Name: 研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶターコイズメダカの研究室飼育プロトコル。老化と加齢関連疾患の研究に適したNothobranchius furzeriの飼育・繁殖方法を解説。遺伝子変異や環境要因が老化に与える影響を検討するための標準化手法を提供します。

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ありがとうアレッサンドロ ・ Cellerino、ロン Genade、アン黒髪、サブリナ シャープ、ミッキー ・ パウエル、シモーネ Keil、ゆみキム、パトリック ・ スミス、改オーナーマ タール、Valenzano 研究室のすべてのメンバー、マックス ・ プランク研究所で老化の生物学のさまざまな側面に貢献すること長年にわたり現在のメダカ飼育プロトコル。

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

すべての著者は財務および非財務の利害を宣言しません。

研究室は青緑色メダカ、採卵、孵化、成魚住宅などの養殖のためのプロトコルについて述べる、繁殖、供給します。我々 のプロトコル、特に老化と寿命に関する実験的研究、特に成魚に焦点を当てて研究を行う研究所をターゲットに。標準のゼブラフィッシュのファシリティで青緑色のメダカが発生します。ただし、メダカ飼育の重要な側面は、標準的なゼブラフィッシュ ケア16によって異なります。これらの調整には、胚培養、液体、乾燥インキュベーション ステージから成る特定の手順と同様に、タンパク質が豊富な血液ワームを添加した食事に塩水エビだけのダイエットから初期遷移があります。
プロトコルの中で重要なステップには 8-30 ° C の温度範囲内で送料の胚が含まれます。周波数と食品の品質を供給に依存して産卵、繁殖の場合したがって、我々 は胚収量 (セクション 5.6 を参照してください。) を高めるためにタンクを繁殖につき一日に少なくとも 2 つの授乳をお勧めします。胚は漂白、中に漂白液で胚培養を拡張しません。卵の絨毛膜と増加胚死亡率を傷つけるをおそれがあります。メチレン ブルーを持つ胚を培養するときは 2 週間以上の生存率は劇的に減ると準備ができて-ハッチング胚の孵化を長引かせるありません。青緑色のメダカを孵化、フミン酸溶液の低温孵化が向上、ソリューションの胚の完全な浸漬により、同期の孵化。十分な通気ガス膀胱を埋めることができないフライの高レートの培養結果中 (「腹スライダー」表現型、セクション 5.1 でメモを参照してください)。
繁殖のプロトコルの制限には、どのポーズ課題集中ろ過システム、将来的に別の方法で置き換える必要があります砂の基板の使用が含まれています。可能な選択肢は、ゼブラフィッシュ飼育タンクの使用可能性があります。胚の漂白で変更された絨毛膜の生理学および成功を孵化卵の絨毛膜の主要な物理化学的変化の原因。メチレン ブルーに胚の一定の暴露が成魚の生理学の長期的変化を誘発します。魚類の行動と健康に生存コホート研究のため個々 のタンクの成魚を上げるかもしれない悪影響します。しかし、生存コホート研究グループ ・ ハウジングは、厳格な社会階層につながる社会的順位と男性の領土の確立による交絡因子を追加します。したがって、生存研究オスの魚の隔離が合理的な妥協であることを判断します。非制御震源から生きた餌給餌研究所メダカ コロニーは、寄生虫や病原微生物から外部汚染のリスクを追加します。将来は、アドホック滅菌飼料を開発する必要があります。
このプロトコルの将来の改善はまだ 3-4 週間以内に性的成熟を完了する導く制御、非ライブ ダイエットに焦点を当てます。要約すると、我々 のプロトコルは、広い科学界に青緑色のメダカ研究所培養へのアクセスを提供しています。

彼らの短い寿命のスパンと迅速なライフ サイクルを考えると、ターコイズ メダカが生物学1,2,3で有望な新しいモデル生物として急速に高まっています。この種は、硬骨魚類の胚の休眠、急速の性的成熟と生殖のロングライフ ステージ4,5で構成されるのユニークなライフ サイクルが特徴です。最近の作品は捕われの身と野生6、7の両方この種の生物学の解明に貢献しています。ターコイズ メダカが、ジンバブエやモザンビークにおいてアフリカのサバンナで梅雨の時期にそのフォームを季節の新鮮な水の体に住んでいます。乾燥する季節の間に胚は休眠と呼ばれるストレス耐性のライフ ステージのおかげで水のない状態で乾いた泥で生き残る。
この種の遺伝のマップは生成された8,9をされている、最近のゲノム シーケンスと組み立てられた10,11をされています。いくつかの近交系実験室魚株が開発され、遺伝子とゲノム CRISPR/Cas9 を介して編集が事実上競争力研究所脊椎動物のモデル生物として青緑色のメダカを推進、この種で利用可能になります。12,,1314。
この種の15のため、実験室のプロトコルは既に公開されているがこの議定書の高齢化と生存率の調査研究を具体的に目的とした実験ガイドラインの包括的なリストを開発します。この議定書によりなる青緑色のメダカ飼育でキー調整の最小数を採用することにより精通するゼブラフィッシュとメダカ飼育に既に精通している研究者です。同じ時に、このプロトコルは、盛んなターコイズ メダカ コロニーを高めるために不可欠なツールで魚飼育の経験のない研究者を提供します。

<table><tbody><tr><td>プローブ校正緩衝液 pH=7.0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>1L 緩衝液 pH=7.0 水システム pH-電極</td></tr><tr><td>プローブ 校正緩衝液 pH=4.0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>1L 緩衝液 pH=4.0 水システムpH電極</td></tr><tr><td>導電率標準</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL 導電率標準 1,413 uS/cm 水システムを校正導電率電極</td></tr><tr><td>イージーストリップテスト 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>システム水の塩素値を測定するためのテストストリップ</td></tr><tr><td>アンモニア試験</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>システム水のアンモニア含有量を測定するためのテスト</td></tr><tr><td>紅海塩</td><td>紅海</td><td></td><td>22 kg バケツ</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>フミン酸</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>新しい HUFA アルテミア濃縮</td><td>ZM Systems UK</td><td></td><td>75g ボトル</td></tr><tr><td>メチレン ブルー</td><td>ロス</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (w/w)</td></tr> <tr><td>ココナッツ繊維</td><td>ドラゴン</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 紙</td><td>GE ヘルスケア</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>エタノール純粋な</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr><tr><td>珪砂</td>地元の<td>ペットショップ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルテミア卵プレミアムグレード</td><td>サンダース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブラッドワーム</td><td>地元のディストリビューター</td><td></td><td>ポセイドンAquakulturドイツ</td></tr><tr><td>dNTPs溶液ミックス</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/ULの</td></tr><tr><td>PCR 10x Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8.0 solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>水槽</td><td>アクアニアリング</td><td></td><td>容量:0.8L、2.8L、9.5L;バッフル、フライメッシュ、蓋を装備</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>モデル5000</td></tr><tr><td>微生物インキュベーター</td><td>サーモサイエンティフィック、ヘラサーム</td><td>50125882</td><td>モデルIMC18; 液相の胚の保存用、t=27-28&deg;C</td></tr><tr><td>冷却インキュベータ</td><td>ーバインダー</td><td>9020-0209</td><td>モデル KT115; 固相の貯蔵胚の場合、t=27-28&deg;C</td></tr><tr><td>孵化インキュベーター</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>model OGS180; 胚孵化用、t=27-28&deg;C</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>モデル M80</td></tr><tr><td>繁殖砂/孵化ボックス</td><td>ロス</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>サーシュテット</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL 円錐管</td><td>サーシュテット</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐管</td><td>サーシュテット</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てプラスチックパスツールピペット</td><td>ロス</td><td>EA71.1</td><td>2mL;ミミズを餌にする魚、または胚の選択のために、先端を切り取って直径3-4mmのセ</td></tr><tr><td>ロジカルピペット</td>を開きます <td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50mL</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>メタルストレーナー</td><td></td><td></td>の<td>細かさ <1ミリメートル;胚採取用</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>デュモン</td><td>0508-5/45-PO</td><td>type5/45; 胚移植用</td></tr><tr><td>25 L 塩水エビ孵化器</td><td>アクアニアリング</td><td>ZHBS25</td><td>メイン孵化器</td></tr><tr><td>500mL 塩水エビ孵化器</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>モデル アルテミオ1; バックアップ孵化器</td></tr><tr><td>ナローメッシュ フィッシュネット</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンドビーカー</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>ブラインシュリンプ分離ビー</td><td>カーVWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>プラスチックジッパーバッグ</td><td>ロス</td><td>P279.2</td><td>死んだ魚の貯蔵用</td></tr><tr><td>Pipetboy</td>インテグ<td>ラ</td><td>155000</td><td>モデルPipetboy acu2</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>エアチューブ</td><td></td><td>www.zajac.de AQ380</td><td>4-6ミリメートル直径</td></tr><tr><td>1 Lガラス瓶</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L ガラス瓶</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL</td> ブ<td>ラインシュリンプ120</td>-&#956を餌にする魚用スクイーズボトル<td>Roth</td><td>K665.1</td></tr><tr><td>;mブラインシュリンプストレーナー</td><td>フロリダアクアファーム</td><td>BB-PC2</td>ブ<td>ラインシュリンプ/ブラッドワームコレクション用</td></tr><tr><td>フィニッシュフィルターソックスアクア</td><td>ニアリング</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956;m</td></tr><tr><td>中央ろ過魚の飼育システム</td><td></td><td></td><td>Aquaneering、Techniplast、水生生物の生息地、アクアシュワルツ</td></tr></tbody></table>

研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

参照魚の確立からゼブラフィッシュとメダカなどのモデル システムの実験のために使用される非モデル実験室魚で飼育慣行の開発は大きく寄与しました。近年、増え続ける高齢化と生態の生物学の分野で研究グループによって新たな魚-ターコイズ メダカ (による furzeri) – を採用されています。4-8 ヶ月の拘束寿命、この種飼育で育った最も短命だった脊椎動物、高齢化率と平均余命の変化につながることができます – – 短期間でテスト実験的介入への科学界を可能です。胚の休眠によって特徴付けられる、この種のユニークな生物学を与えられた爆発性成熟マーク形態および行動の性の二形性 - と、比較的短い大人の寿命 -アドホック飼育の実践は、緊急需要。このプロトコルは、対策できる最適なターコイズ メダカ研究所ケア、強力な実験動物モデルとしてこの種を採用する科学的なコミュニティを有効にするキーのセットを報告します。

ターコイズ メダカ適切な飼育は、見る: GRZ ひずみ (例えば図 4 a) で 12-18 週まで生存期間中央値の結果します。生存期間中央値の変化は、食事療法、摂食頻度、および温度条件の住宅によって異なります。貧しい飼育結果提示生存曲線では、早期死亡と生存時間中にいくつかの変曲点 (図 4 b) によって特徴付けられるの繰り返し、突然滴に増加しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> 図 1: それぞれ培養基質との代表的な胚発達段階。(A)たて 28 ° C でインキュベーターでメチレン ブルー溶液で培養した胚を収集(B)固体媒体に転送する準備ができての胚か紙やココナッツ繊維をフィルターします。(C)胚孵化するのに典型的なゴールデン アイリスを表示する準備が整いました。スケール バーは均等に 1 mm<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> 図 2: 青緑色のメダカが孵化後の開発の段階。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> 図 3: ステージ 3 以降から魚の代表魚 ID タグ。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> 図 4: 70 男性ターコイズ メダカの代表的な生存曲線。(A)ターコイズ メダカの研究所発生の一般的な生存率曲線です。(B) (ブラック) 最適な飼育条件下で発生する魚から得られる生存曲線の比較と貧しい飼育 (赤と青)。赤色水平の破線は、50% 生存期間は、平均寿命 (x 軸で示される) で交差する生存曲線を示します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">前方のプライマー</td>
			<td colspan="2">逆プライマー</td>
			<td>サイズの範囲 (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166-214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220-272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209-240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198-238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164-226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196-197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252-295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216-248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174-205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355-373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">* - 測定マーカーをセックス</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 遺伝子型プライマーひずみ識別のため。

青緑色のメダカは、家し、標準ゼブラフィッシュ設備と同じインフラストラクチャを採用、一元的な水のろ過システムで個々 の魚の数千を効率的に上げるにスケール アップすることができますの研究室住宅。ここで我々 は効率的なメダカをメンテナンスできるように標準化されたプロシージャの一覧を詳しく説明します。

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

このプロトコルの全体的な目標は、ターコイズメダカの実験室コロニーを成功裏に育て、老化や加齢性疾患を迅速かつ高スループットで研究することです。この方法は、単一遺伝子の突然変異や環境介入が脊椎動物種の老化プロセスを調節できるかどうかなど、老化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、基本的なプロトコルに従うことで、いくつかの研究室がターコイズメダカを使用した実験を行えるようになったことです。一般的に、この方法に不慣れな個人は、メダカの飼育にはいくつかのユニークな特徴があるため、苦労するでしょう。例えば、胚は孵化する前に乾燥した基質で育てられますが、これはゼブラフィッシュなどの標準的な魚類モデルとは大きく異なります。まず、生後5週間のオスと6〜7週間のメス2匹ずつが入った9.5リットルの飼育タンクを設置します。次に、プラスチック容器にオートクレーブ処理した砂を約2〜3センチの深さで満たし、サンドボックスを繁殖タンクの中央に置きます。ターコイズメダカを連続的に繁殖させ、胚の孵化のために週に一度胚を収穫します。トランスジェニック系統の注入と作製に使用する1細胞期の胚を採取するには、先ほど示したように、オス1匹とメス2匹の魚で繁殖水槽を設置します。胚採取の2日前に、オスを個々のタンクに移し、成体のメスと視覚的に接触させてください。採集当日は、オスと砂場を繁殖水槽に加え、魚を2時間産卵させます。スポーンしてサンドボックスをタンクから取り除いた後、サンドボックスを空にしてストレーナーに入れ、システム水を使用してすすぎます。次に、ストレーナをシステム水に部分的に沈め、胚が中央に集まるようにゆっくりと渦巻きます。2ミリリットルのパスツールピペットを使用して、胚を採取し、約40ミリリットルのシステム水が入った90ミリメートルのペトリ皿に移します。光学顕微鏡で、ペトリ皿内の胚を検査し、絨毛膜の破裂と損傷の兆候を示す胚を取り除きます。テキストプロトコルに従って胚を漂白した後、青色に染まる死んだ胚を検査して取り除きます。胚を新鮮なメチレンブルー溶液でインキュベートしたら、発達した胚に黒い目が見えることを確認します。次に、使い捨てのパスツールピペットまたは細い湾曲したピンセットを使用して、胚を濾紙プレートに移します。未発達の胚をメチレンブルーで保持し、毎日監視します。黒目が発達したら、それらを固体基材媒体に移します。鉗子を使用して、胚を約5ミリメートル間隔で広げ、90ミリメートルプレートあたり最大100個の胚を広げます。次に、パラフィンを使用して皿を密封し、胚が完全に金色の虹彩を発達させて孵化の準備が整うまで、胚を摂氏28度で2〜3週間インキュベートします。最長1年間の長期保存の場合、メチレンブルー溶液で3日間インキュベートした後、示したように胚を固体基質培地プレートに移し、摂氏17度でインキュベートします。魚を孵化させるには、細い湾曲したピンセットを使用して、50〜100個の発達した胚を孵化ボックスに慎重に移し、摂氏4度で2センチメートル以下の深さのフミン酸溶液に完全に浸します。このプロトコルの重要なステップは、乾燥基質上でインキュベートされた胚を十分な曝気を備えたフミン酸を含む孵化溶液に移すことによって達成されるメダカ胚の孵化です。孵化ボックスを蓋で覆い、孵化インキュベーターで摂氏28度でインキュベートします。十分なエアレーションを供給するには、ボックスをチューブでエアサプライに接続します。孵化ボックス内の水質を十分に維持するために、孵化翌日から1日1回、最終的な深さを2cmに維持するオートクレーブ水が1対1の割合でボックスを補充します。孵化していない胚を固体基質に戻し、1週間後に孵化を試みます。孵化後5日で稚魚と成魚を育てるには、使い捨てのプラスチックピペットまたはプラスチックスプーンを使用して稚魚を水循環システムに移し、400マイクロメートルの稚魚スクリーンを備えた0.8リットルの水槽ごとに5匹の稚魚を慎重に移します。生後14日で、稚魚を850マイクロメートルのフライスクリーンを備えた2.8リットルの水槽に移します。この時点から、各タンクに魚のIDをラベル付けします。サバイバルアッセイでは、各魚を1つのタンクに個別に収容します。サバイバルアッセイのために飼育された魚も、2.8リットルのタンクに個別に飼育されています。次の7日間、1日2回、5ミリリットルのブラインシュリンプに1〜3匹の生きた血液ワームを補給して、幼魚に餌を与えます。生後4週間で、各魚に1日2回、ブラインシュリンプと1ミリリットルのブラッドワームを与えます。この段階では、オスには色の兆候がある大きな背びれ、肛門、尾びれの存在を確認し、メスには卵でいっぱいの丸い腹部の存在を確認して、魚が完全な性的成熟に達することを確認します。ここに示されているのは、70匹のオスのターコイズメダカの代表的な生存曲線です。適切な飼育により、GRZ株の生存期間の中央値は12〜28週間になります。生存期間の中央値の変動は、食事、摂食頻度、および住居の温度条件によって異なります。貧しい畜産の下で育てられた魚の生存曲線は、最適な飼育条件下で育てられた魚と比較して、早期死亡率の増加と時間の経過とともに生存率の突然の繰り返しの低下を明らかにしています。このプロトコルに従いながら、孵化したばかりの稚魚の水分状態と余分な食物を清潔な環境で維持することが不可欠であるため、これらを注意深く監視することが重要です。開発後、この技術は、研究者がトランスジェネシス、ゲノム編集、食事操作など、ターコイズメダカの実験的操作を探求する道を開きました。このビデオを見れば、実験室でターコイズメダカをうまく育てる方法をよく理解し、このモデルを使用して、飼育下で飼育できる最短寿命の脊椎動物の老化の生物学を探る方法を理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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研究室住宅のターコイズメダカ (による furzeri) のためのプロトコル

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