Name: Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Aprenda a otimizar a incorporação de aminoácidos não canônicos em células de mamíferos para mapear sítios de ligação em GPCRs e realizar marcação bioortogonal. Este método avança o estudo da dinâmica estrutural de receptores em células vivas.

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Este trabalho foi fundado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sob bolsas CO822/2-1 (programa de Emmy Noether) e CO822/3-1 ao I.C.

Os autores não têm nenhum conflito para declarar.

O protocolo descreve um ensaio simples e confiável para avaliar a eficiência de pares ortogonais para a incorporação de ncAAs proteínas expressado em células de mamíferos. A principal vantagem deste método em relação aos ensaios amplamente utilizados, com base na FACS é que permite a preparação simultânea e medição de um maior número de amostras e fornece dados que facilmente são analisados usando um software comum. A disponibilidade de um rendimento médio método para analisar pares ortogonais em células de mamíferos é m...

A incorporação genética de sondas químicas em proteínas é um método poderoso para facilitar a investigação dos aspectos estruturais e dinâmicos da função da proteína diretamente no contexto nativo da célula ao vivo. Hoje em dia, centenas de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) equipados com os mais diferentes grupos químicos podem ser site-specifically incorporadas em proteínas de biossíntese1,2,3,4. Entre eles, reencontra-se foto-sensível ncAAs como crosslinkers-foto5, foto-enjaulado6,7,8,9 e foto-comutável aminoácidos10, 11, ácidos aminados, tendo tensas alcenos e alcinos por catalizador-livre opaco química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos carregando dansyl18, cumarina9,19e prodan20,21 fluorophores e aminoácidos equipados com outras sondas biofísicas como bem como com post modificações translacionais1,2,3,4,22,23,24,25.
A codificação genética de um ncAA é ativada por um dedicado amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) emparelhado com um supressor-tRNA cognato, que incorpora a ncAA em resposta a um codão stop âmbar durante a síntese ribossomal regular. pares de ncAARS/tRNA são projetados para serem ortogonais no organismo hospedeiro, ou seja, não a Cruz-conversa com os pares endógenos. A técnica é bem estabelecida, tanto em procariontes e eucariontes hospedeiros e células facilmente aplicáveis aos mamíferos. Pares para a incorporação da ncAA em células de mamíferos são baseados em três principais sistemas ortogonais: sistema de correntes, que combina o TyrRS de e. coli26 com um supressor de correntes âmbar de b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / par deBstYam), o sistema (parCELeuRS/tRNALeuCUA ) Escherichia coli de leucyl6,18,28 e o sistema de pyrrolysyl de Archaea (PylRS/tRNA Pyl par)3, pelo qual o tRNAPyl é um supressor natural de âmbar. Em geral, cada ncAA é reconhecido por um ncAARS especializado. Dependendo da estrutura do ncAA, a ncAARS é obtido através de uma evolução dirigida de LeuRS, TyrRS ou PylRS, embora algumas sintetases podem aceitar mais de um ncAA.
O par ortogonal é importado para as células simplesmente usando um vetor do plasmídeo. Mais comuns e eficientes plasmídeos são bicistronic e codificam para a sintetase e o tRNA formando o par ortogonais29. Um plasmídeo segundo a codificação da proteína de interesse, tendo um códon âmbar no local designado para a modificação é co transfectada. O ncAA é simplesmente adicionado ao meio de crescimento de célula. No entanto, diferentes grupos especializados muitas vezes usam diferentes variantes do plasmídeo construções mesmo para a incorporação do ncAA mesmo. Construções diferem no arranjo dos genes no vetor, tipo da sintetase, uso de códon no gene da sintetase, uso do promotor, variante do tRNA e número de fitas de expressão do tRNA. Além disso, a eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode variar drasticamente devido a eficiência catalítica diferente dos sintetases diferentes, a qualidade do tRNA e outros fatores30. Portanto, é importante ter à mão um método rápido e confiável para avaliar a eficiência de um par de ortogonal, para escolher o sistema mais adequado para uma aplicação desejada e para executar algumas etapas de otimização que melhoram a expressão de proteínas totais rendimentos.
Nós estabelecemos um ensaio simples e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência dos pares ortogonais29 (Figura 1). No ensaio, as células são co transfectadas com o plasmídeo de codificação para o par ortogonal, juntamente com um plasmídeo do repórter bicistronic codificação tanto para a proteína verde fluorescente, tendo um códon âmbar parada em uma posição permissiva (EGFPTAG) e o gene mCherry. Vermelha e verde fluorescência da célula inteira lysates são lidos em canais separados em um leitor de placa em uma placa de 96 poços. A intensidade da fluorescência verde correlaciona diretamente com a eficiência da supressão de âmbar, Considerando que a intensidade da fluorescência vermelha dá uma estimativa direta do tamanho da amostra medida e a eficiência do transfection. No que diz respeito a ensaios semelhantes baseados em fluorescência assistida célula classificação (FACS) ler31,,32, o ensaio dá uma avaliação imediata e abrangente da expressão da proteína da população celular, que é mais representativo das condições experimentais habituais e oferece uma fácil aquisição de dados e processamento com software padrão. Em geral, a principal vantagem do ensaio é que um meio para um grande número de amostras pode ser analisado em paralelo. Usando este ensaio, tem exibido uma biblioteca racionalmente concebida de supressor-tRNAs para melhorar a eficiência do sistema ortogonal Pyl30. Este trabalho descreve o protocolo experimental para executar este ensaio e mostram exemplos de sua aplicação, incluindo a otimização do par ortogonal para a incorporação da foto-reticulação ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e a comparação de eficiências de incorporação de aminoácidos diferentes (Figura 2).
Nos últimos anos, foram comprovadas ferramentas ncAA muito poderosas para investigar estrutural e aspectos funcionais da proteína G acoplados a receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. em humanos, GPCRs formam uma grande família de receptores de membrana (800 membros) em representam os principais alvos para drogas terapêuticas. Caracterização estrutural direta de GPCRs é ainda um desafio e métodos bioquímicos complementares são altamente necessários para sua investigação. Nós temos pioneira no uso de foto-reticulação ncAAs para mapear as superfícies GPCR e descubra ligante vinculação bolsos34. Usando nosso sistema otimizado para incorporação de Azi, incorporamos sistematicamente Azi em todo o domínio de toda juxtamembrane de um GPCR diretamente em células de mamíferos vivas. Após irradiação UV, Azi forma uma espécie de nitrene altamente reativos que capta covalentemente a moléculas vizinhas. Quando o ligante é adicionado ao sistema, Azi serve como uma sonda de proximidade para revelar quais as posições do receptor vem perto do ligante ligado. Desta forma, o modo de ligação do hormônio neuropeptídeo Urocortin (Ucn1) no receptor da classe B GPCR corticotropin-liberando-fator digito 1 (CRF1R)33 foi primeiramente revelado. Ultimamente, nós temos divulgados padrões distintos de ligação dos agonistas e antagonistas sobre o mesmo receptor38. Uma abordagem semelhante foi aplicada por outros para revelar orthosteric e sítios de ligação alostéricos de outros peptídeos e ligantes pequena molécula em outros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito descreve o protocolo experimental aplicado em nosso laboratório para foto-reticulação mapeamento de superfícies GPCR. O método é relativamente rápido, simples e não requer nenhum equipamento especial, para que seja aplicável em laboratórios de bioquímica padrão. Importante, a abordagem fornece uma ferramenta valiosa não apenas para identificar sites de ligação do ligante onde dados estruturais 3D são escassos, mas também para complementar o existente em vitro dados com informações de receptores post-translationally totalmente modificadas na ambiente fisiológico da célula ao vivo.
O desenvolvimento recente do romance ncAAs rolamento sobre os lado da cadeia grupos químicos apropriados para ultra livre de catalisador opaco química abriu a possibilidade de instalar fluorophores de última geração para a imagem latente de super-resolução nas proteínas diretamente sobre o live células2,43. Tais âncoras químicas incluem cyclooctyne tensa em SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne na BCNK12,17e trans-cyclooctenes no TCO * K13,15,17 , entre outros ncAAs abrigando um norbornene16,17,44 ou,ciclopropeno4546 moiety. NcAAs volumosos para opaco química são incorporados por uma variante do PylRS geralmente denotado como PylRSAF (indicando a mutação Y271A e Y349F em M. barkeri PylRS), bem como por outras ad hoc evoluído ncAARSs17 , 44. as âncoras opaco reagem com reagentes de tetrazine47 via cicloadição de Diels-Alder elétron-demanda inversa para dar altos rendimentos rotulagem dentro de alguns minutos,43,48. No entanto, aplicação desta abordagem poderosa para rótulo GPCRs tem sido desafiador devido a uma baixa eficiência global do sistema ortogonal de incorporação da ncAA. Usando o nosso avançado sistema de Pyl, demonstrámos alto rendimento incorporação de tais aminoácidos GPCRs e ultra rápida GPCR rotulagem na superfície de células de mamífero vivo30recentemente. Rotulado de receptores foram ainda funciona, como eles fisiologicamente internalizado em cima ativando o receptor com um agonista. O protocolo experimental para a incorporação de opaco Ancora em GPCRs e etiquetando as etapas a seguir são descritas aqui. Equipar GPCRs com pequenas fluorophores brilhante é o primeiro passo fundamental para o estudo da dinâmica estrutural GPCR na célula ao vivo através de técnicas avançadas de microscopia.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acriamida/Bisacrilamida 30% (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-azidofenilalanina (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbobenziloxi-L-lisina (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>Ciclooctileno-L-lisina (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>luminol caseiro de 10 mg/l em 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l&nbsp; ácido p-cumárico em DMSO ; 30&nbsp;% H2O2 (1.000 : 100 : 0,3)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>endo-biciclo[6.1.0]nonina-L-lisina (BCNK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8014</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher ( Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Lactato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>ácido p-cumárico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td> <td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Leite em Pó Desnatado&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazine-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>trans-Cicloocteno-L-lisina (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2.5%</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>Linhas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 células</td><td>Alemão Coleção de Microorganismos e Culturas de Células GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>Tubos de 5 x 8 Watts</td></tr><tr><td>Leitor de Placas BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid E2AziRS</td><td>O gene huminizado para E2AziRS foi sintetizado pela Geneart (Life Technologies)</td><td></td><td>Plasmid contendo 4 cópias em tandem do supressor tRNA Bst-Yam conduzido pelo promotor U6 humano e uma cópia de um gene humanizado para a variante aprimorada da Azi-tRNA sintetase (EAziRS) conduzida por um promotor</td></tr> <tr><td>PGKPlasmídeos mutantes POI-TAG</td><td>Plasmídeo que codifica o POI acionado pelo promotor do CMV, C-terminalmente fundido ao FLAG-tag, com um códon TAG na posição desejada&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>Clonado no MCS de pcDNA3.1</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>Clonado no MCS de pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td><td>Sintetizado por Genart (Life Technologies)</td><td></td><td>Clonado no MCS de pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 conjugado de anticorpos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&nbsp;</td><td>monoclonal, produzido em clone de camundongo M2</td></tr><tr><td>Anticorpo HRP anti-coelho de cabra</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CRF</td><td>de</td> coelho <td>PBL</td> caseiro <td>#rC69 policlonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., e Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ucn1 de coelho</td><td>caseiro</td><td>PBL #5779</td><td>policlonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., e Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr></tbody></table>

otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em gpcrs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

A incorporação genética de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) através da supressão de códon de parada âmbar é uma técnica poderosa para instalar sondas artificiais e partes reativas para proteínas diretamente na célula viva. Cada ncAA é constituída por um dedicado ortogonais supressor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetase (AARS) par que é importado para o organismo hospedeiro. A eficiência da incorporação de diferentes ncAAs pode extremamente diferentes e insatisfatória, em alguns casos. Ortogonais pares podem ser melhoradas através da manipulação ou da raa ou o tRNA. No entanto, evolução dirigida de tRNA ou AARS usando grandes bibliotecas e métodos de seleção mortos/vivos não são viáveis em células de mamíferos. Aqui, apresenta-se um ensaio facile e robusto baseado em fluorescência, para avaliar a eficiência de pares ortogonais em células de mamíferos. O ensaio permite a seleção de dezenas a centenas de variantes de RAA/tRNA com um esforço moderado e dentro de um prazo razoável. Uso deste teste para gerar novos tRNAs que melhoram significativamente a eficiência do sistema ortogonal Pirrolisina é descrito, juntamente com a aplicação de ncAAs ao estudo da proteína G acoplados receptores (GPCRs), que são difíceis de objetos para o ncAA mutagênese. Em primeiro lugar, incorporando sistematicamente uma foto-reticulação ncAA em toda a superfície extracelular de um receptor, locais obrigatórios de ligantes diferentes no receptor intacto são mapeados diretamente na célula viva. Segundo, incorporando ncAAs de última geração para um GPCR, ultra rápida do receptor livre de catalisador etiquetando com uma tintura fluorescente é demonstrado, que explora o opaco promovido a tensão inversa Diels-Alder cicloadição (SPIEDAC) sobre a célula viva. Como ncAAs pode geralmente ser aplicado para qualquer proteína, independentemente de seu tamanho, o método é de interesse geral para um número de aplicações. Além disso, a incorporação de ncAA não exige qualquer equipamento especial e é facilmente realizada em laboratórios de bioquímica padrão.

O esboço do ensaio da fluorescência é retratado na Figura 1. O ensaio é empregado em três aplicações. Em primeiro lugar, um número de variantes de tRNA para incorporação de Lys(Boc) pelo par Pyl ortogonais é selecionado. Lys(BOC) é um aminoácido estericamente semelhante ao Pyl. Como Pyl não está comercialmente disponível, Lys(Boc) é comumente usado como um substrato padrão para o PylRS. Os tRNAs selecionados baseiam o tRNAPyl. Cada variante de tRNA...

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

O objetivo geral deste protocolo é aumentar a taxa de incorporação de aminoácidos não canônicos em células de mamíferos para lidar com questões biológicas em ambientes de células vivas, incluindo mapeamento de superfícies de interação proteína-proteína e marcação bio-ortogonal de receptores de superfície. Usando a supressão do códon âmbar, diferentes aminoácidos não canônicos são incorporados com diferentes eficiências. Estabelecemos um ensaio de fluorescência para comparar facilmente as taxas de incorporação de aminoácidos não canônicos em células de mamíferos em um curto espaço de tempo.A incorporação sistemática de aminoácidos não canônicos de fotoreticulação por meio de nossas superfícies GPCR permite o mapeamento dos locais de ligação do ligante e fornece informações preciosas do receptor de ingestão diretamente da célula vital. Ao incorporar aminoácidos não canônicos de última geração para química bio-ortogonal, alcançamos a marcação de GPCRs específicos do local, super rápida e livre de catalisadores com fluoróforos pequenos e brilhantes para aplicações de imagem de ponta em células vivas de mamíferos. Primeiro, semeie 600.000 células HEK 293 em dois mililitros de meio de cr

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Empregando um espectralmente resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia, pixel-nível mapas de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eficiências são obtidas para células que expressam receptores de membrana para formar a hipótese de homo-oligoméricos complexos. Da FRET mapas eficiência, somos capazes de estimar informações sobre o complexo estequiométrico oligômero em estudo.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.

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Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

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