Name: Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprenda a manipulação gênica cardíaca específica em camundongos adultos por injeção intramiocárdica de adenovírus. Este método eficiente permite recuperação rápida e é ideal para pesquisas cardiovasculares.

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Este trabalho foi financiado pelo fundo nacional de ciência para ilustres jovens estudiosos (81625002), Nacional Natural Science Foundation da China (81470389, 81270282, 81601238), programa de Shanghai acadêmica líder de pesquisa (18XD1402400), Shanghai Municipal Apoio educação Comissão Gaofeng medicina clínica Grant (20152209), centro de desenvolvimento do Hospital de Shenkang de Shanghai (16CR3034A), Universidade do Tong de Shanghai Jiao (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programa de navegação de Shanghai (18YF1413000) e programa de pós-graduação inovação da faculdade de medicina de Bengbu (Byycx1722). Agradecemos sua ajuda anterior Dr. Erhe Gao em nosso laboratório.

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com os institutos nacionais de saúde orientações sobre o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê de ética Animal do Instituto. Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos. Os ratos foram alojados em condições de livre de patógeno a 24 ° C ± 4 ° C, sob um ciclo claro/escuro de 12-h, com livre acesso à água e comida.
1. preparação da solução de adenovírus
<ol><li>Após a chegada da solução purificada adenovírus, conservar a solução em um freezer-80 ° C. Nota: A injeção de adenovírus foi realizada em ratos viáveis. Para garantir a esterilidade do vetor adenovírus, o vírus adenoide (codificação do luciferase, VDR ou shRNA alvo VDR) foram preparadas e purificado comercialmente9,10.</li>
	<li>No dia da operação, retire a solução purificada adenovírus (3 x 1010 placa formando unidades [pfu] /mL) do congelador a-80 ° C e descongelar a solução do vetor de adenovírus no gelo.</li>
	<li>Veste uma máscara, luvas estéreis e vestido de estéril.</li>
	<li>Preparar um 50 µ l seringa Hamilton que foi esterilizada no dia antes da operação. Nota: Para a esterilização, a seringa Hamilton foi envolto em gaze e colocada em um esterilizador de pressão de alta temperatura/alta. O modo de "Esterilização para o sólido" foi selecionado e esterilização foi iniciada pressionando o botão "start".</li>
	<li>Após o descongelamento completo da solução purificada adenovírus, pulverizar o tubo contendo solução de adenovírus com 75% de etanol e mover a solução de adenovírus em uma capa de fluxo laminar estéril.</li>
	<li>Em uma capa de fluxo laminar estéril, Aspire solução de adenovírus 50 µ l utilizando a seringa Hamilton sem uma agulha, seguida de penhora de uma agulha 30G à seringa Hamilton.</li>
	<li>Segurar a seringa com a agulha de 30g para cima e empurre suavemente o êmbolo da seringa até que a agulha é preenchida com solução de adenovírus (confirmada pelo aparecimento das primeiras gotas de solução de ponta da agulha). Nota: Demora aproximadamente 45 µ l solução para preencher a agulha 30G, então agora quase nenhuma solução é visível na seringa.</li>
	<li>Use a seringa preparada acima para Aspire cuidadosamente com outra solução de adenovírus 30 µ l e coloque a seringa vagamente tampada no gelo para uso subsequente.</li>
</ol>2. anestesia e preparação operativa
<ol><li>Adicionar 20 mL isoflurano em um vaporizador de isoflurano e conectar o vaporizador de isoflurano para um tanque de oxigênio.</li>
	<li>Abra a válvula e deixe o oxigênio fluxo do tanque de oxigênio para o vaporizador de isoflurano. Manter a taxa de fluxo de oxigênio a 2 L/min, através de um monitor de fluxo de oxigênio no vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Induzi a anestesia do mouse com 4% de isoflurano em 100% de oxigênio (2 L/min) por 2 min em uma gaiola de plástico ligada ao vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Tirar o mouse anestesiado da jaula de plástico e fixá-lo em uma plataforma de plástico na posição de bruços em uma capa de fluxo laminar estéril e manter a anestesia com isoflurano de 2% em 100% de oxigênio (2 L/min) através de um cone de nariz.</li>
	<li>Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta de pitada de dedo do pé.</li>
	<li>Aplique o creme oftálmico estéril para cada olho para proteger as córneas de secagem.</li>
	<li>Depilar o peito e abdômen superior. Aplicar creme depilatório comercialmente disponível para o site raspado para 1 min. Retire o creme depilatório e restante pele com gazes molhadas.</li>
	<li>Esterilize o local cirúrgico (parte inferior esquerda do tórax) com 3 batas de anti-séptico à base de iodo-clorexidina (por exemplo, entoiodine). Cobrir o local cirúrgico com um pano estéril.</li>
</ol>3. Intramiocárdica injeção de adenovírus no coração de rato
<ol><li>Tirar as luvas e colocar um novo par de luvas estéreis.</li>
	<li>Esterilizar o fórceps, uma pinça hemostática micro-mosquito, um par de tesouras cirúrgicas, e um porta-agulha no dia antes da operação em uma alta temperatura/alta pressão esterilizador (ver nota etapa 1.4).</li>
	<li>Faça uma incisão de 0,5 cm de pele ao longo da linha que liga o xifoide e axila. Sem rodeios, disse o peitoral maior e peitorais menores músculos com fórceps e uma pinça hemostática micro-mosquito.</li>
	<li>Expor os espaços intercostais, retraindo o peitoral maior e peitorais menores músculos. Perfurar e abra o quarto espaço intercostal (ou o mais amplo espaço intercostal por observação) com uma pinça hemostática micro-mosquito.</li>
	<li>Empurre o coração em direção a incisão de exteriorizar o coração com o dedo indicador da mão não dominante, pressionando suavemente contra o lado direito da parede torácica.</li>
	<li>Secure suavemente o coração exteriorizado com o dedo indicador e o polegar da mão não dominante.</li>
	<li>Injete um total de solução de adenovírus 30 µ l do miocárdio do ventrículo esquerdo em três locais (parede ventral, dorsal e lateral do ventrículo esquerdo) através da seringa Hamilton repleto de adenovírus (Figura 1) com a mão dominante.</li>
	<li>Após a conclusão da injeção, coloca imediatamente o coração volta para o espaço intratorácicos.</li>
	<li>Manualmente, evacue o ar no espaço intratorácicos pressionando suavemente a parede torácica para o local de incisão da pele. Nota: Evacuação de ar bem sucedido pode ser evidenciada pelo bater do peitoral maior e peitorais menores músculos causados pelo ar expelido.</li>
	<li>Feche a pele por sutura horizontal com uma sutura de seda 5-0. Nota: O peitoral maior e peitorais menores músculos devem não ser suturados, porque eles só sem rodeios são dissecados e suas estruturas anatômicas estão intactas durante toda a operação.</li>
</ol>4. pós-operatórios
<ol><li>Administre a buprenorfina (3 mg/kg) duas vezes diariamente através de injeção subcutânea para reduzir a dor pós-operatória para as primeiras 48 horas após a operação11.</li>
	<li>Após a operação, imediatamente manter os ratos em uma almofada de calor (37 ° C) até que se recuperou totalmente. Coloque o mouse volta para a jaula, depois que ele se recupere totalmente.</li>
	<li>Esterilizar o usado Hamilton seringa e agulha de seringa 30g num esterilizador alta temperatura/alta pressão (ver nota etapa 1.4). Recolha a agulha de seringa esterilizada 30 G em um recipiente de objectos cortantes.</li>
</ol>5. na Vivo Imaging para medir a expressão Luciferase cardíaca
<ol><li>No dia 5 após a injeção de adenovírus, prepare uma solução stock fresca de luciferina em 15 mg/mL em solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm.</li>
	<li>Intra peritoneally Injete os ratos acordados com a solução de luciferina a 150 mg/kg de peso corporal.</li>
	<li>Ligue o sistema de imagem.</li>
	<li>Depois automático autoteste do sistema de imagem, selecione o modo de imagem como "Luminescentes" e fazer as seguintes configurações: exposição: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Excitação: Bloco; Emissão: aberto.</li>
	<li>Em 10 min após a injeção de luciferina, anestesia os ratos por injeção de hidrato de cloral (300 mg/kg de peso corporal). Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta de pitada de dedo do pé.</li>
	<li>Fixe os ratos anestesiados num palco de imagem aquecida na posição de bruços, com o peito voltado para a câmera.</li>
	<li>Recolher imagens (1 imagem para cada rato) e quantificar a intensidade dos sinais desenhando-se as regiões de idêntica medida circular de interesse (ROI) em torno do peito.</li>
	<li>Após a coleta de imagens, sacrificar os ratos e coletar os tecidos, como mencionado na seção a seguir.</li>
</ol>6. colheita de tecidos
<ol><li>Em pontos diferentes de tempo após a injeção do vírus (figura 1B), anestesiar os ratos com 4% de isoflurano, manter a anestesia com isoflurano 2% através de um cone de nariz e fixá-lo em uma plataforma de plástico na posição de bruços.</li>
	<li>Fazer uma incisão ventral no pescoço anterior. Expor a artéria carótida comum direita, retraindo os músculos omohyoid e esternocleidomastoideo.</li>
	<li>Sacrifica os ratos por cruza a artéria carótida comum direita e drenar o sangue.</li>
	<li>Fazer uma incisão ventral no abdome. Corte as costelas de ambos os lados da caixa torácica, ao longo da linha médio clavicular e transecto o diafragma.</li>
	<li>Expor o coração, levantando o xifoide. Encontrar a aorta ascendente e remova cuidadosamente o tecido adiposo perivascular.</li>
	<li>Canule da aorta e perfundir retrogradely o coração com uma agulha 30G anexada a uma seringa de 1 mL, preenchida com 0,5 mL de solução-tampão de fosfato (PBS) 4 ° C.</li>
	<li>Após a perfusão, excisar o coração e dividi-lo nos ventrículos direito e esquerdos. Excisar o fígado, pulmão e baço.</li>
	<li>Depois de duas lavagens em PBS frio (4 ° C), armazene todos os tecidos coletados separadamente em frascos criogênicos em nitrogênio líquido.</li>
</ol>7. determinação da expressão da proteína
<ol><li>Prepare o tampão de homogeneização adicionando coquetel de inibidor de protease em tampão de Lise comercialmente disponível a uma proporção de 1: 100. Calcule o volume total, com base no número de amostras a serem processadas. Mantenha o buffer de homogeneização preparado a 4 ° C para uso posterior.</li>
	<li>Tire os tecidos do tanque de nitrogênio líquido. Pese o tecido em escalas de alta precisão (cerca de 60 mg para cada pedaço de tecido).</li>
	<li>Transferi o tecido para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Imediatamente adicione 200 µ l homogeneização buffer e pré-resfriado esferas de aço 1,5 mm (4 ° C) no tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Fixar os tubos microcentrifuga em pré-resfriado (4 ° C) suportes de metal em um tecido automático retificadora e começar a homogeneização, iniciando a máquina com as seguintes configurações: frequência: 70 Hz; tempo: 120 s.</li>
	<li>Após a homogeneização, centrifugue o homogeneizado (16.000 × g, 4 ° C) e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL com uma pipeta de 100 µ l.</li>
	<li>Adicionar o carregamento do buffer solução (5x) à proteína sobrenadante na proporção de 1:4 e desnaturar a proteína a 100 ° C por 5 min.</li>
	<li>Os níveis de expressão de proteínas no coração e outros tecidos de órgãos são mais monitorados pela análise ocidental do borrão (representante resultados são mostrados na Figura 2 e Figura 3) de acordo com o protocolo descrito anteriormente12.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O presente relatório demonstra uma técnica modificada para injeção Intramiocárdica de vetores virais para manipulação do gene cardíaca, que foi modificado de um método para indução do infarto do miocárdio por Gao et al 13 atualmente, na vivo caracterização das funções do gene específico geralmente envolvem a geração de nocaute ou ratos transgénicos3,14,15,16<...

Doença cardíaca é a principal causa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo1,2. A falta de estratégias terapêuticas eficazes para doenças cardíacas fatais e incluindo infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca atrai a exploração intensiva de pathomechanisms subjacentes e identificação de opções terapêuticas novela3. Para estas explorações científicas, manipulação genética cardíaco-específicas é amplamente utilizado4,5. Manipulação genética cardíaca pode ser conseguida editando genoma usando a nuclease efetoras como ativador de transcrição poderoso (TALEN) e agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / proteína associada CRISPR 9 (Cas9) ferramentas, ou por entrega de materiais genéticos de gravidez ectópica (por exemplo, vetores de vírus, carregando genes que codificam proteínas de interesse)6. Embora a edição do genoma permite modificações precisas e spatiotemporal genoma em ratos vivos, ainda é uma prática demorada e trabalhosa,6. Alternativamente, manipulação de gene específico cardíaco pelo vírus vetor ou interferindo pequeno entrega complexa de RNA (siRNA) são rotineiramente realizada6.
Entrega de vetor de vírus para o coração de rato adulto é alcançada por aproximadamente duas estratégias: injeção sistêmica ou local. Injeção sistêmica de sorotipo cardiotropic de AAVs como AAV9 é não-invasiva para o gene específico cardíaca manipulação7. No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor necessário para transdução eficiente e expressão gênica e pode resultar em significativa transdução do nontarget órgãos tais como o músculo e fígado7. Injeção local de vírus é conseguida por injeção Intramiocárdica ou entrega Intracoronário7. Intracoronário entrega leva a uma distribuição mais uniforme do vírus dentro do coração em comparação com injeção Intramiocárdica. No entanto, as desvantagens desta técnica são a lavagem rápida fora de vetores virais para a circulação sistêmica e transdução em órgãos nontarget8e sua exigência de dispositivos para medição de pressão durante a operação. Por outro lado, permite de injeção Intramiocárdica melhor retenção de vírus no miocárdio, bem como entrega de local específico, mas não consegue distribuir uniformemente viral vector7. Para pequenos animais, entrega Intracoronário é tecnicamente difícil de executar, enquanto sistêmica AAV9 injeção e injeção Intramiocárdica são mais comumente praticada4,5,7. Embora injeção sistêmica é fácil de realizar, injeção Intramiocárdica convencional requer toracotomia e ventilação mecânica, provoca dano tecidual extensa e é demorada.
Neste relatório, nós descrevemos um método fácil, economia de tempo e altamente eficiente para injeção Intramiocárdica. Adenovírus codificação luciferase e VDR ou shRNA alvo VDR, foi injetado para manipular a expressão de gene cardíaca. Uma vez dominado, esse método pode ser usado para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais no coração do mouse.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capuz estéril de fluxo laminar</td><td>Fengshi Animal Experimental&nbsp; Equipamento Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific (Waltham, EUA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de moagem de tecidos</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de alta temperatura/alta pressão</td><td>Hirayama (Saitama, Japão)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano&nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, EUA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; Sistema de imagem Lumina III</td><td>PerkinElmer (Waltham, EUA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precisão&nbsp; balance</td><td>Sartorius (G&ouml; ttingen, Alemanha)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>Instruments&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipeta (100 &micro; L)</td><td>Eppendorf (Westbury, EUA)</td><td>&nbsp; </td><td></td>4920000059</tr><tr><td>Pipeta Eppendorf (10 &micro; L)</td><td>Eppendorf (Westbury, EUA)</td><td>&nbsp; </td><td></td>4920000113</tr><tr><td>Fórceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Seringa de ponta curva</td></tr><tr><td>Hamilton</td><td>Hamilton (Nevada, EUA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Hemostático micro-mosquito</td><td>F.S.T (Foster City, EUA)</td><td>13011-12</td><td>Curvo, largura da ponta 1.3mm</td></tr><tr><td>Porta-agulhas&nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Xangai, China)</td> <td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>FST (Foster City, EUA)</td> <td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (Shangdong, China)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< forte > materiais e reagentes < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>CST (Danvers, &nbsp; EUA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-luciferase</td><td>Abcam (Cambridge, Reino Unido)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG</td><td>CST (Danvers,&nbsp; EUA)</td><td>&nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-VDR</td><td>Abcam (Cambridge, Reino Unido)</td><td>&nbsp; ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Thermo Scientific (Waltham, EUA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Hidras Cloralicas</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos Criogénicos</td><td>Thermo Scientific (Waltham, EUA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Veet (Xangai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco&nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&nbsp; EUA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodo</td><td>LiKang (Xangai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>tubo EP</td><td>Sarstedt (Newton, EUA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Millipore (Bedford, EUA)</td><td></td><td>Tamanho do poro 0.2 &micro; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Promega (Madison, EUA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise para western blot</td><td>Beyotime (Xangai, China)</td><td>P0013J</td><td>Sem inibidores</td></tr><tr><td>Creme oftálmico</td><td>Apex Laboratories (Melbourne, Austrália))PBS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco (Grand Island,&nbsp; EUA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td><td>Thermo Scientific (Waltham, EUA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Xangai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bola de aço</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Largura 1,5 mm</td></tr><tr><td>Agulha de seringa</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&nbsp;</td></tr><tr><td>Tapete quente</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China)</td> <td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

um método simples e eficiente para in vivo cardíaco-específicas do gene manipulação por injeção intramiocárdica em ratos

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Manipulação genética, especificamente no coração significativamente potenciar a investigação de doença cardíaca pathomechanisms e seu potencial terapêutico. Na vivo entrega cardíaco-específicas do gene é comumente conseguida entrega local ou sistêmica. Injeção sistêmica através da veia da cauda é fácil e eficiente em manipular a expressão de gene cardíaco usando vírus adeno-associado recombinante 9 (AAV9). No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor para transdução eficiente e pode resultar na transdução de gene nontarget órgão. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e economia de tempo de injeção Intramiocárdica para na vivo manipulação gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia (sem ventilação), os músculos peitorais maiores e menores foram dissecados sem rodeios, e o coração de rato foi rapidamente exposto pelo manual exteriorização através de uma pequena incisão no quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus, codificação do luciferase (Luc) e receptor de vitamina D (VDR) ou RNA de gancho de cabelo curto (shRNA) segmentação VDR, foi injetado com uma seringa Hamilton o miocárdio. Subsequentes na vivo imagem demonstrou que luciferase foi com êxito Blumental especificamente no coração. Além disso, a análise ocidental do borrão confirmou o sucesso superexpressão ou silenciamento de VDR, no coração do mouse. Uma vez dominado, esta técnica pode ser usada para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais, tais como nanogels no coração do mouse.

O protocolo do experimento e algumas das principais etapas para o método relatado são mostradas na Figura 1. Em 5 dias após a injeção Intramiocárdica de luciferase codificação de adenovírus (Adv-luc), na vivo por imagens em ratos injetado adv-luc indicado robusto superexpressão de luciferase especificamente no coração (Figura 2A, B), que foi confirmado por análise ocidental do borrão (<strong class="xfig...

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

O objetivo geral deste procedimento é alcançar a manipulação de genes cardíacos específicos in vivo, por injeção intramiocárdica de adenovírus em camundongos adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa cardiovascular sobre os mecanismos moleculares e alinhar a lesão cardíaca e a eficácia da terapia gênica. As principais vantagens desta técnica são que ela é livre de ventilação, que os camundongos se recuperam rapidamente da cirurgia e que é reprodutível e fácil de executar.Então, agora, vamos começar. No dia do procedimento, aqueça a solução purificada do vetor de adenovírus a 80 graus Celsius negativos, armazenada no gelo. Quando o adenovírus descongelar, coloque uma máscara facial, um avental estéril e luvas estéreis.E pulverize o tubo de adenovírus com 75% de etanol. Transfira o vírus para uma capela de fluxo laminar estéril e aspire 50 microlitros da solução do vírus para uma seringa Hamilton esterilizada de 50 microlitros. Coloque uma agulha de calibre 30 na seringa.Gire a seringa para a posição vertical. Pressione suavemente o êmbolo, até que uma gota de solução seja visível na ponta da agulha, para encher a ponta da agulha com vírus. Em

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Um método para controlar a fusão de células de organismos vivos ao longo do tempo é descrito. A abordagem utiliza...

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Este artigo detalha um protocolo otimizado para injeções intramiocárdicas guiadas por ecocardiografia em modelos de infarto do miocárdio em ratos usando uma agulha de 29 G x 88 mm. Essa técnica garante a administração robusta, precisa e reprodutível de agentes terapêuticos diretamente na zona peri-infarto.

Injeção guiada por ecocardiografia para entrega de células-tronco intramiocárdicas direcionadas e confiáveis em um modelo de infarto do miocárdio em ratos

Aprenda a manipulação gênica cardíaca específica em camundongos adultos por injeção intramiocárdica de adenovírus. Este método eficiente permite recuperação rápida e é ideal para pesquisas cardiovasculares.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

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