Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

O objetivo geral deste protocolo é aumentar a taxa de incorporação de aminoácidos não canônicos em células de mamíferos para lidar com questões biológicas em ambientes de células vivas, incluindo mapeamento de superfícies de interação proteína-proteína e marcação bio-ortogonal de receptores de superfície. Usando a supressão do códon âmbar, diferentes aminoácidos não canônicos são incorporados com diferentes eficiências. Estabelecemos um ensaio de fluorescência para comparar facilmente as taxas de incorporação de aminoácidos não canônicos em células de mamíferos em um curto espaço de tempo.

A incorporação sistemática de aminoácidos não canônicos de fotoreticulação por meio de nossas superfícies GPCR permite o mapeamento dos locais de ligação do ligante e fornece informações preciosas do receptor de ingestão diretamente da célula vital. Ao incorporar aminoácidos não canônicos de última geração para química bio-ortogonal, alcançamos a marcação de GPCRs específicos do local, super rápida e livre de catalisadores com fluoróforos pequenos e brilhantes para aplicações de imagem de ponta em células vivas de mamíferos. Primeiro, semeie 600.000 células HEK 293 em dois mililitros de meio de crescimento completo por poço em duas placas de seis poços.

Prepare tantos poços quanto o número de amostras e dois poços adicionais para o EGFP do tipo selvagem e uma amostra simulada transfectada, respectivamente. Uma hora antes da transfecção, adicione a quantidade apropriada de solução estoque de aminoácidos não canônica recém-preparada a todos os poços para uma concentração final de aminoácidos de 0,25 a 0,5 milimolar. Para transfectar as células, misture um micrograma de DNA de plasmídeo e codifique para o par de t-RNA sintetase a ser testado com um micrograma de DNA de plasmídeo repórter em um tubo de microcentrífuga.

Em tubos separados, prepare uma transfecção idêntica usando a referência de tipo selvagem EGFP e uma transfecção simulada. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução salina tamponada com lactato a cada tubo que contém o DNA. Depois de misturar brevemente, adicione seis microlitros de um micrograma por microlitro PEI e solução salina tamponada com lactato a cada tubo.

Vortex imediatamente e depois incube em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Transfira 400 microlitros de meio celular de cada poço para a mistura de DNA PEI para neutralizar o pH. Em seguida, drible a mistura de DNA nas células.

Colha as células 48 horas após a transfecção, aspirando o meio e enxaguando as células uma vez com dois mililitros de PBS pré-aquecido. Adicione 800 microlitros de PBS suplementado com EDTA 0,5 milimolar e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, retire e suspenda as células pipetando para cima e para baixo.

Em seguida, transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga contendo 200 microlitros de PBS suplementados com cloreto de magnésio cinco milimolares. Centrifugue as amostras por dois minutos a 800 vezes a gravidade. Quando terminar, descarte o sobrenadante.

Agora, adicione 100 microlitros de tampão de lise Tris aos pellets celulares e incube no gelo por 30 minutos. Para facilitar a lise, vórtice a cada cinco minutos. Gire os detritos celulares por 10 minutos a quatro graus Celsius e 14.000 vezes a gravidade.

Transfira 90 microlitros do sobrenadante para placas pretas de 96 poços. Em seguida, meça a fluorescência EGFP e mCherry usando um leitor de placas equipado com o módulo de fluorescência. Semeie 500.000 293 células T em dois mililitros de meio de crescimento completo por poço em duas placas de seis poços.

Para cada posição a ser peneirada, prepare um poço por ligante, mais um poço para o controle de ligação. Uma hora antes da transfecção, adicione o fotoreticulador, p-azidofenilalanina, ou Azi, a todos os poços até uma concentração final de 0,5 milimolar. Transfectar uma quantidade total de dois microgramas de DNA por poço usando um micrograma de plasmídeo e codificando para o GPCR marcado com bandeira com um códon de etiqueta na posição desejada e um micrograma do plasmídeo e codificação para o par ortogonal dedicado a Azi.

48 horas após a transfecção, prepare uma solução estoque de ligante 1.000x dissolvendo o ligante peptídico a uma concentração de 100 micromolares em DMSO. Diluir a solução de reserva de ligante de um a 1 000 em tampão de ligação. Substituir o meio celular por um mililitro da solução ligante e incubar as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Após a incubação, irradie as células por 20 minutos em um reticulador UV a 365 nanômetros e cinco centímetros de distância das células. Quando terminar, retire as células pipetando e transfira-as para um tubo de microcentrífuga. Pulverize as células por três minutos a 800 vezes a gravidade.

Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda os grânulos celulares em 50 microlitros de tampão de dissociação HEPES, ou HDB, contendo um coquetel de inibidores de protease. Em seguida, congele rapidamente as células em nitrogênio líquido. Em seguida, descongele as células em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 a 45 segundos e, em seguida, faça um vórtice brevemente.

Pelotize as membranas por 10 minutos a quatro graus Celsius e 2500 vezes a gravidade. Quando terminar, descarte o sobrenadante que contém a maior parte das proteínas citosólicas. Ressuspenda completamente os pellets em 50 microlitros de tampão de lise HEPES usando uma pipeta.

Em seguida, lise as células por 30 minutos no gelo, fazendo vórtice a cada cinco minutos. Em seguida, gire os detritos celulares por 10 minutos a quatro graus Celsius e 14.000 vezes a gravidade. Transferir imediatamente cada sobrenadante para um novo tubo de reacção para análise de western blot.

Quando o GPCR é glicosilado e bandas fracas ou manchadas são um problema na análise de western blot, desglicosile as amostras com PNGase F para aumentar a intensidade do sinal e aguçar as bandas. Em seguida, resolva as amostras na página SDS padrão e borre as proteínas de transferência para uma membrana de PVDF. Depois de bloquear a membrana, sonde-a com um anticorpo antiligante para detectar a ocorrência de reticulação.

Para detectar o nível de expressão do Azi-GPCR, sonde a membrana com um anticorpo anti-bandeira comercial. Depois de lavar a membrana, mergulhe-a em solução de quimioluminescência aprimorada e visualize os sinais no escuro. Semeie 100.000 células T HEK 293 em 600 microlitros de DMEM completo e sem corante por poço de uma lâmina de microscopia equipada com quatro poços.

Uma hora antes da transfecção, prepare uma solução de estoque fresca de 100 milimolares de TCOK e hidróxido de sódio 0,2 molar e DMSO a 15%. Misture três microlitros da solução estoque TCOK com 12 microlitros de um molar, tampão HEPES pH 7,4. Adicione suavemente a solução a cada poço para obter uma concentração final de TCOK de 0,5 milimolar.

Em um tubo de microcentrífuga, diluir 200 nanogramas do plasmídeo e codificar para o receptor contendo o códon âmbar e 200 nanogramas do plasmídeo e codificar para o par ortogonal em 50 microlitros de meio. Dilua 1,25 microlitros de lipofectamina 2.000 em 50 microlitros de meio sem corantes, sem soro e sem antibióticos e adicione a solução à solução de DNA. Vortex imediatamente e incube por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione os complexos lipídicos de DNA às células. 24 horas após a transfecção, transfira 100 microlitros de meio de cada poço para um tubo de reação de 1,5 mililitro. Adicione 1,8 microlitros de uma solução de estoque de tetrazina de corante fluorescente laranja e 0,3 microlitros de uma solução de estoque de corante de coloração de DNA.

Transfira o meio contendo os corantes de volta para o poço e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. Aspire o meio e enxágue suavemente as células duas vezes com PBS para remover o excesso de corante. Em seguida, adicione 600 microlitros de meio de crescimento pré-aquecido e sem corante completo às células.

Agora, visualize os receptores marcados com ampliação de 63x usando filtros apropriados para corante fluorescente laranja GFP e corante de coloração de DNA. Depois de adicionar a solução estoque de agonista peptídico às células, observe a internalização ao microscópio usando os filtros mencionados acima e tire fotos após a ocorrência claramente detectável de internalização. Diferentes tRNAs fornecem diferentes eficiências de supressão, o que se reflete claramente na quantidade de fluorescência medida.

A incorporação de Azi em CRF1R foi altamente aprimorada ao usar o gene Azi-tRNA sintetase otimizado para códon em comparação com o gene nativo, mostrando que mesmo uma melhora moderada para uma proteína solúvel pode ter um impacto maior no nível de expressão de proteínas de membrana mais desafiadoras. O sistema otimizado para incorporação de Azi, incluindo o gene E2 Azi RS humanizado, foi implantado para mapear a bolsa de ligação do CRF1R e encontrar caminhos de ligação de cinco ligantes. Uma banda no tamanho correto do produto de reticulação no western blot revela que a posição está na proximidade do ligante dentro do complexo receptor do ligante.

Múltiplos acertos de reticulação com todos os ligantes testados revelaram padrões de ligação distintos para os agonistas e antagonistas do peptídeo. Os dados de fluorescência e western blot sugerem que o TCOK é o aminoácido não canônico para a química bio-ortogonal que é incorporado com a maior eficiência da variante AF da paralisina tRNA sintetase. O TCOK foi incorporado a uma proteína de fusão CRF1R EGFP e permitiu a instalação de um fluoróforo pequeno e brilhante no receptor.

Após a adição de um peptídeo Agaonist, compartimentos fluorescentes foram observados em todo o citosol, revelando o processo fisiológico de internalização do GPCR. Para fazer um ensaio de fluorescência, apresentamos aqui uma ferramenta simples e eficaz para avaliar e otimizar a eficiência de uma sintetase TI e API em células de mamíferos. Altas taxas de incorporação são cruciais para a aplicação de aminoácidos não canônicos para investigar questões biológicas desafiadoras.

A incorporação altamente eficiente de aminoácidos não canônicos de reticulação permite um extenso mapeamento de superfície de praticamente qualquer proteína, incluindo receptores de membrana ou proteínas de banda baixa. O método revela a topologia das interfaces de interação que podem ser analisadas posteriormente para obter modelos moleculares precisos. A alta eficiência de incorporação de aminoácidos não canônicos de última geração para química bioortogonal nos permite equipar os GPCRs com fluoróforos pequenos e brilhantes, abrindo caminho para o estudo da dinâmica estrutural dos GPCRs em células vivas por meio de técnicas avançadas de microscopia.