Name: Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a fracionar espécies de huntingtin solúveis e insolúveis em cérebro de camundongo e cultura celular. Este método permite quantificar o fluxo proteico e analisar a homeostase em modelos da doença de Huntington.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH (RO1-NS090390). Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Joan Steffanfor assistência técnica e discussão durante o desenvolvimento deste teste.

Declaração de ética animal - experimentos foram realizados em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório de institutos nacionais de saúde e um protocolo de pesquisa animal aprovado pelo (Comité de uso e cuidado institucional do Animal IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine, um AAALAC credenciada instituição. Foram envidados todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais.
1. preparação de Buffers de Lise
<ol><li>Prepare-se "Solúvel" lise (pH de Tris 10 mM 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% de glicerol) e filtro estéril através de filtro de 0,22 µm.<ol>
<li>Para um trabalho "Solúvel" do lysis, medir N-proteÃ (NEM) e dissolver completamente em 100mm phenylmethysulfonyl flúor (PMSF) dissolvido em 100% EtOH. Nota: Lysis Buffer inibidores: (i) 20 mM N-proteÃ (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1mm ortovanadato de sódio (at3vo +4); (iv) 1 leupeptin µ g/mL; (v) 1 aprotinina µ g/mL; (vi) 20mm fluoreto de sódio (NaF). Atenção: Use uma máscara quando se trabalha com NEM em todo o protocolo. Trabalhar lise deve ser feita fresco para garantir ativos inibidores.</li>
		<li>Para tampão de Lise solúvel com inibidores de protease, adicionar inibidores na seguinte ordem: fluoreto de sódio (NaF), volume com Lise fria, ortovanadato de sódio (at3vo +4), aprotinina e Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para "Insolúveis" tampão de Lise, suplemento 4% SDS adicionando 500 µ l de SDS 20% para 2 mL de tampão de lise "Solúvel". Deixe em temperatura ambiente. Nota: SDS vai precipitar-se quando mantidos a 4 ° C; manter em temperatura ambiente. Composição do lysis final: 10 mM Tris (pH 7,4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% de glicerol; 4% SDS (só insolúvel).</li>
</ol>2. solúveis/insolúveis fracionamento protocolo
Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema.
<ol><li>Dois conjuntos de tubos para cada amostra de etiqueta: "Solúvel" e "Insolúveis".</li>
	<li>Adicione X-µ l de gelado trabalho solúvel lise suplementado com inibidores de protease (ver 1.1.1) ao tecido. Nota: X = Volume varia dependendo da quantidade de tecido; Consulte a tabela 1.</li>
	<li>Para o tecido de cérebro de rato (ou seja, corpo estriado), homogenizacao lentamente 30 vezes em vidro douncer de 1 mL e pipeta em "Insolúveis" rotulado tubo (manter no gelo). Nota: Tenha cuidado para não quebrar a superfície do líquido depois de começar a douncing, como bolhas irão formar e podem produzir a homogeneização incompleta.</li>
	<li>Para as células (ou seja, HeLa, HEK293T), enxague as células uma vez com o frio, 1X PBS. Remover PBS e aplicar o volume mínimo de lise de células e levantar com raspador de célula. Nota: Para acima da linha de celular, células foram banhadas em 5 x 105 células por 6 placa bem e crescidas para perto de confluência. Um bem é comparável aos volumes utilizados para striatum do rato.</li>
	<li>Transferir homogeneizado ou lisado em celular rotulado, "Insolúveis" tubos e lyse no gelo 1h (relógio de início após o processamento final tubo). Nota: Para lisados celulares, Triture várias vezes para quebrar aglomerados de células antes de começar a incubação. Evite a formação de bolhas. Brevemente o vórtice pulso cada amostra para 1 s lise no meio.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 4 ° C a 15.000 x g por 20 min.</li>
	<li>Recupere o sobrenadante como a fração de "Solúvel".<ol>
<li>Remover com pipeta, tenha cuidado para não perturbar a camada de sedimento/nublado como este vai contaminar a fração. Na fracção solúvel em "Solúvel" pipeta rotulada de tubo. Manter-se no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave o pellet com 500 µ l de tampão de lise (x2) e centrifugar a 4 ° C a 15.000 x g por 5 min depois de cada lavagem; é okey se alguns da camada turva é pipetado fora.</li>
	<li>Após a lavagem final, remova todos os restantes tampão de lavagem, deixando apenas a pelota de tecido. Nota: A partir deste ponto, amostras insolúveis agora devem ser mantidas em temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspender pelota com X-µ l tampão de Lise suplementado com SDS de 4% (Volume pode ser ajustado dependendo do tamanho da pelota; ver tabela 1).</li>
	<li>Proceda à sonicação cada amostra por 30 s em temperatura ambiente com um sonicador de sonda (125 Watts, 20kHz, pulso, Amplitude de 40%, consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Ferva amostras (rolamento ebulição) por 30 min; Centrifugue brevemente (15 s) a 6.000 x g, de não perder qualquer amostra.</li>
	<li>Realizar o ensaio da proteína de DC (detergente compatível) (ver Tabela de materiais) ou ensaio de proteínas Lowry para medir a concentração de proteína (recomendada começou diluições de 1/5 da amostra em tampão de Lise respectivos para cultura de células e 1/10 para lysates do tecido). Nota: As concentrações de proteína terá que ser lido usando um ensaio de DC ou Lowry devido à alta concentração de detergente.</li>
	<li>Alíquotas amostras em 50 lotes µ l para evitar problemas de congelamento e descongelamento. Nota: Protocolo pode ser pausado aqui antes da posterior análise bioquímica, armazenando as duas fracções a-20 ° C.</li>
</ol>3. quantificação e ocidental do borrão
<ol><li>Execute borrões ocidentais como relatado em outros lugares1,13 µ g de 30 diluição da amostra 1:1 em carregando buffer (1.6 x tintura, 1 x redução de carga). Nota: 30 µ g de proteína por fração é suficiente, mas pode ser ajustado para resolução ideal. 3 - géis de poli-acrilamida de Tris-Acetato de 8% devem ser usados para a fração insolúvel. 4 - géis de bis-Tris 12% são recomendadas para a fração solúvel.</li>
	<li>Ferva amostras (rolamento fervura) por 5 min. centrifugador brevemente (15 s) a 6.000 x g para coletar a amostra.</li>
	<li>Analise fracções por SDS-PAGE e borrão ocidental, de acordo com o protocolo do fabricante para amostras reduzidas. Nota: A fração insolúvel resolve melhor quando transferido para uma membrana de nitrocelulose 0,45 µM. nitrocelulose de 0.45 ou 0,2 µM pode ser usado para a fração solúvel, dependendo do tamanho da proteína de interesse. Alguma otimização pode ser necessária para melhor transferência de materiais HMW.</li>
	<li>Mancha de membrana com mancha toda proteína (por exemplo, MEMcode, veja a Tabela de materiais) para visualizar a proteína eficiência de carregamento. Nota: Borrões ocidentais podem ser analisados pela intensidade média de pixel. Frações solúveis podem ser normalizadas para uma proteína de domésticas melhor adequada para o sistema experimental. Fração insolúvel como abundância relativa de proteína foi verificada por proteína reversível coloração ou normalização de histona 3 no blot separado.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Algumas precauções são necessárias para os protocolos acima garantir resultados consistentes e quantitativos. Primeiro, mHTT em ambas as fracções espontaneamente irá formar agregados ao longo do tempo, após vários ciclos de descongelamento de congelamento, particularmente quando em alta concentração. Assim, é fundamental para congelar alíquotas das preparações de proteína e descongelar somente o volume necessário antes de executar o ensaio conforme descrito no protocolo acima. Além disso, se fração insolúvel produz desse...

O rompimento das redes de controle de qualidade de proteína que certifique-se de dobramento adequado e degradação de proteínas celulares são provável central para a patologia da doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e outros "enrolamento de proteínas" distúrbios de2,3. Uma compreensão detalhada dos componentes de rede de proteostasis e suas contribuições para a patologia são, portanto, crucial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. HD é causada pelo aumento anormal de uma repetição CAG no gene HD, resultando em um estiramento expandido de polyglutamines (polyQ) na proteína de huntingtin (HTT)4. Uma característica patológica constante de patogênese de HD é o enrolamento resultante, acumulação e agregação de HTT em regiões do cérebro e em tecidos periféricos, que tem sido mostrado para interferir de várias maneiras com a função e a homeostase celular normal 5 , 6. enquanto HTT é expressado ubiquitously, médios neurônios espinhosos o striatum são seletivamente vulneráveis e mais abertamente afetada com notável atrofia cortical também associada à patogênese de HD.
A formação de agregados de HTT no cérebro de doentes de Huntington e modelos animais normalmente tem servido como um marcador de proxy para progressão da doença e ganho negativo dominante da função para o mHTT7. Embora os mecanismos precisos pelos quais proteínas enrolamento e agregação podem contribuir para toxicidade induzida pelo mHTT permanecem pouco claras, a formação destas inclusões no cérebro de doentes de Huntington e vários modelos animais é uma característica invariável e inevitável. Inclusões de aparecem ser composto em grande parte acumulada HTT fragmentos contendo o N-terminal expandido polyQ, indicando que a proteólise e processamento de longa-metragem HTT bem como alternativa de emenda8,9 pode desempenhar um importante papel na patogênese da HD. N-terminal HTT fragmentos pode constituir uma forma patológica de HTT que pode agregar rapidamente, nucleada e acelerar ou propagar a agregação processo10.
No entanto, a presença destas inclusões não necessariamente se correlaciona com toxicidade induzida por HTT ou célula morte11. HTT tem sido proposto para se submeter a um processo de agregação de um monômero solúvel através da espécie oligoméricas solúvel e fibrilas de β-folha para agregados insolúveis e inclusões12. Resolver essas várias espécies de proteína através de ensaios bioquímicos padrão tem sido um desafio no campo, devido a sua estabilidade em baixo-detergente do lysis e dificuldade em Visualizar usando padrão ensaios bioquímicos. Assim, considerações metodológicas são fundamentais para detectar o grau e o padrão do mHTT acumulada e agregado.
O protocolo apresentado aqui fornece um método para visualizar vários intermediários de HTT, especificamente a formação de uma espécie de HMW HTT insolúvel que aparece acompanhar de perto com HD patogênese e doença progressão1,13 ,14. Ser capaz de resolver e controlar múltiplas espécies de mHTT fornece pesquisadores uma ferramenta bioquímica para estudar a patogênese da doença e avaliar intervenções terapêuticas potenciais através da sua modulação e impacto na patogênese da doença.

<table><tbody><tr><td>Filtro estéril</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Tampa de rosca, filtro de vácuo estéril</td></tr><tr><td>1 mL Moedor de tecidos, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Modelo Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Comparável ao ensaio</td></tr><tr><td>Lowry Tris 1M tampão solução</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M solução</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>Fisher BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS solução</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfona</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>criar solução de estoque de 100mM em 100% EtOH, loja em 4&deg; C</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Criar solução estoque de 0,5M em água</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Criar solução estoque de 10mg / ml em água</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Criar solução estoque de 10mg / ml em água</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Criar solução estoque de 500mM em água</td></tr><tr><td>Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Use 1:1000 para western blot, 1:500 para ensaio de retardo de filtro</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Use 1:1000 para western blot solúvel</td></tr></tbody></table>

fracionamento para resolução das espécies de huntingtin solúvel e insolúvel

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

O acúmulo de misfolded proteínas é central para a patologia na doença de Huntington (HD) e muitas outras doenças neurodegenerativas. Especificamente, uma chave característica patológica de HD é o acúmulo aberrante de proteína mutante HTT (mHTT) em complexos de alto peso molecular e corpos de inclusão intracelulares é composto por fragmentos e outras proteínas. Métodos convencionais para mensurar e compreender que as contribuições de várias formas de agregados contendo mHTT incluem microscopia de fluorescência, análise ocidental do Borrão e filtro armadilha de ensaios.
No entanto, a maioria desses métodos é conformação específica e portanto não pode resolver o estado completo de fluxo de proteína mHTT devido à natureza complexa da solubilidade agregada e resolução.
Para a identificação dos agregados do mHTT e várias formas modificadas e complexos, separação e solubilização dos agregados celulares e fragmentos é obrigatória. Aqui nós descrevemos um método para isolar e Visualizar mHTT solúvel, monômeros, oligômeros, fragmentos, e um insolúvel alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT espécies. HMW mHTT faixas com a progressão da doença, corresponde-se com leituras de comportamento do rato e tem sido beneficamente modulada por determinadas intervenções terapêuticas1. Esta abordagem pode ser usada com cérebro de rato, cultura de células e tecidos periféricos, mas pode ser adaptada para outros sistemas modelo ou contextos de doença.

Resolução de lisado celular solúvel e insolúvel após fracionamento pode ser detectada usando ocidentais ensaios retardo análise e filtro (Figura 2). Como exemplo, HEK293T células foram transfectadas usando o reagente de transfeccao (por exemplo, lipofectamine 2000), com o exon HTT 1 codificação cDNA contendo glutamina 97 repete15 , seguido pela região rica poli prolina e essas células foram autorizadas a expresso por células d...

Um método é descrito por fracionamento de espécie mutante solúvel e insolúvel da cultura de cérebro e cela de rato. O método descrito é útil para a caracterização e quantificação de fluxo de proteína huntingtina e auxilia na análise de homeostase de proteína na patogênese da doença e na presença de perturbações

Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma ferramenta útil para visualização, caracterização e quantificação do fluxo da proteína huntingtina para a análise da homeostase proteica em sistemas modelo da doença de Huntington. Este método pode nos ajudar a entender questões na homeostase proteica e nos campos de doenças neurodegenerativas, como entender o impacto de certas intervenções terapêuticas na patogênese da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os investigadores isolem e resolvam espécies de proteínas insolúveis para análise quantitativa.Embora este método possa fornecer informações sobre as alterações bioquímicas durante a patogénese da doença de Huntington, também pode ser aplicado a outras doenças de dobramento incorreto de proteínas, como a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer. Para iniciar este procedimento, rotule dois conjuntos de tubos para cada amostra como solúveis e insolúveis. Prepare um tampão de lise imediatamente antes da lise da amostra no tubo solúvel, adicionando a quantidade apropriada de inibidores.Em seguida, adicione tampão de lise solúvel de trabalho a frio suplementado com inibidores de protease ao tecido. Para

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de...

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Este vídeo demonstra o protocolo para isolar fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral de camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade e digestão de proteínas não amilóides.

Isolamento de fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral

Aqui, apresentamos um protocolo de fracionamento de membrana cerebral que representa um procedimento robusto para isolar proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos.

Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de monômeros nativos, livre de marca e fibrilas do exon1 da proteína huntingtina (Httex1) com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO).

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Expressão e purificação de proteínas contendo domínio de fumarilacetoacetato hidrolase é descrita com exemplos (expressão em E. coli, FPLC). As proteínas purificadas são utilizadas para a cristalização e produção de anticorpos e empregadas para ensaios enzimáticos. Os ensaios fotométricos selecionados são apresentados para exibir a multifuncionalidade de FAHD1 como oxaloacetato descarboxilase e acylpyruvate hydrolase.

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Fornecemos protocolos escaláveis que abrangem a conceção de construções, transfecção transitória e expressão e purificação de variantes da proteína huntingtina humana de comprimento total em células HEK293.

Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória

Este protocolo descreve como extrair a proteína de domínio de hidrolase 1 (FAHD1) de rim suíno e fígado de camundongo. Os métodos listados podem ser adaptados a outras proteínas de interesse e modificados para outros tecidos.

Extração e Purificação da Proteína FAHD1 do fígado de rim suíno e rato

Este protocolo apresenta um método robusto e detalhado para obter sinaptossomos, vesículas sinápticas e outras frações sinápticas altamente puras do cérebro de camundongos. Este método permite a avaliação de processos sinápticos, incluindo a análise bioquímica da localização e função de proteínas com resolução compartimental.

Fracionamento subcelular para o isolamento de componentes sinápticos do cérebro murino

Aprenda a fracionar espécies de huntingtin solúveis e insolúveis em cérebro de camundongo e cultura celular. Este método permite quantificar o fluxo proteico e analisar a homeostase em modelos da doença de Huntington.

Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

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