Name: Recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda o método zFRAP para analisar a frouxidão da cromatina em zigotos sem comprometer seu desenvolvimento até o termo. Esta técnica de biologia do desenvolvimento permite estudar o potencial embrionário de forma não invasiva.

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Agradecemos Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida fornecendo comentários críticos e suporte técnico. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo programa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia para promover a reforma das universidades nacionais, m.o.; a sociedade japonesa para a promoção da ciência (16H 02593), Asada Science Foundation e da Fundação de ciência Takeda para TW Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade de Yamanashi. O protocolo foi aprovado pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal da Universidade de Yamanashi (número de licença: A24-50). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia tribromoetanol, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Uma visão geral ilustrada dos procedimentos e horário são mostrados na Figura 1 e tabela 1, respectivamente.
1. preparação do RNA mensageiro (In Vitro e transcrição de mRNA eGFP-H2B)
<ol><li>Linearizar 5 µ g de modelo DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 com 30 U de não eu em 50 µ l a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Colete 1,5 µ l de DNA digerido para confirmação se completamente digerido por eletroforese.<ol>
<li>Aplica 1,5 µ l e 3 a 5 µ l de DNA não digerido com carregamento de tintura para o poço do gel de agarose 2%, respectivamente e sujeitos a electroforese. Nota: Se completamente digerida, é observada uma única banda (aprox. 5 kb). DNA não digerida é usado como um controle, que aparece em uma posição diferente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 151,5 µ l de DDQ2O e 200 µ l de álcool isoamílico/fenol/clorofórmio (25:24:1) para o restante digerido DNA.<ol>
<li>Misture vigorosamente pelo vórtice.</li>
		<li>Centrifugar a velocidade máxima durante 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperar o sobrenadante e em seguida, adicione 200 µ l de clorofórmio.<ol>
<li>Misture vigorosamente pelo vórtice.</li>
		<li>Centrifugar a velocidade máxima por 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperar o sobrenadante e adicionar 20 µ l de acetato de sódio 3M e 1,5 µ l de ethachinmate.<ol>
<li>Misture vigorosamente pelo vórtice.</li>
		<li>Adicione 550 µ l de etanol 100% e em seguida, misture vigorosamente pelo vórtice.</li>
		<li>Centrifugar a velocidade máxima por 15 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e em seguida, lave a pelota com etanol a 70%.</li>
		<li>Seca o sedimento por evaporação durante 5-10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolva o precipitado do Plasmídeo em 8 µ l de água livre de nuclease.</li>
	<li>Avaliar a concentração do plasmídeo (concentração esperada é de 300-500 ng / µ l) com nanodrop, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Realize em vitro transcrição de mRNA codificação eGFP-H2B com 1 µ g de DNA purificado como um modelo em 20 µ l de volume total da reação, seguindo as instruções do fabricante.<ol>
<li>Após a transcrição em vitro , adicione 36 μL de água, em seguida, recuperar 1,5 µ l de 56 µ l de mRNA sintetizado para análise por eletroforese (sem poli A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o rejeito de A poli para mRNA sintetizado em um volume de reação de 100 µ l, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Adicionar 60 µ l de solução de precipitação de cloreto de lítio para o poli uma cauda mRNA de eGFP-H2B e misture vigorosamente.<ol>
<li>Legal a-30 ° C durante 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a velocidade máxima por 15 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e em seguida, lave a pelota com etanol a 70%.</li>
		<li>Seca o sedimento por evaporação durante 5-10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolva a pelota com 20 µ l de água livre de nuclease por aquecimento a 55 ° C por 30 min.</li>
	<li>Avalie a concentração do mRNA precipitado com nanodrop. Dilua a 500 ng / µ l com água livre de nuclease e loja a-80 ° C até o uso.</li>
	<li>Confirmar a produção de mRNA preferencial; submeta a 1 µ l de mRNA com/sem (obtidos em 1.8.1 e 1,12 passos, respectivamente) poli uma cauda misturada com 1,5 µ l de brometo de etídio 0,1 mg/mL e 3 µ l de corante de carregamento da amostra para a análise de eletroforese. Volume aplicado foi de 5,5 µ l. Nota: Se A poli rejeito foi bem sucedido, a banda mudou em comparação com o mRNA sem poli um rejeito deve ser observada (Figura 2A).</li>
</ol>2. preparação de ratos machos vasectomizados
<ol><li>Pese os ratos masculinos ICR em 8-12 meses usando uma escala de peso.</li>
	<li>Intraperitonealmente injete camundongos machos com anestesia de 1,2% tribromoetanol 0,7 - 0,9 mL. Nota: A quantidade de anestesia depende do tamanho do mouse. Por exemplo, um mouse pesando 40 g é injetado com 0,8 mL de anestesia tribromoetanol.</li>
	<li>Molhe a baga com etanol a 70%.</li>
	<li>Faça um pequeno corte (3-5 mm) sobre a baga e em seguida, fazer uma incisão na parede muscular, com a ajuda de uma tesoura. Nota: Tesouras e pinças devem ser limpos com álcool 70% antes de iniciar a cirurgia.</li>
	<li>Pega uma almofada de gordura com pinça e puxá-lo suavemente. Em seguida, o testículo e deferentes aparecem. Nota: O canal deferente é um tubo em U e com uma embarcação de sangue vermelha.</li>
	<li>Amarrar o canal deferente , em dois pontos com suturas cirúrgicas e então cortar a parte do meio entre os pontos vinculados.</li>
	<li>Suavemente empurre para trás a almofada de gordura e testículo na baga.<ol>
<li>Repita a operação com o restante do testículo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costure a parede muscular com dois pontos com sutura cirúrgica.</li>
</ol>3. FERTILIZAÇÃO IN VITRO
<ol><li>Injetar 8 - 10 - semanas de idade B6D2F1 feminino (BDF1) ratos intraperitonealmente com 7,5 IU gonadotrofina coriônica equina (eCG) e gonadotrofina coriônica humana (hCG) no intervalo de 46-50 h.</li>
	<li>Prepare-se gotas de 300 µ l humano tubal fluid (HTF)8 meios para capacitação e inseminação 1 dia antes da fertilização in vitro em um prato de 30 mm, cobrir estas gotas com o óleo mineral na bancada do laboratório e então preincubate na incubadora durante a noite.</li>
	<li>Sacrifica o amadurecido camundongos ICR machos por deslocamento cervical. Dissecar a cauda epidídimo com uma agulha de 27-G e coletar o espermatozoide. Cultura-los para capacitação em 300 µ l de mídia HTF para 1-2 h a 38 ° C.</li>
	<li>16 h após a injeção de hCG, sacrificar ratos fêmeas super ovularam por deslocamento cervical. Transferência da ampola do oviduto em óleo mineral, ao lado de mídia HTF e então desenhar células do cumulus e complexo de oócitos desta ampola do oviduto, uma agulha 30G no meio de inseminação-HTF pré-incubada. Nota: Alguns ratos fêmeas não mostram muitas vezes ovulação apesar do tratamento de super ovulação. Ampola de oviduto alargada é um sinal de ovulação.</li>
	<li>Após a capacitação, transferência de 2-3 µ l do espermatozoide capacitado em mídia de inseminação-HTF em que foram coletados os oócitos ovulated.</li>
	<li>1 h após a inseminação, recolher os zigotos fertilizados e tratá-los com hialuronidase em 100 µ g/mL por 10 min em media de9 CZB. Nota: Quando a inseminação é realizada corretamente, 1 h após a inseminação, zigotos fertilizados com o corpo polar 2nd são observados. Se menos ou baixa qualidade esperma é usada, apenas pouco zigotos com o corpo polar 2nd são observados. Além disso, se muitos espermas são utilizadas para a inseminação, poliespermia ocorre. Inseminação adequada leva a zigotos com pró-núcleos masculinos e femininos. Usando estes critérios, é possível encontrar se a inseminação é feita bem ou não.<ol>
<li>Após a lavagem nos meios CZB, submeta os zigotos com um segundo corpo polar a microinjeção com eGFP-H2B mRNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparação da câmara e Microinjection pipetas
<ol><li>Dilua a codificação eGFP-H2B usando água nuclease livre para obter uma concentração de 250 ng / µ l de RNA.</li>
	<li>Prepare-se 2-3 gotas de PVP-HTF e eGFP-H2B gotas mRNA, e 5-6 gotas de Hepes buffer CZB (H-CZB) gotas sobre o prato de 60 mm. Cobrir estas gotas com óleo mineral. Nota: Estas preparações podem ser executadas na bancada do laboratório. Não há nenhum requisito para usar o armário de fluxo de ar laminar.</li>
	<li>Puxar o vidro de borosilicato com um puxador de micropipeta (por exemplo, P = 500, calor = 825, puxar = 30, vel = 120 e tempo = 200)</li>
	<li>Depois de quebrar a ponta da pipeta, dobre a pipeta de microinjeção de vidro puxado perto da ponta (−300 µm volta) em torno de 30 °, usando um microforge.</li>
</ol>5. microinjection
<ol><li>Desligue o aquecedor da placa no palco do micromanipulador para impedir a matança de zigotos com uma sirene piezelétrica durante a injeção de mRNA.</li>
	<li>Lavar e revestir o interior de agulhas de injeção em tampão HEPES-HTF contendo 10% PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>Recolher os zigotos fertilizados com um corpo de 2nd polar (Figura 2B) e transferência de zigotos de 20-25 para a câmara do microscópio estágio anexado com um micromanipulador.</li>
	<li>Preencha o mRNA eGFP-H2B diluídos em capilares de vidro de borosilicato das pontas.</li>
	<li>Segure o zigoto com uma pipeta de exploração e depois quebrar a zona pelúcida e a membrana citosólica com uma unidade de piezo.</li>
	<li>Injetar cerca de 10 pL do mRNA para o citoplasma de zigotos. Termine a injeção de mRNA dentro de 10 min para evitar danos causados pelo cultivo mais zigotos fora da incubadora. Nota: O volume de injeção deve ser tão grande quanto o corpo polar 2nd . Se a quantidade de mRNA injetado é muito grande, é possível causar a fração livre eGFP-H2B, que pode afetar a fração móvel.</li>
	<li>10 min depois da microinjeção, lavar pelo menos 3 gotas e em seguida cultura zigotos injetados no CZB a 38 ° C até análise de zFRAP.</li>
</ol>6. zFRAP análise
<ol><li>1 h antes da análise de zFRAP, ativar o laser e a chapa quente anexado ao palco do microscópio confocal. Definir a temperatura a 38 ° C.</li>
	<li>Coloque 6-10 µ l de meios CZB tampão HEPES quente e coberto com óleo mineral sobre o prato de fundo de vidro de 60mm o aquecedor até coleção de zigoto.</li>
	<li>8 - 12 h após a inseminação, coletar 5-10 eGFP-H2B-expressando zigotos e transferência em 6-10 µ l de pré aquecido média gota CZB tampão HEPES. Nota: Para evitar cultivo mais tempo fora da incubadora, 5-10 eGFP-H2B-expressando zigotos foram usados em cada análise. zigotos de 5 a 10 podem ser analisados dentro de 1h.</li>
	<li>Defina as condições de branqueamento e de imagem de acordo com as instruções do fabricante. O caso um laser confocal microscópio (Tabela de materiais) é mostrado abaixo:<ol>
<li>Uso 60 X lente de petróleo (60 X 60 X / 1.35 óleo). Nota: As lentes com maior ampliação (maior abertura numérica) Mostrar maior sensibilidade.</li>
		<li>Defina velocidade de digitalização como 4,0 µs/Pixel e tamanho como "512" em "Configuração de aquisição" (Supplemental Figura 1).</li>
		<li>Aumente o zoom Digital para "5" (Supplemental Figura 1). Nota: Um zoom maior é necessário para reconhecer se deriva de foco ocorre ou não.</li>
		<li>Abrir lista de tintura (Supplemental Figura 1) e em seguida escolha "EGFP". Definir o tempo de observação como 1.6 s (interval é definido como "corrida livre" configuração) (Supplemental Figura 1) Nota: Mais pontos de observação podem causar dados mais detalhados, mas também pode causar fototoxicidade. Na análise zFRAP, um momento de observação s 1.6 parece ser suficiente para detectar a assimetria parental de frouxidão de cromatina.</li>
		<li>Defina o número de fotos como o 12 no total (Supplemental Figura 1).</li>
		<li>Iniciar Painel de "Configuração de estímulo" e clique em "Main" na UseScanner. Conjunto de digitalização velocidade como 10.0 µs/Pixel. Clique em "Ativação na série" e em seguida, defina preligação como "3 quadros" e o tempo de ativação como "5 s" (Supplemental Figura 1).</li>
		<li>Clique em "Foco x 2" e definir o foco e depois "parar".</li>
		<li>Conjunto de branqueamento e poder do laser de imagem (477 nm) em µW 110 e 15, respectivamente, por ajuste "gage poder laser" (Supplemental Figura 1). Nota: Branqueamento muito forte pode causar uma maior área branqueada, o que causa dificuldades para a análise quantitativa. Para a medição da potência do laser, use um medidor de energia. É importante confirmar a potência do laser para evitar o efeito da deterioração relacionadas ao tempo da potência do laser.</li>
		<li>Clique em "Clip Rect" (Supplemental Figura 1) no painel de configuração do estímulo. Definir a região de interesse (ROI; vermelho; ROI #1B) como 40 x 40 pixels (7.6 µm.2). Preparar uma região de referência (REF; verde; ROI #2) e um plano de fundo (BG; azul; ROI #3) usando "copiar o ROI" e "colar ROI" (botão direito do mouse o mouse). Nota: O tamanho do Pixel pode ser definido através do "Gerenciador de ROI", que pode ser chamado clicando o botão direito do mouse quando o cursor está sobre o ROI. ROIs maiores são pensados para ser melhor, pois eles podem padronizar a dispersão da nota de zFRAP. No entanto, muito grande de um ROI não pode ser usado para esta análise porque torna difícil evitar o corpo de precursor do nucléolo (NPB). H2B-eGFP neste compartimento foi pensado para ser livre da cromatina e mostrou notável de mobilidade superior3. ROI e REF áreas devem ser separadas tanto quanto possível. Se estas duas regiões são próximos, branqueamento também pode afetar a região de REF.</li>
		<li>Clique em "Live" na barra de ferramentas e inicie o "Live Trace" (Supplemental Figura 1). Nota: Ao vivo enredo indica a intensidade do sinal de fluorescência dentro cada ROI e é usado para ajustar a potência do laser usando HV. Observe que se o ROI não é selecionada, sem intensidade seria detectada na painel de trama ao vivo.</li>
		<li>Determinação da posição de ROI Nota: ROI pode ser movido arrastando para a posição desejada no pró-núcleos. (1) ser certo para evitar o nucléolo e (2) se encaixa o ROI todo o nucleoplasma. Não contém a região fora da área da membrana nuclear (citoplasma) em ROI. A localização do eGFP-H2B é altamente restrito para o nucleoplasma para que seja fácil de encontrar se ROI contém citoplasma ou não, a fluorescência de eGFP-H2B. Pró-núcleos masculinos tendem a ser maiores que as fêmeas, que muitas vezes são localizadas perto do corpo de polar 2nd . Enquanto estiver usando estes critérios, julga os pró-núcleos masculinos ou femininos.</li>
		<li>Clique em "Foco x 2" (Supplemental Figura 1) e, em seguida, ajuste o HV poder gage do canal para EGFP em intensidade de fluorescência para em torno de 2000 (intensidade de fluorescência pode ser vista na janela "trama ao vivo").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique em "Tempo" e, em seguida, "XY" (Supplemental Figura 1) para iniciar a análise de zFRAP. Nota: Se o botão "Time" é devidamente selecionado, "t" aparece no botão "XY".<ol>
<li>Clique "Série feita" (Supplemental Figura 1), que aparece após FRAP imaging perto do botão"XY" e em seguida, obter dados analisados FRAP.</li>
		<li>Salve o arquivo "2D imagem de exibição XXXXX" como um arquivo nomeado preferencial (oib. formato de arquivo) por "salva como" (Ctrl + Shift + S pode ser também usada).</li>
		<li>Selecione o ROI, REF e BG e clique (Ctrl + A pode ser usada também) "Análise de série" na janela "imagem de exibição 2D".</li>
		<li>Obter dados de linha FRAP e clique em "salvar" botão na janela da trama ao vivo. Nota: Linha dados quantitativos FRAP é salvo como um arquivo csv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sem controle de zFRAP, coloque um pouco de zigotos injetados com mRNA na gota, que é perto da borda dos pratos vidro inferior para evitar o efeito da observação da fluorescência.</li>
</ol>7. dados cálculo
<ol><li>Enquanto estiver usando os dados quantitativos obtidos, fazer o gráfico da "curva de recuperação" e "fração móvel" pelo Excel, conforme as referências3,7 , com algumas modificações (arquivo excel Veja abaixo e suplementar).</li>
	<li>Calcule a intensidade relativa subtraindo o valor da BG dos de ROI e REF em 12 fotos para cada ponto de tempo.</li>
	<li>Divida o valor do ROI por isso do árbitro. Como resultado, podem ser obtidos 12 escores padronizados intensidade relativa em cada ponto de tempo.</li>
	<li>Calcule a média da Pontuação relativa para ROI em 3 imagens tiradas antes foto branqueamento.</li>
	<li>Calcule a taxa de recuperação. Divide que o 12 obtidos escores relativos para ROI nas imagens tomadas em cada ponto do tempo (Obtido em 7.1.2.) pela média da Pontuação relativa antes foto branqueamento (obtidos em 7.1.3.). Desenhar a curva de recuperação com o uso de partituras (Figura 2E).</li>
	<li>Calcule a taxa de branqueamento. Nota: Branqueamento taxa (%) = 100 - taxa de recuperação de 4th de imagem.</li>
	<li>Calcule a fração móvel (MF) usando a fórmula como segue10,11,12 MF (%) = 12th taxa de recuperação (no ponto final) - taxa de recuperação 4th / branqueamento taxa × 100.</li>
</ol>8. transferência de embriões
<ol><li>Amigo amadurecidas fêmeas ICR em 8-12 meses com vasectomizado camundongos machos do ICR a noite antes de transferência de embrião por deixá-los passar a noite na mesma jaula.</li>
	<li>Recolha os embriões que foram analisados zFRAP e determinado a desenvolver para o estágio de duas células.</li>
	<li>Intraperitonealmente injete camundongos fêmeas com anestesia de 1,2% tribromoetanol 0,7 - 0,9 mL ou com 0.35 - 0,45 mL de 0.75/4/5mg/kg medetomidina/midazolam/butorfanol misto agentes antes da transferência de embriões. Nota: O volume da anestesia é determinado pelo peso corporal de ratos. Tribromoetanol: 0,2 mL/10 g de peso corporal; medetomidina/midazolam/butorfanol misturado agentes: 0,1 mL/10g de peso corporal.<ol>
<li>Transferi estes embriões de duas células estágio para os ovidutos de camundongos fêmeas pseudopregnant do ICR com um plugue vaginal em 0,5 dias post coitum (dpc).</li>
		<li>Após a transferência de embriões, colocar os camundongos fêmeas no aquecedor definida a 37 ° C até que eles acordem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dpc 18,5, sacrificar a mãe de aluguel por deslocamento cervical e recuperar os filhotes derivados de zigotos zFRAP-analisado por cesárea. Alguns dos filhotes recuperados foram entregues para a mãe adotiva e seus pesos de corpo foram avaliados a cada semana.</li>
</ol>

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<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Como revelado neste estudo, a análise zFRAP não causa danos críticos para o desenvolvimento do termo, sugerindo que este método é uma ferramenta muito útil para revelar a associação entre eventos moleculares e o potencial do desenvolvimento embrionário. Durante a reprogramação, para as duas câmaras como estado de pilhas do ES, pelo qual o potencial diferencial dessas células torna-se tão elevado como aquele do estágio de duas células, frouxidão de cromatina de mudanças em que comparável com embriões de duas células estág...

Após a fertilização, a estrutura da cromatina é alterada dinamicamente, e estrutura da cromatina zigóticos é então eventualmente estabelecido1,2. Durante este período, em pró-núcleos paternos, proteínas da cromatina dominante é mudada de protamina na histona. A cromatina resultante é extremamente diferente dos espermatozoides e ovócitos femininos em vários pontos (por exemplo, composição variante de histona, modificação de histona). Assim, a cromatina foi formada é pensada para ser importante para o posterior desenvolvimento embrionário. No entanto, apesar dos esforços para revelar os detalhes da estrutura da cromatina zigóticos durante longos períodos, métodos para avaliar a qualidade de zigotos ou para prever seu desenvolvimento termo na fase de uma célula, analisando sua estrutura da cromatina nunca foram estabelecido.
No estudo anterior, é descoberto que zigotos tem uma estrutura extremamente afrouxada cromatina3. Atualmente, frouxidão de cromatina ou abertura é acreditada para ser um importante factor de diferenciação celular potencial de células estaminais embrionárias (ES)4. Pilhas do ES não apresentam homogeneidade na natureza, mas são bastante heterogêneas; em colônias de células ES, alguns transitoriamente adquirem um maior potencial de diferenciação comparável aos blastômeros de embriões do estágio de duas células. Durante esta transição para a dois-célula como estado, frouxidão de cromatina no ES células no que é comparável com o estágio de duas células de embriões5alterações. Assim, frouxidão de cromatina parece ser importante para o potencial de diferenciação celular e é possível que abrir extensivamente cromatina em zigotos é útil para a avaliação do potencial de desenvolvimento zigóticos.
Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese desde que esse método permite o posterior desenvolvimento e até mesmo termo desenvolvimento6. Como um dos métodos de imagem ao vivo, FRAP análise tem sido usado para examinar a frouxidão de cromatina embriões pré-implantação e ES células3,4,5. Se frouxidão zigóticos cromatina pode ser analisado sem um efeito prejudicial sobre o termo desenvolvimento pela análise FRAP, pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da qualidade dos embriões na fase de uma célula. No entanto, os efeitos sobre o desenvolvimento do termo por esse método experimental não foram examinados. Recentemente, um sistema experimental usando FRAP avaliar frouxidão zigóticos cromatina foi desenvolvido. Porque este era um novo sistema de observação de zigotos, ele foi denominado como zigóticos FRAP (zFRAP). zFRAP não afetou criticamente termo desenvolvimento e tem sido relatado em outro lugar7. Neste relatório, é descrito o protocolo desse método experimental.

<table><tbody><tr><td>O microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 também pode ser usado para análise FRAP (referência #7)</td></tr><tr><td>Placa térmica</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Micro manupilador</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Micro Micromanipulador Pieze</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 35 mm</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>estilo 35 x 100 mm; para FIV</td></tr><tr><td>placa de cultura de 60 mm</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>estilo 60 x 15 mm; para cultura de embriões</td></tr><tr><td>Placa de cultura de 50 mm</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>estilo 50 x 9 mm; para manipulação no palco</td></tr><tr><td>Placa de fundo de vidro de 50 mm</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>placa de 50 mm, tamanho do orifício de 27 mm e phi; para análise FRAP</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Produtos químicos de espicialidade orgânica</td><td>625071</td><td>Para análise FRAP nas placas de fundo de vidro</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>Para fertilização in vitro e capilar de vidro de cultura de embriões</td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Para manuseio de zigotos de camundongo</td></tr><tr><td>Vidro de borosilicato</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>Para microinjeção de mRNA</td></tr><tr><td>Extrator de micropipett</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97/IVF</td><td>Para a preparação da injeção ou retenção de neadle (diâmetro externo: 80 &micro; m, diâmetro interno: 10 &micro; m)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microforja</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Kit de transcrição</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Poly (A) kit de rejeito</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP solution 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES bufferizado HTF contendo 10%</td></tr><tr><td>PVP Sodium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr>Modelo de plasmídeo <td>pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>para mRNA eGFP-H2B (referência #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Sample loading Dye&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>Para eletroforese de mRNA transcrito in vitro</td></tr><tr><td>Fenol clorofórmio álcool isamílico</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Não I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Medidor de potência ótica</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; Medidor de potência para potência do laser</td></tr><tr><td>Microscópio estereomico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese. Recentemente, frouxidão de cromatina ou abertura tem demonstrada ser envolvido no potencial de diferenciação celular de células-tronco embrionárias pluripotentes. Anteriormente foi relatado que em comparação com células-tronco embrionárias, zigotos abrigam uma estrutura extremamente afrouxada cromatina, sugerindo sua associação com sua totipotência. No entanto, até agora, isso não foi resolvido se essa estrutura extremamente solta/abrir cromatina é importante para o potencial do desenvolvimento embrionário. No presente estudo, para examinar esta hipótese, foi desenvolvido um sistema experimental no quais zigotos que foram analisados por fluorescência recuperação após o clareamento foto pode desenvolver a termo sem qualquer dano significativo. Importante, este sistema experimental precisa de apenas um aquecedor térmico-placa além de um laser confocal microscópio. As conclusões deste estudo sugerem que recuperação de fluorescência após análise de análise (FRAP) foto-branqueamento pode ser usado para investigar se os eventos moleculares na cromatina zigóticos são importantes para o desenvolvimento do termo.

análise de zFRAP com eGFP-H2B
Devidamente produzida mRNA codificação eGFP-H2B, que é visto como uma banda deslocou causada por poli um rejeito (Figura 2A), foi injetado no citoplasma de zigotos com um corpo polar 2 em 1-3 h após a inseminação (Figura 2B). 8 a 12 h após a inseminação, zigotos com 2 pró-núcleos mostrando a expressão de eGFP-H2B foram coletadas e submetidas a...

Frouxidão de cromatina parece estar envolvido no desenvolvimento potencial dos blastómeros. No entanto, não se sabe se a frouxidão de cromatina pode ser usado como um índice confiável para o potencial do desenvolvimento de embriões. Aqui, tem sido descrito um sistema experimental no qual zigotos de frouxidão-avaliada de cromatina podem desenvolver à gestação completa.

Recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

O objetivo geral deste FRAP zigótico ou zFRAP é examinar a associação entre a frouxidão da cromatina zigótica e o potencial de desenvolvimento embrionário a termo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como o desenvolvimento embrionário. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que o zigoto analisado se desenvolva até o fim sem danos significativos.A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas da análise zFRAP são difíceis de aprender porque a configuração da condição experimental e a operação para esta análise são muito complexas. Depois de preparar o RNA eGFP-H2B de acordo com o protocolo de texto, use água livre de nuclease para diluí-lo a 250 nanogramas por microlitro. Em um prato de 60 milímetros, coloque duas a três gotas de PVP-HTF, cinco a seis gotas de CZB tamponado com Hepes e mRNA eGFP-H2B.Em seguida, use óleo mineral para cobrir as gotas. Usando um extrator de pipeta, puxe o vidro de borossilicato. Depois de quebrar a ponta, use uma microforja para dobrar a pipeta de vidro em cerca de 30 graus.Antes da microinjeção, confirme se o aquecedor da placa no estágio do micromanipulador está desligado para evitar matar os zigotos durante a injeção de mRNA. Em seguida, usando 10%PVP-HTF, lave e cubra o interior das agulhas de injeção. Em seguida, a partir das pontas, preencha os capilares de vidro com o mRNA eGFP-H2B diluído.Colete os zigotos fertilizados com um segundo corpo polar e transfira 20 a 25 deles para a câmara do estágio do microscópio. Em seguida, com uma pipeta de retenção, segure o zigoto e quebre a zona pelúcida e a membrana citosólica com um acionamento piezoelétrico. Injete cerca de 10 picolitros de mRNA no citoplasma de cada zigoto.Complete as injeções em 10 minutos para evitar danos causados pela cultura dos zigotos fora da incubadora. 10 minutos após a microinjeção, lave os zigotos em pelo menos três gotas de CZB e cultive-os a 38 graus Celsius até a análise FRAP. Uma hora antes da análise zFRAP, ligue o laser e a placa quente conectada ao estágio do microscópio confocal.Defina a temperatura para 38 graus Celsius. Em um prato com fundo de vidro de 60 milímetros, pipete de seis a 10 microlitros de meio CZB tamponado com Hepes e cubra-o com óleo mineral. Em seguida, aqueça o prato no aquecedor até a coleta do zigoto.Para facilitar a localização do zigoto com o microscópio confocal, é importante colocar as gotas em todo o centro da placa. Oito a 12 horas após a inseminação, colete de cinco a 10 zigotos que expressam eGFP-H2B e transfira-os para uma gota de seis a 10 microlitros de meio CZB tamponado com hepes pré-aquecido. Para realizar uma análise quantitativa precisa, é importante colocar o zigoto em direção ao centro das gotas de CZB tamponadas com Hepes.Defina as condições de branqueamento e imagem de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, em Configuração de aquisição, defina a velocidade de digitalização para quatro microssegundos por pixel e o tamanho para quinhentos e doze. Aumente o zoom digital para cinco, abra o DyeList"e escolha eGFP"Em seguida, defina o tempo de observação para um ponto seis segundos e o número de fotos para 12.Em seguida, inicie o Stimulus Setting"painel e em UseScanner"clique em Principal"Defina a velocidade de varredura para 10 microssegundos por pixel. Clique em Ativação em série"Definir pré-ativação"para três quadros e tempo de ativação para cinco segundos. Em seguida, clique em Foco x2"e clique em Parar"No painel de configuração de estímulo, clique em Clip Rect"Defina o ROI para 40 por 40 pixels.Clique em Tempo"e XY"Em seguida, use um medidor de potência óptica para acessar a potência do laser. É importante ter as luzes apagadas ao medir o laser. Depois de ajustar o medidor de laser para definir a potência do laser de branqueamento e imagem, na barra de ferramentas, clique em Ao vivo"e inicie Live Plot"Coloque o óleo na lente objetiva.Coloque a câmara no palco e encontre os zigotos nas gotas. Depois de encontrar zigotos, determine a posição do ROI clicando em Foco x2 "E, em seguida, na janela Live Plot", ajuste o medidor de potência HV para a intensidade de fluorescência do canal eGFP "para cerca de 2.000. Para iniciar a análise zFRAP, clique em XY"Após a análise FRAP, clique em Série concluída"Obtenha os dados analisados FRAP e clique em Salvar como"para salvar o arquivo Imagem de visualização 2D"como um arquivo nomeado preferido.Use Copiar"ROI e Colar"ROI para preparar uma região de referência e para o plano de fundo, respectivamente. Em seguida, selecione ROI, REF e BG e, em seguida, na janela de imagem 2D View, clique em Análise de Série"Obter dados RoFRAP e, em seguida, na janela Live Plot", clique no botão Salvar"botão. Realize cálculos de dados de acordo com o protocolo de texto.Oito a 12 horas após a inseminação, zigotos com dois pronúcleos mostrando a expressão de eGFP-H2B" foram coletados e submetidos à análise de zFRAP. Após o branqueamento, a intensidade do sinal fluorescente eGFP-H2B recuperou-se ligeiramente devido ao influxo de eGFP-H2B na ROI da área não branqueada no nucleoplasma. As curvas de recuperação revelam que os pronúcleos masculinos se recuperaram mais rapidamente e com mais frações móveis do que os pronúcleos femininos.Conforme demonstrado nestas imagens e gráfico, após a análise de zFRAP, os zigotos lavados e cultivados em meio CZB desenvolveram-se até o estágio de blastocisto sem danos significativos. Para analisar o desenvolvimento a termo, embriões no estágio de duas células foram transferidos para os ovodutos de mães pseudo-grávidas. Conforme relatado nesta tabela, a taxa de natalidade dos embriões analisados com zFRAP foi ligeiramente, mas significativamente menor do que a dos embriões intactos, mas foi a mesma do controle sem zFRAP.Além disso, os filhotes derivados dos zigotos analisados pelo zFRAP pareciam saudáveis e totalmente desenvolvidos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aguardar a outra expansão. Toda a objeção orçamentária para evitar desvio de foco.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como analisar a frouxidão da cromatina em zigotos.

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

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A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

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Aprenda o método zFRAP para analisar a frouxidão da cromatina em zigotos sem comprometer seu desenvolvimento até o termo. Esta técnica de biologia do desenvolvimento permite estudar o potencial embrionário de forma não invasiva.

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Recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo

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