Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.

O objetivo geral deste procedimento é investigar a função das vesículas extracelulares liberadas pelos glóbulos vermelhos infectados pelo parasita da malária. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da malária, como a forma como os parasitas regulam a comunicação parasita-hospedeiro. A principal vantagem desta técnica é a visualização da arbitragem vesicular por células indoterot em estudo da função reguladora do RNA vesicular por células indoterot.

Demonstrando o procedimento estarão Mya Alondez, Smartin Bagu e Bayo Babatunde, todos estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Em um tubo de microcentrífuga, adicione 100 microgramas de vesículas extracelulares e um mililitro de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, centrifugue as vesículas extracelulares a uma velocidade máxima de 20.000 vezes g por sete minutos para formar um pellet.

Uma vez terminada a centrifugação, rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, dissolva o pellet de vesícula extracelular em 100 microlitros de dilumato C.To certifique-se de misturar completamente pipetá-lo várias vezes. Em seguida, em um novo tubo de microcentrífuga, adicione quatro microlitros da solução de corante etanólico PKH67 a 100 microlitros de dilmant C. Em seguida, bata bem a mistura.

Prepare a solução de corante 40 micromolar 2XPKH67 imediatamente antes do processo de coloração. Em seguida, combine rapidamente 100 microlitros de duas suspensões vesiculares extracelulares com volume igual da solução de corante etanólico PKH67. Em seguida, pipete a mistura 10 vezes para garantir uma mistura adequada.

Após a mistura completa, incubar a solução vesicular extracelular e o corante etanólico PKH67 durante cinco minutos, longe da luz. Durante a incubação, continue agitando a mistura três a quatro vezes. Para interromper a reação de coloração, adicione 200 microlitros de soro à mistura e incube por um minuto para que o excesso de corante se ligue.

Em seguida, lave as vesículas extracelulares com solução salina tamponada com fosfato três vezes. Após a lavagem, centrifugue a amostra a 20.000 vezes g por cinco minutos. Em seguida, dissolva o sedimento vesicular extracelular em 100 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para atingir uma concentração final de um micrograma por microlitro.

Transfira as células endoteliais em um mililitro de meio de crescimento de células endoteliais completo para uma lamínula revestida com polietileno. Deixe as células crescerem uma monocamada na lamínula. Depois que a monocamada for formada, remova o meio com cuidado e adicione um mililitro de meio fresco para lavar as células duas vezes.

Em seguida, adicione 50 microgramas de vesículas extracelulares coradas com PKH67 à lamínula e incube por quatro horas. Após a incubação, aspirar o meio. Para remover todas as vesículas extracelulares não ligadas, lave as células com solução salina tamponada com fosfato três vezes.

Deve-se tomar muito cuidado durante a manipulação da coloração das lamínulas usando pinças finas para evitar perda de células e quebra da lamínula. Após a lavagem, use três por cento da solução de paraformaldeído em solução salina tamponada com fosfato para fixar as células por 15 minutos. Novamente, lave as células com solução salina tamponada com fosfato três vezes e adicione 250 microlitros de tritan a 0,1% x 100 em solução salina tamponada com fosfato para permeablizar as células e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, lave as células com solução salina tamponada com fosfato três vezes e adicione 400 microlitros de tampão de bloqueio às células. Em seguida, incube as células à temperatura ambiente por trinta minutos para evitar ligações não específicas. Após o bloqueio, lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato.

Em seguida, diluir cinco microlitros de solução estoque de faloideno em 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato com albumina de soro bovino a um por cento para preparar a solução de coloração para cada lamínula. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução de coloração na lamínula e incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Quando a incubação terminar, lave as células com solução salina tamponada com fosfato três vezes.

Em seguida, use a concentração final de dois microgramas por mililitro de 3342 em gancho em 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para contra-corar o DNA por 30 segundos. Após a coloração, adicione 400 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para lavar a lamínula duas vezes. Em seguida, levante cuidadosamente a lamínula com a ajuda de uma pinça e inverta-a na parte superior de uma gota de mídia de montagem antidesbotamento em uma lâmina de vidro.

Use um lenço de papel para remover suavemente o excesso de mídia e, em seguida, sele o ambiente com esmalte. Deve-se tomar muito cuidado para não expor as células a muito corante durante a microscopia para evitar o branqueamento celular. Em uma inserção de cultura de tecidos de 24 poços com tamanho de vazamento micromolar de 0,4, semeie células endoteliais.

Em seguida, deixe as células crescerem na cultura por cinco dias sem serem perturbadas para formar uma monocamada diferenciada. Continue trocando o meio a cada dois dias. Uma vez formada a monocamada, semeie 50 microgramas em um mililitro de vesículas extracelulares na câmara superior.

Em seguida, adicione 20 miligramas por mililitro de dextrano rotomíneo ao poço superior e incube a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono. Monitore a migração do dextrano fluorescente para o fundo do poço medindo a missão de fluorescência de 40 microlitros de avoquate médio. Em seguida, programe o comprimento de onda de excitação em 544 nanômetros e o comprimento de onda de emissão em 590 nanômetros para um leitor de microplacas multi-rótulo.

Use um hemocitômetro para contar o número de células. Em seguida, ressuspenda as células endoteliais em meio de cultura endotelial completo e semeie as células em uma placa de 96 poços em 100 microlitros de meio de crescimento de células endoteliais. Para atingir uma concentração de 0,1 a dez microgramas por mililitro, adicione 100 microlitros de meio contendo antibiótico.

Monitore a viabilidade das células a cada dois dias usando uma objetiva de 20 vezes sob microscópio óptico. Continue cultivando as células por mais 10 a 14 dias e substitua o meio contendo antibiótico a cada dois ou três dias, dependendo do crescimento celular. Em seguida, adicione 10 microlitros de reagente MTS em cada poço e misture o reagente.

Incube a placa de 96 poços a 37 graus Celsius por quatro horas. Após quatro horas, agite brevemente o prato em uma coqueteleira. Em seguida, leia os absorventes das células tratadas e não tratadas usando um leitor de placas a 490 nanômetros.

Um dia antes da transdução lentiviral, semeie as células endoteliais em um mililitro de meio completo. Espere até que as células atinjam 50 a 80 por cento de confluência para transdução lentiviral Antes de abrir o tubo, gire a suspensão lentiviral a 200 vezes g por 30 segundos para evitar transbordamento. Em seguida, adicione brometo de hexidimetrina às células para ajustar a uma concentração final de oito microgramas por mililitro e gire suavemente a placa.

Adicione o lentivírus às células e gire novamente a placa suavemente por 30 segundos para garantir a mistura adequada. Para aumentar a eficiência da transdução lentiviral, centrifugue a mistura célula-viral a 300 vezes g por 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incube a mistura célula-vírus a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, descarte a partícula viral contendo meio e substitua por meio de cultura pré-aquecido, fresco e completo. No segundo dia, inicie a seleção de puromicina. Substituir o meio de cultura completo por um meio contendo puromicina.

Após a seleção de puromicina, colha as células. Seguindo as instruções do fabricante, isole o RNA das células usando um kit de isolamento de RNA. Use um kit de transcrição reversa para isolar o DNA complementar com os micro-RNAs selecionados.

Em seguida, configure a reação de PCR quantitativa. Para monitorar a internalização das vesículas extracelulares pelas células endoteliais, as vesículas verdes marcadas com PKH67 foram analisadas por microscopia confocal. No ensaio, faloudina e hookst 33342, cujas colorações atuam em vermelho e azul nucleídeo, respectivamente, são usadas para rastrear a translocação das vesículas dentro das células endoteliais.

As imagens confocais obtidas mostram a pronta captação das vesículas pelas células endoteliais após quatro horas. Em seguida, para estudar a permeabilidade da capacidade de difusão da monocamada de células endoteliais da rodamina b isotiosionadextrana foi analisada. Este ensaio mostra que a incubação das células endoteliais com 50 e 100 microgramas por mililitro de vesículas extracelulares aumentou a permeabilidade da monocamada endotelial após duas horas.

No gráfico, o eixo x representa a concentração das vesículas extracelulares e o eixo y representa as mudanças de dobra na permeabilidade endotelial lidas em 590 nanômetros. Em seguida, para determinar a sensibilidade das células endoteliais com o tratamento com puromicina, uma curva de morte foi traçada. A curva de morte mostra que menos de 0,15 micrograma por mililitro de puromicina é suficiente para matar todas as células.

Além disso, para determinar o nível de expressão do micro-RNA451a isolado das células endoteliais, foi feita PCR quantitativa em tempo real. Os gráficos de barras mostram superexpressão significativa do transcrito de micro-RNA451a contra o gene U6 da governanta. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças infecciosas explorarem o papel dos Evs na interação com o hospedeiro e na comunicação celular por meio da transferência de material genético. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a captação de EV pelas células receptoras e como investigar a função de RNA na regulação das células endoteliais.

Não se esqueça de que trabalhar com os parasitas da malária e sangue humano pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar luvas, jaleco e trabalhar sob um capuz estéril, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.