. Nota: É importante cobrir toda a superfície sem derramar o líquido sobre as bordas.</li>
		<li>Gire o braço de carregador para fazer a tampa, entrar em contacto com o chip e pressione para baixo para 15 s.</li>
		<li>Pressione o botão da tampa para liberar o chip e coloca o braço para a posição.</li>
		<li>Segure o chip montado em um ângulo de 45° e cuidadosamente dispensar o líquido de imersão com a seringa através da porta de preenchimento, girar o chip ligeiramente para certificar-se de que há nenhuma bolha de ar e remover qualquer excesso de líquido com uma limpeza sterile.</li>
		<li>Fechar o caso do chip por descascar fora delicadamente a etiqueta em cima do chip tampa e pressione sobre a porta de preenchimento pelo menos 5 s.</li>
		<li>Armazene o chip no escuro até que esteja pronto para carregar no termociclador. Nota: Fichas preparadas devem ser usadas até 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
reação de dPCR
	<ol>
<li>Abra a tampa e instale os adaptadores para ambos os blocos, mesmo quando é usado um único bloco.</li>
		<li>Coloque as fichas sobre o bloco de amostra na posição correta. Nota: A porta de preenchimento deve ser orientada para a frente do termociclador em posição elevada para permitir que quaisquer bolhas de ar para flutuar para o topo sem perturbar a janela do chip. Use fichas vazias para equilibrar os dois blocos.</li>
		<li>Coloque a almofada térmica sobre o bloco de amostra para cobrir completamente as fichas.</li>
		<li>Feche a tampa e começar a PCR executar, aplicando as seguintes condições: Segure a 96 ° C por 10 min; 45 ciclos de 60 ° C por 2 min e 98 ° C por 30 s; Segure a 60 ° C por 2 min; manter a 4 ° C. Desligue o termociclador e descongelar os chips em temperatura ambiente pelo menos 10 min. Nota: Análise de Chip deve ser realizada dentro de uma hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise da microplaqueta
	<ol>
<li>Abra a tampa do instrumento e retirar as almofadas térmicas e, em seguida, remover os chips de adaptadores. Nota: Guarde as fichas em um local escuro, limpo, até a análise.</li>
		<li>Limpe a superfície do chip com isopropanol e uma limpeza estéril. Nota: Inspecione cada chip para vazamentos ou problemas potenciais.</li>
		<li>Insira o cabo USB o sistema detector para salvar os dados.</li>
		<li>Abra a bandeja do chip do sistema detector, carregar o chip voltado para cima na posição correta e feche a bandeja.</li>
		<li>Espere 30 s para processamento, então retire o chip e inserir o outro.</li>
		<li>Espere que a análise seja concluída para todos os chips transformados, em seguida, inserir o USB em um computador para transferir os arquivos. Nota: O tempo total para análise é cerca de 2 a 3 min/chip.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. interpretação e análise de dados
<ol><li>Ligue para a plataforma de software baseado em nuvem necessária para realizar todas as análises a jusante.</li>
	<li>Criar um projeto e importar todos os arquivos de dados dos chips de interesse.</li>
	<li>Digite o nome da amostra; Selecione o corante e ensaio utilizado na aba "Definir Chips".</li>
	<li>Determine se o chip é aceitável, visualizando-a na guia "Dados de revisão", verificando como completamente a amostra foi carregada para o chip e quantos pontos de dados são avaliáveis. Nota: Rejeitar chips com menos de 13.000 pontos de dados avaliáveis.</li>
	<li>Avançar para o gráfico de dispersão do chip selecionado no lado direito da tela; aplica um limite de 6.000 para os sinais de corante fluoresceína amidite (FAM) repórter (eixo y) para todos os chips. Nota: O limite configurado pode variar com base em ensaios os usados.</li>
	<li>Remover quaisquer sinais positivos duvidosos para evitar resultados falso-positivos, selecionando o ponto relativo sobre o scatter plotagem usando a ferramenta laço e pressionar em "indeterminado". Todos os restantes pontos positivos indicam a presença de cópias do cDNA do raro alvo analisado.</li>
</ol>

<ol><li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li>
<li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer%3A+cellular+consequences%2C+clinical+applications+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li>
<li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin%2FCDH1+intron2%3A+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li>
<li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+%28E-cadherin%29+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li>
<li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Assays+Part+I%3A+Partitioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li>
<li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR%3A+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li>
<li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Transl.Med%22%5BJournal%5D)">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li>
<li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897(2017).</li>
<li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849(2015).</li>
<li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296(2013).</li>
</ol>

Os autores relatam que não há conflitos de interesse para este trabalho.

dPCR foi originalmente desenvolvido para DNA molecular medições10,11,12,13 e no tempo que essa tecnologia foi adaptada para a quantificação de microRNAs e RNA transcritos5, 14,15. Neste protocolo, ampliamos a lista de aplicativos que incluem detecção de transcrições raras derivada de amostras de tecid...

O gene CDH1 codifica para E-caderina, um factor-chave envolvidos na manutenção do epitélio gástrico normal através da regulamentação de1, de adesão, sobrevivência, proliferação e migração celular. Perda de proteína E-caderina, como resultado do germline deletério ou alterações somáticas de CDH1 tem sido associadas com o desenvolvimento de GC2,3. Non-canônico transcrições decorrentes intrão 2 do gene também tem sido a hipótese para desempenhar um papel na carcinogênese gástrica4,5. Em particular, uma tal transcrição, CDH1a, foi mostrada para ser expressa em células no GC, mas está ausente do estômago normal4. Recentemente detectamos CDH1a em amostras de tecido do GC de pacientes do GC usando chip baseada dPCR5. dPCR foi utilizado para avaliar, pela primeira vez, a presença da transcrição do gene CDH1a em GC intestinal e no tecido normal.
O método padrão-ouro para determinar a expressão do gene é PCR quantitativo em tempo real (qPCR). No entanto, os dados resultantes podem às vezes ser variável e de má qualidade, especialmente quando o nível do alvo na amostra é baixo. Esta variabilidade pode ser causada por contaminantes, que inibem a atividade do polymerase e recozimento da primeira demão, levando a amplificação não-específica e o lado competitivo reações6.
Embora os princípios básicos de bioquímicos da dPCR são semelhantes da qPCR, dPCR mostra algumas vantagens, permitindo medidas muito precisas do DNA genômico (gDNA) / complementar as moléculas de DNA (cDNA). Com efeito, dPCR é uma reação de ponto de extremidade que depende o particionamento calibrado de uma amostra em milhares de poços, para que cada um contém bem zero ou uma molécula alvo único. Então, amplificação ocorre apenas em poços que contém uma cópia do alvo e é indicada por um sinal fluorescente. O número absoluto de moléculas-alvo na amostra original, então, pode ser calculado determinando a proporção de positivos para totais partições usando binomial Poisson estatísticas7.
Além disso, a técnica de dPCR elimina a necessidade para a execução de uma curva padrão e, portanto, o viés associado e variabilidade, permitindo uma quantificação directa de alvos8,9; produz resultados mais precisos e reprodutíveis independentemente de contaminantes e eficiência devido a sua alta tolerância a inibidores de10; é mais sensível e específico que qPCR e, portanto, é um método confiável para a detecção de um destino de rara. Finalmente, o particionamento da amostra em várias reações reduz a competição com moléculas de fundo e melhora o limite de detecção de alvo, possibilitando a amplificação e facilitar a detecção de moléculas simples de gDNA/cDNA6 . A detecção e quantificação de ácidos nucleicos por chip baseada dPCR foi cada vez mais aplicado para copiar número variação, fragmentos de quantificação de DNA e mutação analisa11,12,13, dada a precisão e material de baixa exigência do método de entrada. Além disso, dPCR recentemente foi integrada a análise de ambos os microRNAs14 e gene transcrições5,15.

<table><tbody><tr><td>Reagente TRIazol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio personalizado CDH1a IDT</td> Integrated <td>DNA Technologies (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [concentrações de ensaio otimizadas para dPCR: 900 nM (F),&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp; Termociclador</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Científico (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR GeneAmp 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Amostra de Bloco Plano Duplo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Base de Inclinação 3D para Sistema de PCR GeneAmp de Bloco Plano Duplo 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>Kit adaptador de chip de PCR digital QuantStudio 3D para termociclador de bloco plano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>Carregador de chip de PCR digital QuantStudio 3D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de PCR digital QuantStudio 3D com cabo de alimentação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

deteção de uma variante de transcrição raro cdh1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo pcr digital baseada em chip

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, uma transcrição não-canônicos do gene CDH1 , foi encontrado para ser expressa em algumas linhas de células de câncer gástrico (GC), Considerando que está ausente na mucosa gástrica normal. Recentemente, nós detectamos variante de transcrição CDH1a em tecidos de tumor fresco congelado obtidos de pacientes com GC. A expressão desta variante em amostras de tecido foram investigada pela microplaqueta digital PCR (dPCR) abordagem aqui apresentada. dPCR oferece o potencial para uma medição precisa, robusta e altamente sensível de ácidos nucleicos e é cada vez mais utilizada para muitas aplicações em diferentes campos. dPCR é capaz de detectar alvos raros; Além disso, dPCR oferece a possibilidade de quantificação absoluta e precisa de ácidos nucleicos, sem a necessidade de calibradores e curvas padrão. Na verdade, o particionamento de reação enriquece o alvo do plano de fundo, o que melhora a eficiência de amplificação e tolerância aos inibidores. Tais características fazem dPCR uma ferramenta ideal para a deteção da transcrição CDH1a rara.

Usando o procedimento aqui apresentado, verificamos para a expressão da variante rara de transcrição CDH1a em tecidos gástricos fresco congelado. A análise por dPCR foi realizada em amostras de tecido normal e câncer 21-emparelhado e em 11 amostras de tumor adicionais. CDH1a foi detectável em tumores 15 de 32 (47%), Considerando que não há amostras de tecido normal mostraram a presença desta transcrição rara5. Em nossa análise, chips com menos de ...

O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

O objetivo geral deste método é detectar variantes raras de transcrição em tecidos frescos congelados por PCR digital baseado em chip. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa do câncer, como a detecção de variantes raras de transcrição que podem estar envolvidas na carcinogênese. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a detecção de alvos pouco abundantes, melhorando a precisão e a reprodutibilidade em relação à PCR quantitativa padrão-ouro.Embora este método possa fornecer informações sobre a detecção de um baixo número de moléculas de cDNA em tecidos humanos frescos congelados, ele também pode ser aplicado a outros tipos de amostras biológicas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é necessário adquirir alguma habilidade na preparação dos chips e na definição de parâmetros para a análise. Para começar, deixe a mistura principal e o ensaio descongelar em temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos.Em seguida, carregue tubos de 0,5 mililitro com seis alíquotas de microlitros das amostras de cDNA. Além disso, faça um tubo de controle sem modelo. Em seguida, subtraia suavemente a mistura principal e alíquota de 8,7 microlitros por reação em um tubo estéril.Em seguida, para cada reação, adicione 0,87 microlitros do primer de ensaio personalizado e adicione 1,83 microlitros de água livre de nuclease. Misture a combinação delicadamente e transfira 11,4 microlitros para cada tubo contendo cDNA e para o controle sem molde. Em seguida, misture os tubos suavemente e agrupe o conteúdo do tubo usando centrifugação por pulso.Para obter os melhores resultados, carregue os chips o mais rápido possível. Conecte o carregador de chips e espere até que a luz indicadora fique verde. Em seguida, prepare a seringa de fluido de imersão puxando suavemente o êmbolo para um a dois milímetros, remova a tampa e adicione a ponta.Em seguida, anote o código escrito na tampa de um novo chip. Em seguida, segure a tampa cuidadosamente ao lado, retire a película protetora e posicione-a no ninho da tampa com o lado adesivo para cima. Agora, pressione a alavanca para abrir o grampo e carregue cuidadosamente o chip no ninho de chips.Em seguida, coloque uma nova lâmina de carregamento no carregador. Empurre-o suavemente para garantir que esteja firmemente no lugar. Agora, transfira 14,5 microlitros de mistura de reação para a lâmina de carregamento.Não faça bolhas de ar e não desvie a lâmina. Em seguida, pressione o botão de carregamento preto para distribuir o volume no chip. É importante confirmar se a lâmina de carregamento está no lugar.Em seguida, ao encher a lâmina, não pressione a pipeta até a segunda parada, para evitar a introdução de bolhas. Além disso, não desvie a lâmina com a ponta. Prossiga usando a seringa para transferir cerca de 20 gotas de fluido de imersão para a superfície do chip.Tome cuidado para não tocar na superfície com a ponta e cubra completamente a superfície sem transbordar. Em seguida, gire o braço do carregador para fazer a tampa entrar em contato com o chip e pressione para baixo por 15 segundos. Em seguida, pressione o botão da tampa para liberar o chip e retorne o braço do carregador à sua posição de descanso.Agora, abra o clamp e segure o chip montado em um ângulo de 45 graus para dispensar cuidadosamente o fluido de imersão através da porta de enchimento por meio de uma seringa. Em seguida, gire o chip levemente para remover as bolhas de ar e, em seguida, remova o excesso de fluido com um pano estéril. Evite derramar fluido de imersão na borda do chip.Se isso acontecer, remova cuidadosamente o excesso antes de selar. Por fim, sele a caixa do chip retirando suavemente a etiqueta da tampa e, em seguida, bloqueando a porta de enchimento por pelo menos cinco segundos. Agora, use o chip dentro de duas horas e, até lá, guarde-o no escuro.Para configurar a reação, abra a tampa e instale os adaptadores em ambos os blocos, mesmo quando um único bloco for usado. Em seguida, coloque um chip nos blocos de amostra e oriente suas portas de enchimento para a frente do termociclador e eleve ligeiramente a porta. Use fichas vazias para equilibrar os dois blocos.Em seguida, coloque a almofada térmica sobre a configuração para cobrir completamente os chips. Em seguida, programe os ciclos, feche a tampa e inicie a reação. Quando a reação terminar, desligue o termociclador, remova as almofadas térmicas e, em seguida, remova os chips.Deixe os chips descongelarem até a temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos no escuro e analise-os dentro de uma hora. Limpe a superfície do cavaco com isopropanol enquanto inspeciona quanto a vazamentos ou outros problemas. Para salvar os dados, insira um cartão de memória USB no sistema detector, onde os dados podem ser salvos.Em seguida, abra a bandeja de cavacos do sistema detector e carregue o cavaco com a face voltada para cima. Feche a bandeja e aguarde 30 segundos para que os dados sejam processados. Em seguida, remova o chip e repita o processo para o próximo chip.Em seguida, mova o pendrive do detector para um computador e transfira os arquivos. Abra o software baseado em nuvem, crie um projeto e importe todos os arquivos de dados para os chips de interesse. Em seguida, na guia Definir chips, selecione o corante e o ensaio usados.Determine se o chip é aceitável visualizando-o na guia Dados de revisão. Se a amostra foi bem carregada, pelo menos 13.000 pontos devem ser utilizáveis. Em seguida, observe o gráfico de dispersão do chip selecionado.Lá, aplique um limite definido pelo tipo de ensaio. Para o sinal de corante repórter de amiita de fluoresceína, use um limite de 6.000. Agora, remova quaisquer sinais duvidosos que possam resultar em falsos positivos.Selecione o ponto questionável no gráfico de dispersão usando a ferramenta laço e selecione a opção Indeterminado. Todos os pontos positivos restantes indicam a presença de cópias de cDNA do alvo raro analisado. Usando o procedimento aqui apresentado, verificamos a expressão da variante rara de transcrição CDH1a em tecidos gástricos frescos congelados.Se o chip tivesse várias bolhas, uma única bolha grande ou menos de 13.000 pontos de dados, ele seria omitido da análise. Nenhum sinal positivo acima do limite selecionado de 6.000 para o canal FAM estava presente no controle sem modelo. Os pontos amarelos indicam que não há amplificação.Uma análise de chip fino filtrou os pontos de dados de baixa qualidade e eliminou o risco de resultados ambíguos. Quando um sinal azul foi localizado, indicando amplificação, se estivesse nas bordas do chip ou ao redor de bolhas, o sinal foi omitido. Da mesma forma, para evitar ainda mais o risco de falsos positivos, os sinais acima do limite FAM selecionado e na extremidade direita do gráfico provavelmente eram aespecíficos e também foram filtrados.21 amostras pareadas de tecido normal e canceroso e 11 amostras adicionais de tumor foram analisadas. No geral, o raro transcrito CDH1a foi detectável em 15 dos 32 tumores. Por outro lado, nenhuma das 21 amostras de tecido de controle mostrou a presença desse transcrito raro.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar uma variante rara de transcrição em tecido recém-congelado por PCR digital baseado em chip. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis a oito horas, dependendo do número de amostras, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de carregar com precisão a amostra na lâmina.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do diagnóstico molecular explorarem variantes raras de sequência em pacientes com câncer.

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra a utilidade da PCR digital em um formato chip-in-a-tube para a detecção de variações de nucleotídeo único em amostras de DNA. Uma única reação de PCR é particionada em câmaras que atuam como reações de PCR independentes, e a detecção de sinais de fluorescência dos alvos amplificados nas câmaras é usada para calcular a frequência do alelo variante na amostra.

PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

Este vídeo demonstra a PCR digital baseada em chip — uma variação da técnica de PCR digital que é útil na detecção de variantes raras de transcrição. A reação de PCR é particionada nas câmaras de um chip nanofluídico, cada um dos quais atua como uma reação independente. A detecção de sinais de fluorescência das câmaras com alvos amplificados confirma a presença de variantes raras de transcrição na amostra.

PCR digital baseado em chip para detectar variantes raras de transcrição usando um chip nanofluídico

Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.

Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

Detecção de ácido ribonucleico (cRNA) do sangue que circula é uma necessidade insatisfeita em diagnósticos clínicos. Aqui descrevemos os métodos que caracterizam cRNA de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células usando a reação em cadeia da polimerase digital sensível e específico. Os testes de requisitos de projeto para detectar variantes de fusão dentro de 72 horas.

Um sangue com base em teste para a detecção de ROS1 e RET transcrições de fusão do ácido ribonucleico, usando a reação em cadeia da polimerase Digital de circulação

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Aqui, é apresentado um protocolo no qual múltiplas ferramentas de bioinformática são combinadas para estudar as funções biológicas da TMEM200A no câncer. Além disso, também validamos experimentalmente as previsões de bioinformática.

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Este protocolo propõe procedimentos laboratoriais holísticos necessários para detectar polimorfismos de nucleotídeo único em amostras de câncer gástrico com base em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons. As sequências-alvo, adaptadores de ligação, amplificação e purificação de biblioteca e critérios de controle de qualidade também são descritos em detalhes.

Detecção de polimorfismo de nucleotídeo único multigênico em câncer gástrico com base na plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma em vitro humana pré-clínicos modelo de osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico cultivados com linhas de células de câncer de mama para simular a interação de osteoclasto-célula de câncer. O modelo pode ser usado para promover nossa compreensão da formação de metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

Aprenda a detectar variantes raras de transcrição CDH1a em tecidos de câncer gástrico fresco congelado usando PCR digital baseada em chip. Este método oferece maior sensibilidade e precisão para alvos de baixa abundância em pesquisa oncológica.

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip (Vídeo) | JoVE Journal

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

Explorar mais vídeos