Name: Microdissecação do órgão do esmalte do incisivo de ratos expostos a tóxicos ambientais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a microdissecção do órgão do esmalte de ratos para estudar ameloblastos em diferentes estágios de diferenciação celular. Esta técnica permite análises quantitativas como imunohistoquímica sem tratamentos prévios.

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Este trabalho foi financiado pela Universidade Paris-Diderot, o Instituto Nacional francês de saúde e pesquisa médica (INSERM) e o Instituto Francês de pesquisa odontológica (IFRO).

Todos os animais utilizados neste estudo foram mantidos de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do Ministério da agricultura (A-75-06-12).
1. animal exposição a substâncias tóxicas
<ol><li>Antes de realizar este protocolo, obter aprovação institucional necessária e certifique-se de cumprir todas as orientações de cuidados com animais.</li>
	<li>Aplica o design do protocolo de pesquisa que permite a constituição de diferentes grupos experimentais para testar o impacto do molecule(s) investigado na fase de secreção de Ameloblasto e o estágio de maturação do Ameloblasto. Aqui, quatro grupos de ratos Wistar machos foram constituídos dependendo de sua exposição ao fluoreto (NaF) em combinação ou não com a ABP (figura 1A)2. Todos os animais foram observados e dissecados em dia 65 (figura 1B).</li>
</ol>2. dissecação de Hemi-mandíbulas de ratos adultos
<ol><li>Eutanásia em ratos por asfixia de CO2 , opcionalmente seguida por decapitação na cabeça separada do resto do corpo. Expor os ratos de CO2 por 5 min em uma caixa dedicada16.</li>
	<li>Remova toda a pele dos lábios inferiores usando um bisturi #11 a fim de obter acesso fácil aos incisivos inferiores.</li>
	<li>Com o bisturi mesmo, fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores com uma ligeira pressão e mandíbula será dividida em duas metades.</li>
	<li>Cortar a articulação mandibular temporal com um bisturi para desanexar o maxilar e segurar a hemi-mandíbula com uma pinça fina.</li>
	<li>Corte os tecidos moles circundantes com um bisturi e retire todos os músculos, tendões e ligamentos, com uma espátula até que o osso está completamente limpo.</li>
</ol>3. isolamento do incisivo17,18
<ol><li>Cuidadosamente raspe o osso, colocando a lâmina paralela ao eixo longitudinal principal do incisivo. Começa a crista óssea perto as dicas do incisivo (extremidade proximal) até o final do incisivo perto do loop do colo do útero. O movimento de incisão procede de proximal para distal direção.</li>
	<li>Fazer um primeiro corte distalmente ao lacete cervical com o bisturi para remover o Gônio da hemi-mandíbula e permitir tirar o incisivo facilmente sem danificar a ansa cervical ou fase secretora de ameloblastos (linha vermelha na Figura 2).</li>
	<li>Faça um segundo corte abaixo o segundo molar e inserir o bisturi entre o osso e a superfície medial do incisivo. Quando todo o osso basal é levantado, girar para fora o incisivo e tirar com cuidado para evitar esmalte tecido órgão prejudicar usando uma pinça fina.</li>
</ol>4. microdissecação do órgão do esmalte sob lente Binocular
<ol><li>Largue a 200 µ l de tampão fosfato salino (PBS 1x) sobre o incisivo usando uma pipeta. Leve o incisivo com uma pinça fina com a superfície labial voltada para cima. Deixar um bisturi marca entre o incolor e as laranja partes do tecido. Esta marca corresponde a mancha branca subjacente que está sendo observado mais tarde (Figura 2).</li>
	<li>Raspe, com uma escavadeira ou ferramenta equivalente, superfície celular das marcas de bisturi para o correspondente da extremidade apical de ameloblastos (incolor) fase de secreção e para a marca de bisturi para a ponta do incisivo para os ameloblastos de palco (laranja) de maturação.</li>
	<li>Remova o tecido de 2mm, correspondente à fase de transição, como anteriormente descrito,19. Não abra o incisivo durante a dissecção de órgão do esmalte para evitar contaminação pela mesênquima.</li>
	<li>Cortar o laço cervical situado imediatamente na parte apical do incisivo (Figura 2) conforme descrito anteriormente20.</li>
	<li>Cobrá-lo em solução de formalina ou lise de 10% para mais investigações (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>5. coleção de tecidos de órgãos separados esmalte para investigações
<ol><li>Queda de 200 µ l PBS 1 X tampão sobre o incisivo.</li>
	<li>Com uma lâmina de bisturi #11, cuidadosamente separe as células epiteliais dentais gradualmente no buffer, separadamente para cada estágio com a ajuda da marca bisturi feita anteriormente.</li>
	<li>Para a célula do RNA e extrações de proteína, coloque o tecido em uma solução de Lise que permite a extração de proteínas e RNAs (ver Tabela de materiais). Nota: Prepare RNAs de alta qualidade, transformando o tecido-escavadeira no tubo e em seguida moer as células até obter uma mistura homogénea. A mistura está pronta para extração de RNA e proteína de acordo com o procedimento do fabricante, o que foi descrito anteriormente,2,8,17. Geralmente, aproximadamente 5-10 µ g total RNAs e 150 µ g proteínas totais foram obtidas para cada preparação.</li>
	<li>Para análise histológica, imuno-histoquímica (IHC) e a hibridação in situ (ISH), colocam a camada de células em formol a 10% por 2 h e, em seguida, loja a 4 ° C em PBS 1x. O tecido pode então ser incorporado em cera/parafina ou tecido OCT para seções congeladas.</li>
	<li>Para extrações de EMP, leve o incisivo com pinça fina. Após uma curta exposição ao ar (desidratação ligeira), uma mancha branca será visível em torno da parte média da superfície vestibular do incisivo, que representa o início da mineralização do esmalte. Esta mancha branca corresponde a transição- / cedo maturação-estágio de ameloblastos, então usá-lo como um indicador para a extração de EMPs21.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Atividade Ameloblasto alterado e/ou interrompidos Ameloblasto proliferação, diferenciação e liderança de processos de maturação a defeitos de esmalte irreversível e, por sua vez, a caracterização de defeitos de esmalte pode ajudar a desenvolver a compreensão de que a alteração Ameloblasto atividade durante a Amelogênese. Assim, os estudos sobre o órgão do esmalte isoladas são determinantes para elucidar os eventos patológicos levando a esmalte defeitos seja qual for a sua origem, ambiental ou genética.
<p class="jove...

Muitos defeitos de esmalte do desenvolvimento podem resultar da exposição a tóxicos ambientais e/ou estilo de vida inadequado1,2,3,4. Caracterização de perturbar eventos e moléculas de Amelogênese usando o procedimento descrito neste momento irá promover o uso de defeitos de esmalte resultante como primeiros marcadores de exposição à várias substâncias tóxicas e pode ajudar a reconstituir a história da saúde de cada paciente durante o período perinatal, quando o esmalte é synthetized1,2. Síntese de esmalte pode ser dividido em quatro fases principal, dependendo do Ameloblasto atividade5. O primeiro passo reagrupa proliferação de célula e pre-Ameloblasto precursor. Durante a segunda etapa, ameloblastos diferenciados secretam proteínas da matriz esmalte (EMPs), principalmente amelogenina, enamelin e ameloblastin, que determinam a espessura do esmalte final. Assim, qualquer interrupção da síntese de EMP leva a defeitos quantitativos do esmalte. Após a deposição da espessura de esmalte cheia, começa a fase de maturação. Durante este estágio, crescimento de apatita do cristalite em largura e espessura permite que o esmalte alcançar a mais elevada relação de mineralização encontrada em um tecido biológico, com até 96% em peso. Defeitos de esmalte desreguladoras eventos que ocorrem durante a liderança da fase maturação qualitativa. Finalmente, ameloblastos entram numa fase de post-maturação, também chamada de pigmentação em roedores e sofrem apoptose durante a erupção do dente fazendo defeitos de esmalte (se houver) irreparáveis e irreversíveis, assim, defeitos fornecem potencial gravação retrospectiva de Ameloblasto salienta. Em roedores, Amelogênese segue uma sequência semelhante de eventos com a particularidade que os incisivos estão crescendo continuamente, o que os torna um modelo adequado para estudar o processo geral de Amelogênese. Assim, qualquer interrupção da Amelogênese resulta em alterações da qualidade do esmalte e/ou quantidade, dependendo da janela de tempo do evento perturbador. Nesse sentido, a exposição a dioxinas, chumbo e sistema endócrino (CDE) como bisfenol A (BPA), genisteína e vinclozolina, têm sido mostrados para gerar esmalte hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Assimétricos brancos opacos pontos foram identificados sobre os incisivos de ratos expostos a uma dose BPA de baixa dose durante o período fetal e o primeiro mês após o nascimento1. Estes defeitos de esmalte em ratos e aqueles de hipomineralização humana molar incisivo (MIH), possuem características semelhantes de clínicas, estruturais e bioquímicas. MIH é uma patologia de esmalte dental recentemente descrito, para que a etiologia ainda permanece incerto9,10 , apesar de muitos fatores causais tendo sido a hipótese de9,10,11 ,12.
Outra patologia de hipomineralização esmalte importantes devido a fatores ambientais é a fluorose dental (DF), que é a consequência da absorção excessiva de flúor (> 0,1 mg/kg/dia)13,14. A principal fonte de flúor é a água potável que é completada ou naturalmente enriquecida com flúor. Flúor é também muitas vezes prescrito para prevenir a cárie dentária, mas a dose profilática é 50% menor do que a um tóxico (≤0.05 mg/kg/dia). MIH e DF, duas patologias frequentes resultantes da exposição a fatores ambientais, podem apresentar características comuns que precisam ser caracterizados devido a potencialização dos efeitos hypomineralizing de flúor combinado com outras substâncias tóxicas como CDE2 ou amoxicilina15.
Microdissecação do órgão do esmalte rato contendo ameloblastos em fases diferentes de diferenciação vai ajudar a entender o mecanismo de ação das moléculas capazes de interromper a atividade Ameloblasto e causar defeitos de esmalte ser diagnosticada após a erupção do dente. Em outras palavras, a caracterização das alterações do esmalte gene expressão e esmalte matriz composição devido a tóxicos ambientais permite a reconstituição da história de exposição a substâncias tóxicas e facilita o monitoramento de segurança ambiental para o público saúde.

<table><tbody><tr><td>Bisfenol A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>formalina 10%</td> <td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagent</td><td>Euromedex, França</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen, Les Ulis, França</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Anticorpo do receptor de andrógeno</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>anticorpo policlonal de coelho</td> <td>sc-816</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330. Um</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de sódio (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>paraplast regular</td><td>Leica microsystems, Nanterre cedex,&nbsp; França</td><td>39601006</td><td>chamado was/parafin no tecido de texto</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, França</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Bonn Extra Fina - Reta/8,5 cm</td><td>PHYMEP , Paris, França</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Cabo para Lâminas de Bisturi - 12,5 cm</td><td>PHYMEP, Paris, França</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Bisturi Curva</td><td>PHYMEP , Paris, França</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>Faca de Dissecação - Ponta Fina/Reta</td><td>PHYMEP, Paris, França</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>Faca de Círculo</td><td>PHYMEP, Paris, França</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de bisturi n&deg; 11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, França</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>lente binocular</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp; França</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissecação do órgão do esmalte do incisivo de ratos expostos a tóxicos ambientais

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Esmalte defeitos resultantes de condições ambientais e as formas de vida são preocupações de saúde pública por causa de sua alta prevalência. Estes defeitos resultam de actividade alterada das células responsáveis pela síntese de esmalte chamado ameloblastos, que apresentam no órgão do esmalte. Durante a Amelogênese, ameloblastos seguem uma sequência específica e precisa dos acontecimentos de proliferação, diferenciação e morte. Um rato continuamente crescendo incisivos é um modelo experimental adequado para estudar Ameloblasto fases de atividade e diferenciação em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos um método confiável e consistente para microdissecar o órgão do esmalte de ratos expostos a tóxicos ambientais. O epitélio dental microdissecado conter secreção e maturação-estágio ameloblastos que podem ser utilizados para experiências qualitativas, tais como ensaios de imuno-histoquímica e hibridação in situ , bem como para análises quantitativas como RT-qPCR, RNA-seq e mancha ocidental.

Muitos esmalte defeitos, tais como fluorose dentária12,13, pode resultar de condições ambientais devido à absorção excessiva de flúor ou esmalte hipomineralização semelhante a MIH devido à exposição a alguns CDE1, 7,22. Esses defeitos no desenvolvimento do esmalte podem ser reproduzidos experimentalmente em ratos (Fi...

Noções básicas sobre esmalte formação e possíveis alterações requer o estudo da atividade do Ameloblasto. Aqui, descrevemos um método confiável e consistente para microdissecar o esmalte órgãos contendo ameloblastos fase de maturação e de secreção que podem ser utilizados para procedimentos experimentais mais quantitativos e qualitativos.

Microdissecação do órgão do esmalte do incisivo de ratos expostos a tóxicos ambientais

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

O objetivo geral deste procedimento é microdissecar o órgão do esmalte de ratos e separar o epitélio dentário de acordo com os principais estágios de diferenciação celular durante a síntese do esmalte. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das patologias do esmalte, como fluorose dentária, hiperesmaltização molar incisivo e hereditário gênese imperfeita do esmalte. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de analisar melhor as células dentárias usando experimentos quantitativos, como imuno-histoquímica, sem nenhum tratamento prévio, bem como investigações conseqüentes, como Embora este método possa fornecer informações sobre a mecânica molecular de moléculas endógenas e exógenas capazes de interromper a hemogênese.Depois de sacrificar um rato experimental, remova toda a pele dos lábios inferiores usando um bisturi número 11 para obter fácil acesso aos incisivos inferiores. Em seguida, com o mesmo bisturi, faça uma incisão entre os dois incisivos inferiores. Ao aplicar uma leve pressão, a mandíbula se dividirá em duas metades.Em seguida, corte a articulação temporo-mandibular com o bisturi para desprender a mandíbula enquanto segura a hemimandíbula com uma pinça fina. Em seguida, corte os tecidos moles circundantes com um bisturi e remova todos os músculos, tendões e ligamentos usando um raspador até que o osso esteja completamente limpo. Para isolar o incisivo, raspe cuidadosamente o osso, colocando a lâmina paralela ao eixo longitudinal maior do incisivo.Comece a raspar na crista óssea, perto das pontas do incisivo, e trabalhe em direção à outra extremidade do incisivo, perto da alça cervical. Em seguida, faça uma incisão com o bisturi, distalmente à alça cervical para remover o gônio da hemimandíbula, facilitando assim a remoção do incisivo sem danificar a alça cervical ou o estágio secretor de ameloblastos. Em seguida, faça um segundo corte abaixo do segundo molar e insira o bisturi entre o osso e a superfície medial do incisivo.Quando todo o osso basal for levantado, gire o incisivo para fora e remova-o cuidadosamente usando uma pinça fina para evitar danificar o tecido do órgão do esmalte. Agora todo o incisivo está isolado. Para a dissecção, cubra o incisivo com 200 microlitros de PBS em um prato ou placa de 60 milímetros.Para começar, corte a alça cervical, situada imediatamente na parte apical do incisivo, conforme descrito anteriormente. Em seguida, segure o incisivo com uma pinça fina, com a superfície labial para cima, e faça uma marca de bisturi no final da parte incolor do tecido. Esta marca corresponde a uma mancha branca subjacente que será observável mais tarde.Agora, use uma escavadeira ou ferramenta equivalente para raspar a superfície da célula da marca até a extremidade apical, que corresponde a ameloblastos incolores no estágio de secreção. Em seguida, faça uma marca de bisturi no início da parte laranja, correspondendo aos ameloblastos do estágio de maturação e raspe da marca do bisturi até a ponta do incisivo. Agora remova os dois milímetros de tecido que correspondem ao estágio de transição ameloblastos.Não abra o incisivo durante a dissecção do órgão do esmalte, pois isso contaminará os tecidos dissecados com mesênquima. Por fim, armazene os tecidos em formol a 10% ou solução de lise para investigações posteriores. Para uma extração de proteína da matriz do esmalte, remova o incisivo da solução brevemente até que uma mancha branca se torne visível ao redor da parte central da superfície labial.Esta mancha representa o início da mineralização do esmalte e corresponde à transição para ameloblastos em estágio inicial. Corte essa região do tecido e trate-a conforme necessário. Se o tecido removido for para extrações de RNA celular e proteínas, use um kit comercial para realizar a extração.Transfira o tecido removido para a solução de lise e triture-o em uma mistura homogênea. Para análises histológicas, imuno-histoquímica e hibridização NC2, colocar o tecido coletado em formol a 10% por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, transfira o tecido para PBS e armazene-o a quatro graus Celsius.Mais tarde, o tecido pode ser incorporado em cera, parafina ou OCT de tecido. Quatro grupos de ratos machos de cauda branca foram constituídos dependendo de sua exposição ao flúor em combinação ou não com BPA. Todos os animais foram observados e dissecados no dia 65, conforme descrito.A qualidade dos tecidos de esmalte microdissecados foi verificada por meio da coloração tricrômica de Masson. A observação microscópica mostra células epiteliais típicas do esmalte e palocida de ameloblasto. A ausência de contaminação mesenquimal foi atestada pela ausência de coloração verde de colágeno.Os ameloblastos do estágio de secreção expressam a esmaltina. Os ameloblastos do estágio de maturação expressam kalikine four e também contêm altos níveis de feratina, dando-lhes a capacidade de armazenar grandes quantidades de ferro responsável pela cor laranja do esmalte. Esses RNAs são preferencialmente expressos por ameloblastos em vez de células mesenquimais.O colágeno um, por outro lado, é expresso por células mesenquimais e não por ameloblastos. A imuno-histoquímica foi então usada para pontuar quatro proteínas específicas nos ameloblastos do estágio de secreção ou maturação. Por exemplo, um receptor de andrógeno, visto em verde, está especificamente localizado nos ameloblastos do estágio de maturação.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microdissecar, o órgão de esmalte de roedores para uma separação bem-sucedida entre os estágios de secreção e maturação dos ameloblastos. Essa abordagem é muito útil para a compreensão dos mecanismos de fatores-chave in vivo responsáveis pela doença patológica e fisiológica do esmalte.

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir localmente o periodontite apical nos ratos. Nós mostramos como perfurar um furo no dente do rato e expor sua polpa, a fim causar a inflamação local. Métodos de análise para investigar a natureza desta inflamação, tais como Micro-CT e histologia, também são demonstrados.

Induzindo a periodontite apical em camundongos

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

O protocolo atual apresenta um método rápido, eficiente e suave para isolar células únicas adequadas para análise de RNA-seq unicelular a partir de um incisivo de rato em crescimento contínuo, molar de rato e dentes humanos.

Isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos

O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.

Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

A microdureza é uma propriedade mecânica e um parâmetro informativo para avaliar a fisiopatologia do tecido duro. Aqui, demonstramos um protocolo padronizado (preparação de amostras, polimento, superfície plana e locais de indentação) para análise de microdureza em dente e osso alveolar em modelos de doença bucal de roedores, ou seja, fluorose dentária e reabsorção óssea periodontal induzida por ligadura.

Medidas de microdureza no dente e no osso alveolar em modelos de doenças bucais de roedores

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem padronizada para avaliar quantitativamente a integridade da barreira epitelial gengival murina, aplicando topicamente dextranos marcados com fluorescência de diferentes tamanhos moleculares na superfície gengival in vivo, seguido por imagens ex vivo usando um sistema de microscopia de fóton único.

Avaliação funcional da barreira epitelial gengival de camundongos usando traçadores fluorescentes

A pesquisa experimental em animais desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da prática clínica de transplante. O modelo de transplante de fígado ortotópico suíno (OLTx) se assemelha muito às condições humanas e é frequentemente usado em pesquisas clinicamente orientadas. O protocolo a seguir contém todas as informações para um modelo OLTx suíno confiável usando um shunt porto-caval-jugular ativo.

Técnica para as aquisições de fígado de porco e Transplante ortotópico usando um Active Porto-Caval Shunt

Este artigo descreve a medição da função ventricular esquerda murina por meio da análise de pressão/volume em diferentes frequências cardíacas.

O cateterismo cardíaco em camundongos para medir o volume Pressão do relacionamento: Investigando o efeito Bowditch

Aprenda a microdissecção do órgão do esmalte de ratos para estudar ameloblastos em diferentes estágios de diferenciação celular. Esta técnica permite análises quantitativas como imunohistoquímica sem tratamentos prévios.

Microdissecação do órgão do esmalte do incisivo de ratos expostos a tóxicos ambientais

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