Um sangue com base em teste para a detecção de ROS1 e RET transcrições de fusão do ácido ribonucleico, usando a reação em cadeia da polimerase Digital de circulação

O objetivo geral deste procedimento é o isolamento e caracterização por PCR digital de gotículas de ácido ribonucléico circulante derivado de tumor de amostras de sangue total. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do diagnóstico oncológico. Por exemplo, como detectar transcrições de fusão de genes derivados de tumor de amostras circulantes de RNA e sangue.

A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza métodos altamente otimizados para a estabilização, extração e detecção de variantes de RNA presentes em amostras de baixa frequência e sangue. O teste de sangue é um complemento às biópsias de tecido tradicionais com o benefício de utilizar uma técnica minimamente invasiva que pode fornecer resultados rápidos. Embora este método possa fornecer informações sobre mutações clinicamente significativas e NSCLC, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde é necessária a identificação rápida e acessível de moléculas de RNA circulantes no sangue total.

O RNA circulante para a reação de transcrição reversa é isolado de amostras de sangue de doadores, conforme descrito no protocolo de texto. Converta a amostra de RNA circulado concentrado em cDNA usando um kit de reação de transcrição reversa disponível comercialmente, incluindo primers aleatórios. Inclua uma amostra de controle sem transciptase reversa e uma amostra de controle sem RNA.

Quando a reação de transcrição reversa estiver completa, isole o cDNA da mistura de reação, usando uma coluna de rotação do concentrador de DNA disponível comercialmente. Esta etapa facilita a remoção de enzimas, primers e trifosfatos de desoxinucleotídeos livres. Se o cDNA não for usado imediatamente nas reações de PCR, armazene a 80 graus Celsius negativos.

Use um jaleco de descarte e luvas de nitrilo ao realizar este procedimento e uma área dedicada à preparação de reagentes. Cubra as sondas para protegê-las da luz, pois a luz sucessiva pode branquear o corante fluorescente preso à sonda. Primeiro prepare as misturas de PCR para um volume de reação final de 20 microlitros, conforme indicado nesta tabela, mas sem ainda adicionar o cDNA.

Em seguida, transporte as misturas, cobertas e protegidas da luz para uma coifa limpa de PCR, localizada em uma área de pré-amplificação separada. Distribua as misturas para uma placa de PCR. Adicione o cDNA a ser testado à mistura de PCR.

Cubra a placa com um selador de placa removível. Centrifugue as placas brevemente para coletar as amostras no fundo dos poços. Misture em uma coqueteleira, em fogo baixo, por 10 segundos.

Centrifugue as placas brevemente novamente para coletar as amostras no fundo do poço. Remova o selador de placas antes de realizar a geração manual de gotículas. É importante minimizar as bolhas na ponta da pipeta ao carregar as amostras e, posteriormente, transferir as gotículas lentamente do cartucho para a placa para evitar danos às gotículas.

Transfira cuidadosamente 20 microlitros da mistura de PCR para os poços de amostra no cartucho de geração de gotículas. Adicione 70 microlitros de óleo de geração de gotas. Cubra com uma junta de borracha e transfira o cartucho para um gerador de gotículas manual para iniciar a geração de gotículas.

Após a geração de gotículas, use pontas recomendadas pelo fabricante para transferir gotículas para uma nova placa de PCR. Aspire e dispense as gotículas lentamente, durante 5 a 6 segundos cada, sem tocar a extremidade da ponta no cartucho ou placa de gotículas. Sele a placa com um selador de placa de alumínio.

Execute a PCR no termociclador usando as seguintes configurações. Após a conclusão da execução do termociclador, leia a placa usando um leitor de gotículas. Crie um layout de placa para o software leitor que identifique a localização dos controles e amostras e carregue no software para iniciar a leitura.

Os resultados da leitura da placa são analisados usando software disponível comercialmente. Comece navegando até o menu de análise para visualizar gráficos de amplitude bidimensionais ou 2D. Avalie a qualidade geral dos dados examinando os dados das gotículas.

Usando o menu de eventos, avalie os dados para o total de números de eventos aceitos. Deve haver mais de 10.000 eventos por poço. Caso contrário, os dados devem ser cuidadosamente avaliados quanto a problemas adicionais.

Em seguida, verifique os dados para amplitudes de fluorescência abomináveis. Diferenças significativas de amplitude e concentração entre amostras replicadas indicam manuseio ou mistura inadequados de amostras. Anote os aglomerados de gotículas com padrões de pulverização em um eixo de 45 graus, o que é indicativo de gotículas de baixa qualidade ou amostras problemáticas.

Examinar primeiro os dados relativos ao controlo positivo, sem controlo da transcriptase inversa e sem controlo de ARN. Selecione todas as amostras de controle e examine a qualidade do cluster por gráfico 2D para um limite adequado, uma separação clara entre o cluster de gotículas deve ser aparente. Para cada variante de ensaio, defina o limite com base nos poços de controle.

Defina limites em gráficos 2D usando as ferramentas de mira para separar a população de gotículas duplamente negativas da população de genes de controle no eixo x e da população de genes variantes, se presente, no eixo y. Algumas cópias de cada replicante para uma única amostra. Por fim, expresse os resultados do teste como o número de cópias variantes detectadas.

Usando linhagens celulares, expressando fusão SDC4-ROS1 e fusão CCDC6-RET, diluídas no fundo do RNA total do tipo selvagem humano, o limite de detecção estabelecido em 0,2% de frequência de variantes com cada variante de fusão. Uma preparação de 5% de RNA derivado da linha celular alvo não foi detectada, demonstrando especificidade do ensaio. Os padrões analíticos de RNA multiplex foram medidos em concentrações altas, médias e baixas em três execuções no mesmo dia.

Três corridas em três dias consecutivos e com dois operadores independentes. Os resultados demonstram a detecção precisa do transcrito de fusão de interesse, bem como de um gene de controle interno GUSB. Cada tipo de amostras clínicas também foi executado com um controle positivo, um controle sem transcriptase reversa e um controle sem molde de RNA.

As variantes de fusão são representadas ao longo do eixo y, enquanto o GUSB está no eixo x. Quando os controles de lote foram avaliados ao longo de 21 dias, gotículas positivas para fusão e gotículas do gene de controle GUSB foram observadas para ROS1 e RET em todas as corridas. Representantes de resultados abaixo do ideal são mostrados onde há contaminação dentro do controle sem transcriptase reversa, contaminação dentro do controle sem RNA, compartilhamento e coalescência de gotículas e condições de PCR mal otimizadas ou inibição de PCR.

Uma vez dominado, todo esse protocolo pode ser feito em aproximadamente 12 horas. Ao tentar este procedimento, é importante usar as melhores práticas para lidar com amostras de RNA e sangue humano. Após o isolamento do RNA, outros métodos, como o sequenciamento de próxima geração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identificação de novas variantes de fusão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o RNA circulante do sangue total e do plasma e, em seguida, processar o RNA recuperado para identificar variantes raras em circulação, como RET e ROS1. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a detecção de mutações clinicamente acionáveis do sangue total. E estendemos esses métodos para examinar transcritos superexpressos em circulação.