Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

O objetivo geral deste procedimento é alcançar a manipulação de genes cardíacos específicos in vivo, por injeção intramiocárdica de adenovírus em camundongos adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa cardiovascular sobre os mecanismos moleculares e alinhar a lesão cardíaca e a eficácia da terapia gênica. As principais vantagens desta técnica são que ela é livre de ventilação, que os camundongos se recuperam rapidamente da cirurgia e que é reprodutível e fácil de executar.

Então, agora, vamos começar. No dia do procedimento, aqueça a solução purificada do vetor de adenovírus a 80 graus Celsius negativos, armazenada no gelo. Quando o adenovírus descongelar, coloque uma máscara facial, um avental estéril e luvas estéreis.

E pulverize o tubo de adenovírus com 75% de etanol. Transfira o vírus para uma capela de fluxo laminar estéril e aspire 50 microlitros da solução do vírus para uma seringa Hamilton esterilizada de 50 microlitros. Coloque uma agulha de calibre 30 na seringa.

Gire a seringa para a posição vertical. Pressione suavemente o êmbolo, até que uma gota de solução seja visível na ponta da agulha, para encher a ponta da agulha com vírus. Em seguida, aspire cuidadosamente mais 30 microlitros de solução de adenovírus para a seringa e coloque a seringa no gelo.

Para injetar o adenovírus no coração de um camundongo, confirme o nível apropriado de sedação por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé e aplique pomada nos olhos do animal. Raspe a parte superior do tórax e o abdômen do animal. Aplique o creme depilatório disponível comercialmente na pele exposta.

Usando gaze úmida para remover o creme e qualquer cabelo restante após um minuto. Usando três esfoliantes anti-sépticos à base de clorexidina de iodo, esterilize o lado inferior esquerdo do tórax. Em seguida, cubra o animal com um campo cirúrgico, com um orifício sobre a área cirúrgica, e coloque um novo par de luvas estéreis.

Em seguida, usando técnicas e instrumentos estéreis, faça uma incisão na pele de 0,5 centímetro do xifóide à axila e use uma pinça e um hemostático Micro Mosquito para dissecar sem rodeios os músculos peitorais maiores e menores. Retraia os músculos peitorais maiores e menores para expor o espaço intercostal. E use o hemostático Micro Mosquito para perfurar e abrir o quarto espaço intercostal.

Pressione suavemente contra o lado direito da parede torácica com o dedo indicador da mão não dominante para mover o coração em direção à incisão. Em seguida, prenda cuidadosamente o coração exteriorizado com o dedo indicador e o polegar da mesma mão e use a mão dominante para injetar 10 microlitros de solução de adenovírus no miocárdio de cada uma das paredes ventral, dorsal e lateral do ventrículo esquerdo. Após a última injeção, retorne imediatamente o coração ao espaço intratorácico.

E pressione suavemente a parede torácica em direção ao local da incisão, para evacuar manualmente qualquer ar do espaço intratorácico. Feche a pele com uma sutura de seda de cinco ott, em um padrão de colchão horizontal, e coloque o mouse em uma almofada térmica de 37 graus Celsius com monitoramento até a recuperação total. Em seguida, esterilize a seringa Hamilton usada e a agulha de calibre 30 em um esterilizador de alta temperatura e alta pressão e descarte a agulha esterilizada em um recipiente apropriado para objetos cortantes.

Cinco dias após a injeção intramiocárdica de adenovírus envolvendo luciferase, a imagem in vivo indica uma superexpressão robusta de luciferase, especificamente no coração, que pode ser confirmada pela análise de Western blot, sugerindo a ausência de transdução de órgãos não-alvo. A análise de Western blot também indica um aumento significativo da expressão do receptor de vitamina D. E o ventrículo esquerdo de camundongos injetados com adenovírus que codifica o receptor de vitamina D.

Com uma expressão reduzida do receptor evidente em animais injetados com adenovírus que codifica grampo de cabelo curto direcionado ao receptor de RNA vitamina D. Por outro lado, a expressão do receptor de vitamina D não é significativamente alterada nos ventrículos direitos de nenhum dos animais injetados no ventrículo esquerdo. Uma vez dominado, esse método pode ser concluído em dois minutos, se for executado corretamente.

Após esse procedimento, outros métodos, como a injeção de células cardíacas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a eficácia de terapias celulares específicas em infartos do miocárdio.