Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

Essa técnica pode ajudar a responder a questões-chave no campo da infecção celular e da microbiologia, como a forma como os hemócitos contribuem para a resposta imune geral em moscas-das-frutas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada em laboratório, utilizando larvas previamente infectadas. Alternativamente, hemócitos de larvas não infectadas podem ser usados para infecção ex vivo.

A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas de imagem são difíceis de aprender devido às complexidades do microscópio confocal e às opções para reconstrução do modelo 3D. Para iniciar o protocolo, coloque de dois a três pedaços de filme de parafina de dez centímetros por dez centímetros sob um microscópio estéreo. Em seguida, prepare o capilar de vidro ajustando o aquecedor polar capilar para 55% do máximo.

Pole o tubo capilar até uma ponta afiada de aproximadamente dez micrômetros. Preencha o capilar com óleo mineral. Monte o tubo capilar cheio no nanoinjetor.

E abra a ponta do tubo capilar fundido quebrando a ponta com uma pinça. Ejete o máximo de óleo possível da ponta do tubo capilar e, em seguida, encha o tubo com meio isolante de hemócitos de drosófila, ou DHIM. Para facilitar a visualização da borda do óleo de hemolinfa, inclua uma bolha de ar entre o óleo e o DHIM.

Usando uma pinça, pegue delicadamente dez larvas de drosófila de terceiro ínstar da parede interna dos frascos de comida e coloque-as em uma peneira de 100 micrômetros. Despeje cinco mililitros de água estéril nas larvas e agite a peneira por cinco segundos. Coloque o filtro em um lenço de tarefas para remover o excesso de água.

Transfira as larvas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, anestesieste-as com gás CO2 por cinco segundos. Em seguida, coloque as larvas em filme de parafina sob o microscópio estéreo, com o lado dorsal voltado para cima. Coloque o capilar de vidro levemente no corpo posterior da larva para mantê-lo no lugar e abra a cutícula posterior usando uma pinça pontiaguda.

Permita que a hemolinfa flua para o filme de parafina. Faça um pool de hemolinfa, incluindo hemócitos, de 20 a 50 larvas por vez, no filme de parafina. Use o capilar de vidro no nanoinjetor para absorver a hemolinfa acumulada.

Ejete a hemolinfa em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de DHIM. Coloque a pasta de fermento em um prato de ágar suco de uva. Faça um corte fino no ágar onde as larvas podem migrar para evitar o ressecamento.

Monte uma agulha de tungstênio pontiaguda de 0,001 milímetro com pinça de retenção usando filme de parafina. Pipete 50 microlitros de C.Burnetii de alto título, expressando mCherry, no filme de parafina sob o microscópio estéreo e coloque as larvas no pool de bactérias. Pique as larvas com uma agulha de tungstênio.

Transfira as larvas para uma placa de ágar. Transfira o meio patógeno restante para a placa de ágar e sele a placa com filme de parafina. Mantenha as larvas na placa em ar úmido até o tempo desejado após a infecção.

Deixe as larvas infectadas com C. Burnetii no prato por 24 horas. Coloque uma lamínula redonda de 12 milímetros em um poço de uma placa de 24 poços. Pipete 500 microlitros de DHIM no poço.

Extraia e absorva a hemolinfa de larvas previamente infectadas e, em seguida, ejete a hemolinfa no poço. Centrifugar a placa a 1000 G durante cinco minutos. Configure o microscópio confocal para imagens tricolores de DAPI, EGFP e mCherry.

Coloque a amostra no microscópio e foque na amostra usando uma objetiva de abertura numérica de 63x 1,4. Localize os hemócitos desejados no campo de visão para obter imagens. Em seguida, ajuste a potência do laser e os ganhos do detector para obter a exposição apropriada da amostra.

Verifique vários planos Z para garantir que o nível de exposição seja apropriado para toda a espessura da amostra. Em seguida, encontre a posição superior e inferior no eixo Z de um hemócito inteiro. Defina essas posições como as posições inicial e final para o corte Z.

Use o zoom de varredura para obter imagens da área que contém o hemócito. Colete a série de imagens na resolução apropriada, como 1024 por 1024 pixels no plano X Y e espaçamento de 0,3 micrômetro na dimensão Z. Importe o arquivo da série de imagens seccionadas Z para o software associado ao microscópio confocal para reconstrução do modelo 3D.

Selecione uma co-localização de núcleos corados com DAPI e C.Burnetii que expressam mCherry em um hemócito que expressa EGFP. Corte a série de imagens para conter apenas uma única célula. Selecione a opção visualizador 3D, que reconstrói o modelo 3D usando o algoritmo pré-empacotado do software.

Escolha o tipo de imagem desejado para representação 3D entre as opções de combinação, superfície e mista. Neste método, hemócitos, núcleos e C. Burnetii são mostrados usando modelos de superfície. Observe a célula reconstruída em 3D de várias posições de visualização segurando o botão do mouse e arrastando o cursor pela tela.

Ajuste a orientação da célula e a posição da fonte de luz modelada para otimizar a imagem. Por fim, faça seções transversais através do modelo usando comandos de recorte e corte para visualizar o conteúdo interno do hemócito. A visualização dos hemócitos vivos extraídos expressando EGFP sob controle do driver de hemolectina a partir de várias imagens mostra que a maioria das células DAPI-positivas também são EGFP-positivas.

Seções transversais de hemócitos infectados por Coxiella Burnetii confirmam a presença de bactérias que expressam mCherry no interior da célula. As imagens foram reconstruídas em modelos 3D e observamos que os hemócitos infectados in vivo exibiam maiores extensões citoplasmáticas e eram de natureza mais plana. Enquanto os hemócitos infectados ex vivo eram mais esféricos.

As seções transversais de ambos os modelos confirmam a presença de Coxiella que expressa mCherry no interior da célula. Os hemócitos extraídos foram infectados com IIV6 e aplicados à análise de PCR qRT, que mostrou níveis significativamente mais altos do transcrito IIV6-193R entre células simuladas e infectadas por IIV6. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter todos os meios preparados com antecedência e equilibrados à temperatura ambiente para que as células não fiquem sem os nutrientes adequados por muito tempo.

Após esse procedimento, outros métodos, como a busca de RNA de célula única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a resposta geral do hospedeiro à infecção. Após seu desenvolvimento, essa técnica ajuda pesquisadores em imunologia e microbiologia a explorar a invasão de patógenos e as respostas do hospedeiro em moscas-das-frutas ou outros animais com sistema circulatório aberto.