Name: Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a produzir proteínas de fusão IL4-10 recombinantes para tratamento da dor crônica em modelos murinos. Este método detalha controle de qualidade e avaliação da atividade analgésica in vivo.

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Parte deste trabalho foi financiado por uma Universidade Utrecht Life Sciences conceder

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as diretrizes internacionais e aprovação prévia do Comitê de ética local experimental. Sangue total foi obtida do serviço de doador do Mini (Mini doador Dienst, MDD) na Universidade Medical Center Utrecht (UMCU) nos Países Baixos. O MDD recebeu aprovação positiva do Comitê de ética médica do UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) para a protocolo número 07-125/C.
1. caracterização e produção de proteínas
<ol><li>Cultura celular Nota: Consulte a Tabela de materiais por meio de cultura utilizado.<ol>
<li>Descongele as células HEK293-F a 37 ° C até que haja uma pequena moita de gelo. Transferir as células descongeladas imediatamente para 10 mL de meio gelado (4 ° C) e centrifugar a suspensão de eritrócitos em temperatura ambiente (RT) por 4 minutos (min) a 500 x g.</li>
		<li>Remover o meio e ressuspender as células em 10 mL de meio fresco no RT, seguido por centrifugação a 500 x g durante 4 minutos.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o celular em 5 mL de meio na RT. Add a suspensão de células diretamente para um balão de 125 mL contendo 25 mL de meio pré-aquecido (37 ° C). Cultura de células em 37 ° C e 8% CO2, 95% de umidade em um agitador orbital, girando a uma velocidade de 125 rpm.</li>
		<li>Subcultura das células duas vezes por semana. Usar uma célula automatizada contador (ver Tabela de materiais) para avaliar o número de telemóvel e viabilidade celular. Células viáveis de sementes em uma concentração de 3 x 105 células/mL em Erlenmeyers. Mantenha o volume total do meio de cultura em 1/5 do volume total de Erlenmeyers de cultura em todos os momentos para manter a aeração ideal.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfecção Nota: Subcultura das células de três a quatro vezes antes do transfection e transfect-los quando a viabilidade celular é > 90%. Viabilidade celular é avaliada por um automatizado (campo elétrico multi canal) cellcounting sistema baseado na integridade da membrana plasmática. Consulte a Tabela de materiais para o reagente de transfeccao.<ol>
<li>Centrifugar as células em RT para min 4 a 500 x g; Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) e diluir a suspensão de células ~1.0 x 106 células/ml em um volume total de 1 L. alíquota a suspensão de eritrócitos em 10 partes alíquota de 100 mL em frascos de Erlenmeyer de 500 mL.</li>
		<li>Diluir 1 mg de plasmídeo em meio essencial mínimo de 33 mL soro reduzido (MEM, consulte Tabela de materiais) pela mistura suave. Em um tubo separado, dilua 1.330 µ l de reagente de transfeccao em MEM misturando suave. Incubar as duas soluções em RT 5 min. adicionar e misturar o DNA diluído em MEM para o reagente de transfeccao em MEM e incubar a mistura durante 30 min à RT</li>
		<li>Adicione a mistura de reagente de Transfeccao de DNA às células (cultivadas na secção 1); Adicione 6,6 mL da mistura a cada 500 mL frasco de Erlenmeyer contendo 100 mL de células em meio de cultura. Manter as células das condições de cultura mencionado anteriormente. Recolher o sobrenadante de cultura contendo secretada proteína de fusão de IL4-10 três dias depois do transfection.</li>
		<li>Determinar a concentração da proteína de fusão do IL4-10 no sobrenadante da cultura através da realização de um ELISA IL10, de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Nota: Em condições ideais de cultura, a concentração da proteína de fusão pode ser deve estar entre 2,5 e 5 µ g/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade Nota: Cromatografia de afinidade é realizada à temperatura ambiente. No entanto, todas as frações (frações sobrenadante, carga, fluxo e eluição cultura) são mantidas no gelo durante o procedimento.<ol>
<li>Casal 10 mg de um feita internamente monoclonal anticorpo contra IL4 1G de CNBr - ativado sepharose 4B, de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). 2,5 mL de grânulos sepharose acoplado lentamente despeje a coluna de cromatografia de vidro (30 cm de comprimento e 1,5 cm de diâmetro interno, consulte Tabela de materiais).</li>
		<li>Bloquear o restante ligação sites dos grânulos, passando a 50 mL de solução salina tamponada fosfato (PBS) contendo 1% albumina de soro bovino através da coluna. Lavar a coluna com 25 mL de PBS (pH = 7,4) seguido de 12,5 mL de tampão de glicina 0,1 M (pH = 2,5) e 25 mL de PBS (pH = 7,4).</li>
		<li>Passe 100 mL de 10 vezes concentrada cultura de células HEK293 sobrenadante através da coluna em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. lavar a coluna com 50 mL de PBS.</li>
		<li>Eluir a proteína de fusão IL4-10 acoplada com 12,5 mL de tampão de glicina 0,1 M (pH = 2,5) a uma taxa de fluxo de 1 mL/min e coletamos frações de 2,5 mL. Adicione 350 µ l de tampão Tris de 1 M (pH = 9) para cada fração de trazer o pH para 7. Dialize frações neutralizadas durante a noite contra 2 L de PBS (pH = 7,4).<ol>
<li>Use a tubulação da diálise com 16 mm de diâmetro seco e um corte de peso molecular de 3,5 K. Estéril filtrar as frações dializadas usando filtros descartáveis com 0,45 µM de diâmetro de poro. Armazenar a solução estéril de proteína de fusão IL4-10 em alíquotas a-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avalie a pureza da proteína de fusão eluted IL4-10 por gel de SDS-PAGE 12% manchadas de Coomassie e HP-SEC (coluna 3 µm SEC-2000). Para análise de HP-SEC, carrega 40 µ l de proteína, na concentração de ~ 1 mg/mL na coluna. Usar o tampão fosfato de sódio de 100 mM com 150 mM de cloreto de sódio (pH = 6,8) como uma fase móvel. Defina a taxa de fluxo em 1 mL/min.</li>
		<li>Determinar a concentração de cada lote de proteína de fusão IL4-10 purified por ELISA IL10 e ensaio de Bicinchoninic ácido da proteína (Kit de ensaio de proteína BCA, consulte Tabela de materiais) de acordo com os protocolos do fabricante.</li>
		<li>Use IL10 humana recombinante para criar uma curva padrão no ensaio de ELISA. Para corrigir a diferença de tamanho entre IL10 recombinante (18 kDA) e proteína de fusão de IL4-10 (34 kDa), multiplicar a concentração obtida por um fator de 1.8.</li>
	</ol></li>
	<li>Bioatividade de proteína de fusão de IL4-10 Nota: O ensaio de sangue total é executado para cada lote de proteína de fusão de IL4-10 produzida e a atividade de diferentes lotes é comparada como uma parte do controle de qualidade. O ensaio de sangue total é realizado em sangue humano fresco coletado no dia do ensaio em tubos de heparina. Sangue foi obtido de voluntários saudáveis em nosso serviço de doador in-house. As amostras devem ser tratadas como riscos biológicos potencialmente.<ol>
<li>Preparar pre-diluições de série 3 vezes da proteína purificada fusão IL4-10 em meio RPMI (ver Tabela de materiais) sobre uma concentração variar 5-1.215 ng/mL.</li>
		<li>Preparar pre-diluições de LPS (100 ng/mL) e o sangue humano que é diluído 4 vezes em meio RPMI.</li>
		<li>Pipete as pre-diluições da proteína de fusão de IL4-10, LPS e sangue humano em uma placa de 48. Para cada poço, adicionar 50 µ l IL4-10 proteína da fusão (concentração final 1-243 ng/mL), 75 µ l RPMI médios, 25 µ l LPS (concentração final de 10 ng/mL) e o sangue humano de 100 µ l (final diluído). Nota: O volume Total por bem é 250 µ l.</li>
		<li>Incube a placa a 37 ° C e 8% CO2, 95% de umidade para 18 h.</li>
		<li>Avalie a concentração de TNFa em sobrenadantes de cultura usando uma TNFα ELISA, de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Calcular a inibição da resposta inflamatória pela proteína de fusão IL4-10 de acordo com a fórmula: % de inibição = (1-(A-B)/(C-B)) x 100 Nota: Aqui A = níveis de TNFa em culturas estimuladas LPS, tratados com a proteína de fusão de IL4-10, B = níveis de TNFa em cultura unstimulated e C = níveis de TNFa em cultura estimulada de LPS.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mouse modelo para dor inflamatória persistente
Nota: É importante usar ratos machos e fêmeas (C57Bl/6), porque isso permitirá a identificação dos efeitos do sexo-dependente. Em geral, os ratos usados são entre 8-16 semanas de idade. Para determinar o número de animais necessários, cálculos de energia devem ser executados. Ferramentas baseadas na Web para realizar tais cálculos são encontradas facilmente na internet (por exemplo, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
<ol><li>
Indução de dor inflamatória crônica Nota: Induzi dor inflamatória persistente em ratos adultos com Lumiracoxib injeções de carragenina ou adjuvante completo de Freud (CFA). Os diferentes testes não interferem uns com os outros.<ol>
<li>Preparar a carragenina (2% p/v) dissolvendo-se λ-carragenina (ver Tabela de materiais) em 0,9% NaCl, passando a solução através de uma agulha de calibre 23 para garantir que a carragenina é dissolvida corretamente. Prepare uma solução fresca diretamente antes que a injeção é realizada.</li>
		<li>Como alternativa, se CFA é usado, misture a solução CFA corretamente antes de injetá-lo intraplantarly, porque o CFA é uma emulsão de água em óleo que contém 1 mg de Mycobacterium tuberculose (H37Ra) calor matou e secas, 0,85 mL de óleo de parafina e 0,15 mL mannide monooleato (ver Tabela de materiais). Nota: Seringas de vidro Hamilton com êmbolos metálicos são recomendadas para injectar este composto por êmbolos de borracha podem reagir com o óleo no adjuvante.</li>
		<li>
Lumiracoxib injeção
		<ol>
<li>Manter o composto (etapas 2.1.1 ou 2.1.2) na seringa na RT durante pelo menos 15 minutos antes da injeção para permitir o ajuste para RT. injetar 20 µ l do composto (ou dissolvente, como um controle) por via subcutânea para a pata traseira do mouse não-anestesiados usando um calibre 30 agulha.</li>
			<li>Introduza a agulha na base do polegar em direção ao calcanhar e injetar o composto quando a agulha é inserida cerca de 0,5 cm. Após a injeção, retraia lentamente a agulha enquanto girar ligeiramente a seringa para evitar vazamento de solução fora do local da injeção.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dor medições
Nota: Certifique-se que pesquisadores realizando os experimentos comportamentais são cegos para o tratamento de rato. É importante se adapte os animais para o ambiente de teste antes de executar qualquer medição. De preferência, na semana antes de iniciar os experimentos, os animais são colocados 1 - 2 vezes por 15-30 min em cada um dos diferentes dispositivos utilizados para realizar os testes. Ao manusear os machos e fêmeas no mesmo experimento, avalie os machos independentemente de fêmeas. Gaiolas limpas e superfícies extensivamente entre os diferentes grupos para evitar possíveis efeitos indesejáveis sobre o comportamento dos sexos diferentes. Medir latências de retirada de linha de base ou mecânicos limiares de duas a três vezes a precisão determinar limites de linha de base e identificar se estas são estáveis antes Lumiracoxib injeção de qualquer composto.
<ol><li>
Teste de von Frey: mecânica sensibilidade a estímulos inócuos
	<ol>
<li>Coloque os animais individualmente em gaiolas de acrílico em um carrinho de malha de arame e permitir que os ratos aclimatar-se durante pelo menos 15 minutos antes da medição.</li>
		<li>Avaliar a sensibilidade mecânica medindo-se o limiar de retirada de pata em resposta a uma série calibrada de pelos de von Frey, variando de 0,02 a 4 g. considere qualquer movimento de pata longe do cabelo aplicada como uma resposta positiva de retirada. Aplicam-se os filamentos, perpendicular à superfície de pata com força suficiente para causar ligeira flexão contra a pele e segurar para fazer s. ~ 3 claro que o cabelo não torça durante a aplicação para a pata.</li>
		<li>Calcule o limiar de pata-retirada de 50% usando o método de altos e baixos de15,21. Nota: O primeiro filamento para aplicar é 0,4 g (outros filamentos de partida podem ser utilizados dependendo dos limiares estes ratos exibir na linha de base). A falta de resposta a um filamento indica que o próximo filamento mais grosso é usado na estimulação seguinte, enquanto uma resposta positiva indica o uso do próximo filamento mais fino. O número de apresentações do cabelo é determinado pela primeira resposta diferencial; Depois disso, mais 5 aplicações são executadas. Calcule que o limite de 50%, de acordo com os métodos descritos anteriormente15,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sensibilidade térmica: teste de Hargreaves
	<ol>
<li>Coloque os animais em gaiolas em uma placa de vidro previamente aquecido (30 ° C) e permitir que os ratos aclimatar-se durante pelo menos 15 minutos antes da medição, esperando até que os animais se sentar ainda.</li>
		<li>Determine os tempos de latência de retirada de calor aquecendo a pata dos animais por um feixe de luz focalizado visível usando um aparelho de Hargreaves (ver Tabela de materiais). Nota: A intensidade do feixe é definida como 12%, porque com essa configuração de intensidade determinado experimentalmente, o feixe de luz evoca uma resposta retirada do tempo médio de 8 s na linha de base em camundongos C57Bl/6. A configuração de intensidade deve ser determinada por máquina individual e cepa de rato. Tempos de corte máxima de 20 s ou mais são usados para evitar lesões aos animais.</li>
		<li>Medir os tempos de latência de retirada ~ 4 vezes por animal. Média de todas as respostas medidas. Medir cada pata de forma independente e com intervalos de pelo menos 1 min entre medições posteriores na mesma pata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Déficits posturais: teste do rolamento de peso dinâmico
	<ol>
<li>Medir o peso corporal de cada animal antes do ensaio, desde que a análise do rolamento de peso requer o peso corporal de cada animal como um parâmetro de entrada.</li>
		<li>Coloque os animais individualmente em um sistema de peso-rolamento dinâmico instrumentado andar montado em uma capa de apoiar uma câmera que vai gravar os movimentos do mouse. Deixe o animal aclimatar para 0,5 a 1 min antes da gravação por 5 min. Nota: Neste teste, apenas um animal livremente movente pode ser avaliado em uma hora.</li>
		<li>Ajuste as configurações para realizar o rolamento de peso e analisar os dados. Nota: Nestas experiências, utilizamos os seguintes parâmetros: limite de peso (i) baixa de 0,6 g: Este é o peso mínimo necessário para ativar uma das células do sensor. (ii) limite de peso elevada de 1 g: este número indica o peso necessário para ativar completamente uma célula. (iii) superfície limite de 2 células: este número indica o número de células adjacentes uns aos outros que precisam ser ativados para serem levados em conta. (iv) mínimo número de imagens é 5: demora 0,1 s para capturar cada imagem. O número indica o número mínimo de quadros em que o mouse não se move. Como tal, um valor de 5 significa que o mouse postura precisa ser estável para > 0,5 s para obter uma medida que é levada em conta para análise.</li>
		<li>Realizar a análise de cada vídeo por rever o vídeo e certifique-se de que cada membro é reconhecido corretamente pelo software para o período de tempo indicado pelo software. Nota: Precisa de um mínimo de 1 min do tempo gravado ser validado. O peso dinâmico rolamento software calcula e fornece os seguintes parâmetros: (i) o peso suportado por cada pata individual em gramas e em percentagem do peso do corpo todo. (ii) o peso, a cargo da pata dianteira combinada ou nas patas traseiras combinadas em gramas e em percentagem do peso do corpo todo. (iii) a relação da esquerda/direita patas rolamento de peso ou dianteiro/traseiro rolamento de peso. (iv) a área da superfície de cada pata ou combinadas patas dianteiro/traseiro que ativou o pad sensível de pressão. (v) e o desvio para cada parâmetro. (vi) a duração das diferentes posturas (criação, 3 patas ou 4 patas) durante todo o experimento. (vii) tempo (s) de que cada pata tem peso durante todo o experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. proteína de fusão intratecal injeção de IL4-10 para analgesia
Nota: Confirme que a ventilação para a sala está aberta para garantir o fluxo de ar adequado. Para testar a eficácia da proteína de fusão do IL4-10 (1 µ g/mouse; volume de injeção total 5 µ l) deve ser testado contra injeções de veículo e injeções da combinação das citocinas individuais (IL4 IL10, 0,5 µ g + 0,5 µ g/rato, volume de injeção total 5 µ l).
<ol><li>Anestesia o mouse com isoflurano de 3-4% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min na câmara de indução. Verifica que o mouse é devidamente anestesiado por beliscar a pata para garantir que o animal não é responsivo.</li>
	<li>Lugar o mouse em cima da mesa com a cabeça colocada no nariz cone do aparelho e manter a sedação de rato com isoflurano 1,5 a 2% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min, enquanto realizando a injeção intratecal.</li>
	<li>Costas-preenchimento injetáveis compostos em um vidro limpo 25 µ l seringa Hamilton conectem a uma agulha de calibre 27.</li>
	<li>Segure o mouse pela coluna vertebral posterior nas costelas e levantar ligeiramente o mouse. Coloque a agulha na vertical entre as vértebras lombares L5 e L6 e inseri-lo cuidadosamente através da pele, bem no meio das vértebras lombares. Coloque a agulha no espaço intervertebral. Nota: Encontrar o espaço intervertebral pode exigir alguns 'pesquisa' ao mover a agulha ao longo do eixo ventral rostral, pressionando levemente a agulha até sente uma perda da resistência do tecido ósseo.<ol>
<li>Confirme o direcionamento correto, verificando-se que um movimento de cauda ocorreu. Injetar 5 µ l do composto lentamente, aguarde alguns segundos e em seguida puxar lentamente a agulha. Se apenas um único pata flick é observado, a agulha é provável não colocadas correctamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a injeção, verifique o mouse perto para o primeiro 30 min após a recuperação da anestesia para garantir a ausência de qualquer deficiência/paralisia motora. Nota: Comportamentos de dor podem ser medidos (como descrito na seção 3) 15 minutos após a recuperação.</li>
</ol>

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<li>Eijkelkamp, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piezo2+in+EPAC1-dependent+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia.</a> Nat Commun. 4, 1682(2013).</li>
<li>Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+mechanical+threshold+estimation+in+rodents+using+von+Frey+hairs%2FSemmes-Weinstein+monofilaments%3A+Towards+a+rational+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method.</a> J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).</li>
<li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+and+Endogenous+IL-10+Are+Required+for+Resolution+of+Chemotherapy-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain.</a> J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este manuscrito descreve métodos para a produção e caracterização de um recombinante da proteína de fusão de IL4-10 e métodos para testar a sua eficácia na inibição de hiperalgesia inflamatória em modelos do rato da dor inflamatória persistente. A produção e purificação da proteína de fusão do IL4-10 é realizada em pequena escala. Células HEK293 são Selecionadodas como um sistema de expressão para produção de proteína, porque eles permitem modificações borne-translational que não podem ser realizadas em sistemas de expre...

Dor crônica continua sendo um dos problemas médicos mais debilitantes e sob-Tratado do século XXI, afetando > 20% da população adulta1,2. No entanto, tratamentos para proporcionar alívio da dor crônica, muitas vezes são ineficazes ou devem ser descontinuados devido a efeitos colaterais graves3. Importante, atualmente drogas disponíveis apenas fornecer alívio sintomático, mas não significativamente modificar ou curar dor crônica. Embora a dor crônica parece ser um distúrbio neurológico, a evidência sugere envolvimento do sistema imunológico em dor crônica desenvolvimento4,5. Além disso, a imune-abordagens para tratar a dor estão surgindo. Por exemplo, citocinas anti-inflamatórias inibem a dor em diversos modelos de dor crônica6,7,8. No entanto, citocinas anti-inflamatórias tem uma meia-vida curta, reduzindo seus potenciais efeitos de inibição de dor. Além disso, a citocinas anti-inflamatórias mais otimamente trabalham em conjunto com o outro. Para superar essas limitações, nós recentemente fundiu as citocinas anti-inflamatórias interleucina-4 (IL4) e interleucina-10 (IL10) em uma molécula. A proteína de fusão de IL4-10 mostra eficácia superior na inibição crônica dor inflamatória e neuropática, comparado com o de citocinas individuais9. Aqui descrevemos como tal proteína da fusão é produzida, purificado, e como sua qualidade é controlada.
Proteína de fusão de IL4-10 é produzida em células humanas por transfecção transiente de células HEK293-F com um vetor de expressão pUPE carregando a sequência de cDNA codificação da proteína de fusão de IL4-10. Células HEK293-F são escolhidas para permitir a modificação borne-translational da proteína, algo que não ocorre em sistemas de expressão bacteriana. Para otimizar glicano tampando com ácido siálico, cDNA codificação beta-galactoside-2, 3-sialyl-transferase é incorporada no vetor como um segundo transgene. A proteína de fusão purified usando a purificação da proteína de afinidade do sobrenadante da cultura porque é mais poderoso do que a purificação por cromatografia de troca iônica10,11ou outros métodos , por exemplo, tamanho-exclusão. Para purificar a proteína de fusão de IL4-10, usamos in-house feitas os anticorpos monoclonais contra IL4. Avaliação da pureza e bioatividade de purificado da proteína de fusão de IL4-10 são realizadas como parte do controle de qualidade. A pureza dos lotes produzidos é avaliada por sódio Dodecil sulfato de eletroforese em Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e alta pressão cromatografia de exclusão (HP-SEC). A bioatividade da proteína de fusão do IL4-10 é avaliada pela sua capacidade de inibir o lipopolissacarídeo (LPS) de medição-induzido por produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNFa) em culturas de sangue total e comparando com a combinação do indivíduo citocinas.
Finalmente, para testar a capacidade das proteínas de fusão IL4-10 para inibir a dor crônica, descrevemos como a proteína de fusão pode ser testada como analgésico em modelos do rato amplamente utilizado de dor inflamatória persistente12,13,14 . Aqui descrevemos os métodos de um modelo de dor inflamatória. No entanto, é importante notar que outros modelos de dor pode ser usado (por exemplo, modelos de dor neuropática), dependendo da pesquisa perguntas que precisam ser respondidas. Para avaliar a dor nesses modelos, é importante o uso de uma variedade de medidas comportamentais que incluem evocadas e não evocava dor. Aqui, descrevemos os métodos de avaliação de mudanças na mecânica e termicamente evocadas respostas comportamentais. Sensibilidade mecânica a estímulos inócuos é avaliada através do teste de Von Frey, enquanto a sensibilidade térmica é avaliada utilizando o teste de Hargreaves. Importante, hiperalgesia/alodinia evocada não é medida através do teste de rolamento de peso dinâmico. Estas medidas são amplamente aceitos como medidas de dor e produzem informações importantes sobre os limiares de dor e potencial dor experimentada pelos animais15,16,17. Outras medidas para avaliar a dor não evocados (por exemplo, independentes de estímulo), tais como o teste de preferência de lugar condicionado, pode ser valioso18. Para avaliar o potencial da droga para inibir a dor, realizamos a administração intratecal da proteína de fusão, como com esta via de administração menos dose de proteína é necessário para alcançar áreas relacionados à dor e evitar sistêmica (lado) efeitos19, 20.

<table><tbody><tr><td>Células FreeStyle 293-F</td><td>Invitrogen</td><td>R790-07</td><td>Células renais embrionárias humanas&nbsp;</td></tr><tr><td>GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life technologies</td><td>12338018</td><td>Meio de cultura</td></tr><tr><td>293fectin Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>12347019</td><td>Reagent de transfecção</td></tr><tr><td>GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>Life technologies</td><td>51985026</td><td>Reduced Serum Medium para uso durante transfecções lipídicas catiônicas&nbsp;</td></tr><tr><td>GIBCO RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Life technologies</td><td>52400-025</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Ativada por CNBr 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0430-01</td><td>meio pré-ativado para acoplamento de anticorpos ou outras proteínas grandes</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico fumegante 37%&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio&nbsp;</td><td>Cloridrato de Trizma Sigma</td><td>31437</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato</td> de <td>TRIS Sigma</td><td>T3253-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido Acético 100%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.00063.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicina-HCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G2879 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Pharmacie, UMCU</td><td></td><td>Phosphate-Buffered Saline</td></tr><tr><td>10X TGS</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0772</td><td>Tris/Glycine/SDS Buffer para eletroforese SDS</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>BIO-RAD</td><td>456-1046</td><td>12% SDS géis pré-moldados</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Pack</td><td>BIO-RAD</td><td>170-4157</td><td>Western blot transfer packs</td></tr><tr><td>Yarra 3u SEC-2000 coluna</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mancha de proteína InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>pronta para usar Coloração de proteína Coomassie para géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Humano IL-10 DuoSet ELISA</td><td>R& D</td><td>DY217B</td><td></td></tr><tr><td>TNF humano e alfa; Conjunto ELISA</td><td>Diaclone</td><td>851570020</td><td></td></tr><tr><td>BCA Pierce Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Carragena</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22049</td><td>mucopolissacarídeo vegetal</td></tr><tr><td>CFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>adjuvante da vacina</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton Seringa</td> de <td>vidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20779</td></tr><tr><td>Animal Enclosure</td><td>IITC Life Science</td><td>433</td><td>Animal Enclosure</td></tr><tr><td>Suporte de malha Von Frey</td><td>IITC Life Science</td><td>410</td><td>Suporte de malha</td></tr><tr><td>von Frey hairs&nbsp;</td>Teste de toque <td>Stoelting</td><td>58011</td><td>sondas sensoriais</td></tr><tr><td>Teste Plantar (Método Hargreaves)</td> <td>IITC Life Science</td><td>390G</td><td>teste plantar com vidro aquecido</td></tr><tr><td>Teste dinâmico de sustentação de peso</td> Teste <td>de déficit postural</td><td>Bioseb</td><td>BIO-DWB-AUTO-M</td></tr><tr><td>Colunas Econo-Column de vidro, 1,5 &vezes; Coluna</td> de cromatografia de vidro <td>BIO-RAD</td><td>7371532</td> de 30 cm<td>&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de Diálise SnakeSkin&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Minisart NML Filtro de Seringa&nbsp;</td>Unidade de filtro de uso único <td>Sartorius</td><td>16555-K</td><td>, 0.45 &mu; </td></tr><tr><td>Contador e Analisador de Células M CASY</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain

Dor crônica é difícil de tratar e novas abordagens para resolver a dor persistente são urgentemente necessárias. Citocinas anti-inflamatórias são candidatos promissores para tratar condições de dor debilitante devido à sua capacidade de regular as interações de neuro-imune aberrantes. No entanto, fisiologicamente, eles trabalham em uma rede de várias citocinas, e consequentemente o seu efeito terapêutico não pode ser ideal quando usado como stand-alone drogas. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma proteína de fusão das citocinas anti-inflamatórias, IL4 e IL10. Aqui, descrevemos os métodos de produção e controle de qualidade da proteína de fusão recombinante IL4-10 e testamos a eficácia da proteína de fusão do IL4-10, para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória persistente.

Uma imagem representativa de um gel de SDS-PAGE contendo diferentes frações obtidas durante a purificação de cromatografia de afinidade é mostrada na Figura 1A. Na carga (L) e o fluxo através de frações (FT), todas as proteínas presentes no sobrenadante HEK293 são observadas. Nenhuma proteína é observada na fração de lavagem (W). Na fração de eluição (E), observam-se duas bandas de 35 e 37 kDa correspondente a dois glycoforms diferentes da pr...

Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.

Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

Chronic pain is difficult to treat and new approaches to resolve persistent pain are urgently needed. Anti-inflammatory cytokines are promising candidates ...

O objetivo geral desses procedimentos é produzir uma proteína de fusão das citocinas anti-inflamatórias IL4 e IL10, controlar sua qualidade e avaliar sua atividade funcional e propriedades analgésicas em modelos espelhados de dor inflamatória crônica. Esses métodos detalhados ajudam no desenvolvimento de novos produtos biológicos e testam sua qualidade e funcionalidade. A vantagem dessas técnicas é que você pode produzir uma quantidade suficiente de proteínas de fusão recombinantes, o que permite sua avaliação de suas propriedades analgésicas in vivo.Para avaliar o potencial terapêutico da nova proteína de fusão desenvolvida, é importante ter um lote bem caracterizado e usar uma variedade de testes comportamentais. A implicação desses métodos é que eles fornecem informações sobre novas terapias altamente necessárias para a dor crônica, mas também estendem o potencial para outras doenças inflamatórias. Geralmente, os cientistas novos nesses métodos terão dificuldade em realizar todos os procedimentos mostrados aqui, uma vez que é necessária experiência em diferentes campos.Depois de subcultivar 100 mililitros de células HEK 293F em frascos Erlenmeyer de 500 mililitros de acordo com

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós descrevemos um método para laminotomy em suínos que fornece acesso aos gânglios lombares raiz dorsal (DRG) para injeção intraganglionic. Progresso de injeção é monitorado no intraoperatório e histologicamente confirmado acima de 21 dias após a cirurgia. Este protocolo pode ser usado para futuros estudos pré-clínicos envolvendo injeção DRG.

Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar experimentos farmacológicos intracranianas, seguidos de ensaios de comportamento de dor em roedores. Este protocolo permite que os pesquisadores entregar alvos moleculares e celulares no cérebro, por agentes farmacológicos no tratamento da dor.

Farmacoterapia intracraniana e ensaios de dor em roedores

Desenvolvemos uma medida evocada da dor da artrite e, juntamente com um método padronizado para medir a dor espontânea em diferentes modelos de murino de artrite induzida quimicamente. Estas medidas são sensíveis e reprodutíveis para diferentes tipos de dor nas articulações.

Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

A ligadura parcial do nervo ciático induz dor neuropática crônica de longa duração, caracterizada por respostas exageradas a estímulos térmicos e mecânicos. Este modelo murino de dor neuropática é comumente usado para estudar terapias inovadoras para o tratamento da dor. Este artigo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico para melhorar a padronização e reprodutibilidade.

Ligadura parcial do nervo ciático: um modelo murino de dor neuropática crônica para estudar o efeito antinociceptivo de novas terapias

Desenvolvimentos recentes na pesquisa da dor destacam o potencial da fotoneuromodulação usando diodos emissores de luz verde (GLED) como tratamento não farmacológico. O GLED modula as vias da dor, oferecendo alívio eficaz da dor. Este artigo tem como objetivo padronizar e refinar os protocolos de exposição ao GLED, melhorando a consistência entre os estudos e avançando na aplicação clínica dessa terapia.

Otimizando técnicas de fotoneuromodulação para avaliar o papel dos diodos emissores de luz verde no controle da dor

Este vídeo demonstra o modelo de transplante ortotópico aórtica como um modelo simples para estudar o desenvolvimento de vasculopatia do transplante (TVP) em ratos.

Transplante ortotópico de aorta: um modelo de rato para estudar o desenvolvimento de vasculopatia crônica

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Aproximadamente 3-8.000.000 de pessoas nos Estados Unidos sofrem de síndrome intersticial dor cistite / vesical (IC / BPS), uma condição debilitante caracterizada em parte pela dor pélvica. A fim de estudar as contribuições do sistema nervoso para a condição, um modelo fisiológico de dor na bexiga urinária é usado em ratinhos e ratos.

Respostas Bexiga Distensão Evocado Visceromotor como um modelo para Bexiga dor em camundongos

Este manuscrito descreve um modelo de roedor para estudar a dor neuropática do trigêmeo. Os métodos descritos incluem procedimentos cirúrgicos para realizar uma lesão de constrição crônica do nervo infraorbital do rato e os testes comportamentais pós-cirúrgicos para medir as mudanças no comportamento espontâneo e evocado que são indicativas de dor persistente e alodinia.

Crônica lesão por constrição de Infraorbital Nerve do Rato (Ion-CCI) para o Estudo do trigêmeo Dor neuropática

Aprenda a produzir proteínas de fusão IL4-10 recombinantes para tratamento da dor crônica em modelos murinos. Este método detalha controle de qualidade e avaliação da atividade analgésica in vivo.

Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

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