Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de cristalização de proteínas, como ponto de tempo de nucleação, mecanismo de crescimento de cristais ou como preparar nano / microcristais, conforme investigado pelo Centro de Imagens Ultrarrápidas de Hamburgo. A principal vantagem desta técnica é o monitoramento da evolução da amostra em tempo real, possibilitando a aquisição de informações valiosas, como a distribuição radial de partículas em solução em diferentes estágios de cristalização. Embora esse método possa fornecer informações sobre a microcristalização de proteínas, ele também pode ser usado para proteínas usadas para cristalografia clássica ou para crescimento de grandes cristais de proteínas a serem usados para difração de nêutrons.

A demonstração visual deste método é importante, pois mostra o princípio de funcionamento de um dispositivo de cristalização exclusivo. Para começar, filtre 16 mililitros de solução de tartarato de sódio 1,2 molar e 16 mililitros de água destilada, usando um filtro de seringa estéril de 2 mícrons. Encha o precipitante e as garrafas de água com cinco mililitros das soluções filtradas.

Em seguida, monte as garrafas nos porta-bombas da câmara experimental. Na janela do software, configure os parâmetros experimentais com temperatura de 20 graus Celsius, umidade relativa de 20 e água como solvente. Abra a porta frontal da câmara experimental e remova o suporte da lamínula.

Coloque uma lamínula limpa e siliconizada no suporte e coloque-a de volta no dispositivo. Feche a câmara experimental para garantir as condições ambientais. Ligue a Bomba Zero, usando as principais características da bomba encontradas no protocolo de texto e crie um fluxo de água.

Ajuste o fluxo de água, apontando a posição para o centro da lamínula, operando manualmente o parafuso de ajuste designado. Desligue a Bomba Zero, ligue a Bomba Um e crie um fluxo de líquido, como antes. Ajuste a posição do fluxo da Bomba Um para a posição fixada para a Bomba Zero.

Depois de desligar a Bomba Um, substitua a lamínula usada por uma lamínula nova e limpa para o experimento de cristalização. Crie um novo arquivo experimental usando o pacote de software. No arquivo experimental, insira a proteína como Taumatina, de Thaumatococcus daniellii; a concentração de proteína como 14 miligramas por mililitro, o precipitante como tartarato de sódio e a concentração de precipitante como 1,2 molar.

Depois de carregar o novo arquivo de experimento para ativar essas informações, marque a posição na gota de proteína adicionando uma pequena gota de água, usando a Bomba Zero. Pressione o botão Tara'button para zerar a microbalança. Abra a tampa superior da câmara experimental e pipete 8 microlitros de solução de taumatina no ponto de referência da água.

Para registrar a nova gota de Thaumatin, primeiro clique no botão Nova gota'para atribuir as condições iniciais do arquivo experimental. Em seguida, clique no botão Constante para compensar a evaporação natural da água da gota. Use a câmera CCD para verificar se a bomba zero está mirando na queda de proteína.

Reajuste a posição da Bomba Zero se o fluxo de água estiver apontando para fora da queda. Ligue o laser DLS e coloque o feixe de laser na gota de proteína manualmente usando os parafusos de ajuste. Insira os parâmetros DLS com uma duração de medição de 60 segundos, um tempo de espera entre duas medições de 10 segundos e um número de medições como 300.

Clique no botão Iniciar para iniciar as medições DLS. Verifique a qualidade da amostra selecionando uma das representações gráficas DLS. Insira as condições para a etapa de evaporação na tabela de programação, conforme mostrado no protocolo de texto.

Em seguida, ative a etapa de evaporação da amostra clicando no botão Automação. Clique no botão Stop'quando a etapa de evaporação da amostra for concluída. Ative o botão constante para manter o peso da gota constante.

Esse recurso compensará a eventualidade da evaporação natural da amostra e garantirá que nenhuma mudança de concentração possa ocorrer até que outras ações sejam tomadas. Em seguida, insira as condições para a etapa de adição de precipitante na tabela de programação, conforme listado no protocolo de texto. Ative a etapa de adição do precipitante clicando no botão Automação.

Para acompanhar a evolução da gota de cristalização ao longo do tempo, verifique a aparência dos cristais de taumatina usando a câmera CCD. Verifique a distribuição do tamanho das partículas usando as representações gráficas DLS. Verifique também a evolução do peso e dos parâmetros experimentais usando a janela de exibição.

Todas as informações mostradas nesta janela são calculadas e exibidas em tempo real, com base nas mudanças de peso durante a cristalização, que são registradas online pela balança ultrassensível. Cubra um prato Terasaki padrão limpo adicionando 3 mililitros de óleo de parafina ao prato. Desembolse o óleo de parafina nos poços da placa movendo suavemente a placa em diferentes ângulos para que o óleo cubra todos os 72 poços.

Remova o excesso de óleo de parafina despejando qualquer óleo que flutue no prato. Clique no botão Parar para finalizar o experimento de cristalização. Retire cuidadosamente o transportador de amostra que contém a gota de cristalização.

Com o uso de uma pipeta, coloque dois alócotos de microlitro da gota de cristalização nos poços da placa de Terasaki. Ao recuperar a gota de cristalização em uma placa sob óleo, a amostra pode ser verificada periodicamente quanto à estabilidade no crescimento do cristal com o uso de um microscópio ou outras técnicas diolistas que funcionam com placas de Terasaki. Aqui é exibida uma distribuição de gráfico de raio mostrando o crescimento do tamanho das partículas na queda da proteína durante todo o processo de cristalização da proteína monomérica em direção à formação de núcleos, nanocristais e microcristais.

Aqui, os gráficos representam a evolução ao longo do tempo para o peso da gota de proteína, juntamente com a concentração de proteína calculada e a concentração do precipitante. Aqui é mostrada uma fotografia gravada de microcristais de taumatina no final do experimento. A gotícula mostra uma quantidade muito abundante de pequenos microcristais saturados em solução proteica.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora e 30 minutos, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante que você ajuste o laser DLS nos sistemas de microdosagem na gota de proteína. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manusear facilmente esse dispositivo de cristalização para cristalizar com sucesso uma amostra de proteína.

Este método é possível devido ao espalhamento dinâmico de luz in situ que é diretamente acoplado à gota de cristalização. Isso nos permite monitorar todas as mudanças na distribuição do raio e, portanto, podemos identificar certos padrões de distribuição para cristalização ou precipitação de proteínas. Seguindo este procedimento, outros métodos como microscopia crioeletrônica ou difração de elétrons podem ser aplicados para responder a perguntas adicionais e verificar o estado cristalino de partículas de tamanho submicrométrico em solução.

As implicações dessa técnica se estendem para a teoria da nucleação em duas etapas, já que os mapas DLS estão mostrando um padrão claro de uma distribuição de tamanho duplo de partículas em solução, que são anteriores ao crescimento do cristal.