Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral deste protocolo de imunoprecipitação da cromatina é determinar a abundância e a localização de modificações de histonas em regiões definidas ao longo do genoma da levedura em brotamento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regulação da cromatina, como como as modificações de histonas estão ligadas ao controle da expressão gênica e como essas modificações mudam em resposta a diferentes condições ambientais. Um protocolo extremamente versátil que pode ser usado para investigar muitas modificações diferentes de histonas e várias cepas E ao mesmo tempo.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as modificações de histonas, ele também pode ser aplicado à investigação de outras proteínas de ligação da cromatina por meio do uso de tags de epítopos ou anticorpos disponíveis. Inicie este procedimento cultivando as células de levedura, inocule 10 mililitros de meio YPD com uma única colônia de cada cepa apropriada e cultive-a a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada a 220 rpm durante a noite. No dia seguinte, após medir a densidade óptica a 600 nanômetros ou OD600 da cultura, diluir a cultura para um OD600 de 0,2 em 100 mL de YPD em um novo frasco.

Cultive as células a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada a 220 rpm até que atinjam a fase logarítmica intermediária. Quando as culturas atingirem a fase logarítmica intermediária, adicione 2,7 mililitros de formaldeído a 37% diretamente ao meio em cada frasco para obter uma concentração final de 1% de formaldeído. Transferir os balões para um agitador à temperatura ambiente e agitar a 50 rpm durante 15 minutos.

Adicione cinco mililitros de glicina 2,5 molar ao meio e continue agitando a 50 rpm em temperatura ambiente por cinco minutos para extinguir o formaldeído. Em seguida, gire as células e lave-as conforme descrito no protocolo de texto. Remova o sobrenadante após a última centrifugação e prossiga para fazer lisados de levedura.

Ressuspenda as células em um mililitro de precipitação de aminoácidos de cromatina fria ou tampão de lise ChIP com PMSF 1 milimolar e diluição de 1:1000 de um coquetel inibidor de protease de levedura. Transfira a suspensão para um tubo com tampa de rosca de 2,0 mililitros contendo 200 microlitros de contas de vidro. Transfira as células para um aparelho de bater contas para uma agitação de alta velocidade a quatro graus Celsius.

Bata por 30 segundos e gelo por um minuto. Bata com contas um total de seis vezes, mantendo as células no gelo por pelo menos um minuto entre cada batida de 30 segundos. Usando uma ponta de carregamento de gel, transfira o lisado para um tubo de 1,5 mililitro.

Centrifugar o lisado a 15 500 g a quatro graus Celsius durante 20 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 250 microlitros de tampão de digestão de nuclease microcócica, pipetando suavemente para cima e para baixo. Adicione 2,5 microlitros de nuclease microcócica a cada reação.

Misture delicadamente invertendo quatro a seis vezes e incube imediatamente em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após 20 minutos, interrompa a reação colocando os tubos no gelo, adicionando cinco mililitros de EDTA 0,5 molar para uma concentração final de 10 EDTA milimolar e misturando suavemente por inversão. Centrifugar a 15.500 g a quatro graus Celsius durante 15 minutos.

Em seguida, transfira cada sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro. Para obter resultados mais consistentes, é fundamental garantir que a mesma concentração de proteína seja usada em cada precipitação de aminoácidos. Dependendo do número de precipitação de aminoácidos ou reações IP, faça uma mistura principal de cada fração de cromatina liberada pela nuclease microcócica e tampão de lise ChIP e aloque um mililitro contendo 50 microgramas de proteína total para tubos individuais.

Remova 100 microlitros de cada mistura IP para processar como amostra de entrada. Congele as amostras de entrada a 20 graus Celsius para uso posterior. Também é importante certificar-se de que a mesma quantidade de grânulos ligados ao anticorpo seja usada para cada imunoprecipitação.

Usando uma ponta de pipeta larga, adicione 20 microlitros de grânulos de proteína magnética AG, pré-ligados com anticorpo a cada amostra IP. Gire as amostras a oito rpm a quatro graus Celsius por três horas. Quando o IP estiver concluído, coloque os tubos em um suporte magnético e deixe as contas se acumularem na lateral do tubo.

Use uma pipeta para remover o sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão de lise ChIP aos grânulos e gire a oito rpm a quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, coloque os tubos no suporte magnético e remova o sobrenadante.

Desta forma, lave as contas sucessivamente com os seguintes tampões pelo número de vezes indicado. Tampão de lise ChIP, tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão de lavagem LiCl / detergente e TE. Com a última lavagem com TE, use 0,5 mililitros de TE para transferir a maioria dos grânulos para um novo tubo e, em seguida, use mais 0,5 mililitros de TE para lavar o tubo e transferir os grânulos restantes. Adicione 250 microlitros de tampão de eluição ChIP recém-feito a cada tubo e vortex a solução brevemente.

Gire as amostras a oito rpm em temperatura ambiente por 15 minutos. Coloque os tubos no suporte magnético. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo e evite as contas.

Adicione mais 250 microlitros de tampão de eluição ChIP aos grânulos. Gire as amostras a oito rpm em temperatura ambiente por 15 minutos. Com cuidado e sem perturbar os grânulos, transferir o sobrenadante para o tubo que contém a primeira eluição.

Descongele as amostras de entrada coletadas anteriormente e adicione 400 microlitros de tampão de eluição ChIP a cada amostra de entrada. Para reverter as ligações cruzadas do DNA da proteína, adicione às amostras de entrada e IP, 20 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares, cinco microlitros de glicogênio e 12,5 microlitros de Proteinase K. Misture bem invertendo ou sacudindo os tubos. Incube as amostras em banho-maria a 65 graus Celsius durante a noite.

Para iniciar este procedimento, faça uma mistura mestre de QPCR para cada conjunto de primers combinando os volumes apropriados de mistura de QPCR, o primer direto e o primer reverso. Faça misturas mestras de DNA para cada amostra de DNA onde uma reação contém 0,5 microlitros de DNA e 4,0 microlitros de água livre de nuclease Adicione 5,5 microlitros da mistura mestre de primer apropriada a cada poço em uma placa QPCR de 384 poços. Gire o prato a 200 g em temperatura ambiente por um minuto.

Em seguida, adicione 4,5 microlitros da mistura mestre de DNA apropriada a cada poço. Feche a placa e centrifugue a 200 g à temperatura ambiente durante um minuto. Execute o QPCR usando um sistema QPCR em tempo real com as seguintes condições, 95 graus Celsius por três minutos, 40 ciclos de 95 graus Celsius por 10 segundos e 55 graus Celsius por 30 segundos e uma curva de fusão de 65 graus Celsius a 95 graus Celsius com incrementos de 0.5 graus Celsius por cinco segundos.

Um componente-chave deste protocolo é otimizar a concentração de nuclease microcócica usada para digerir a cromatina em fragmentos solúveis. Este exemplo de eletroforese em gel de DNA isolado após a digestão do pellet de cromatina com quantidades variáveis de nuclease microcócica mostra que 2,5 microlitros de enzima a 20 unidades por microlitro produziram predominantemente mononucleossomos. Este experimento ChIP representativo usou anticorpos contra um marcador metil histona H3K4me2 e histona H3 em células nocaute do tipo selvagem e set1.

As células knockout do Set1 não possuem a metil transferase que catalisa a marca As barras indicam o enriquecimento relativo de H3K4me2 no baixo sci indicado. A cepa do tipo selvagem mostrou um claro enriquecimento para H3K4me2 nas cinco extremidades primárias de dois genes conhecidos por serem alvos diretos de set1, PMA1 e ERG11, enquanto nenhum sinal foi observado em células knockout set1. Como esperado, não houve enriquecimento da marca H3K4me2 em TEL07L, a expressão de SPR3 também foi relatada como regulada pelo conjunto1, mas esses resultados indicam que a regulação provavelmente ocorrerá por um mecanismo diferente do que em PMA1 ou ERG11.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar cuidadosamente o anticorpo usado para especificidade com os controles adequados. Se disponíveis, as regiões de controle positivo e negativo devem ser investigadas no QPCR.

Após este procedimento, outros métodos como o sequenciamento GP também podem ser realizados para determinar o genoma pela distribuição de modificações de histonas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar consistentemente os níveis de diferentes modificações de histonas em regiões genômicas exclusivas com experimentos bem controlados.