Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel
27 de fevereiro de 2018
Um método é descrito por fracionamento de espécie mutante solúvel e insolúvel da cultura de cérebro e cela de rato. O método descrito é útil para a caracterização e quantificação de fluxo de proteína huntingtina e auxilia na análise de homeostase de proteína na patogênese da doença e na presença de perturbações
O objetivo geral deste procedimento é descrever uma ferramenta útil para visualização, caracterização e quantificação do fluxo da proteína huntingtina para a análise da homeostase proteica em sistemas modelo da doença de Huntington. Este método pode nos ajudar a entender questões na homeostase proteica e nos campos de doenças neurodegenerativas, como entender o impacto de certas intervenções terapêuticas na patogênese da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os investigadores isolem e resolvam espécies de proteínas insolúveis para análise quantitativa.
Embora este método possa fornecer informações sobre as alterações bioquímicas durante a patogénese da doença de Huntington, também pode ser aplicado a outras doenças de dobramento incorreto de proteínas, como a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer. Para iniciar este procedimento, rotule dois conjuntos de tubos para cada amostra como solúveis e insolúveis. Prepare um tampão de lise imediatamente antes da lise da amostra no tubo solúvel, adicionando a quantidade apropriada de inibidores.
Em seguida, adicione tampão de lise solúvel de trabalho a frio suplementado com inibidores de protease ao tecido. Para o tecido cerebral do camundongo, dounce lentamente 30 vezes em um douncer de vidro de um mililitro. Tenha cuidado para não quebrar a superfície do líquido, pois bolhas se formarão e podem produzir homogeneização incompleta.
Em seguida, pipete-o para o tubo insolúvel rotulado com gelo. Para linhagens celulares, as células foram plaqueadas em cinco vezes 10 elevado à quinta célula em cada placa de seis poços e cultivadas até quase a confluência. Depois, enxágue as células uma vez com PBS 1X frio e remova-o.
Em seguida, aplique um volume mínimo de tampão de lise nas células e levante-as com um raspador de células. Em seguida, transfira o homogeneizado ou lisado celular para o tubo insolúvel rotulado e lise no gelo por uma hora. Para lisados celulares, triturar várias vezes para quebrar os aglomerados de células antes de iniciar a incubação e evitar a formação de bolhas.
Pulsar brevemente o vórtice de cada amostra por um segundo na metade da lisagem. Em seguida, centrifugue as amostras a quatro graus Celsius a 15 000 x g durante 20 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante.
Tenha cuidado para não perturbar o pellet ou a camada turva, pois isso contaminará a fração. Pipetar o sobrenadante como fracção solúvel para o tubo rotulado com solúvel e mantê-lo no gelo. Manter o controle dos tampões de lise solúveis e insolúveis é fundamental.
Trocar os tampões ou colocar o tampão insolúvel ou amostras no gelo será prejudicial ao resultado do protocolo. Lave o pellet com 500 microlitros de tampão de lise e centrifugue a quatro graus Celsius a 15.000 x g por cinco minutos. Repita a lavagem mais uma vez.
Em seguida, remova todo o tampão de lavagem restante, deixando apenas o pellet de tecido. Em seguida, ressuspenda o pellet com tampão de lise suplementado com 4% de SDS. Sonicar cada amostra por 30 segundos em temperatura ambiente com um sonicador de sonda.
Sonicar pequenos volumes por um longo período de tempo é tecnicamente desafiador. Tenha cuidado para não perder nenhuma amostra emulsionando ou pulverizando ao concluir esta etapa. Depois, ferva as amostras por 30 minutos.
Em seguida, centrifugá-los brevemente a 6 000 x g. Posteriormente, realize o ensaio de proteína compatível com detergente ou o ensaio de proteína Lowry para medir a concentração de proteína. Em seguida, alíquota as amostras em lotes de 50 microlitros para evitar problemas de congelamento/descongelamento.
Nesta etapa, execute western blots diluindo 30 microgramas de amostra na proporção de um para um no tampão de carregamento. Cozer as amostras durante cinco minutos e centrifugá-las brevemente a 6 000 x g. Em seguida, analise as frações por página SDS e western blot.
Manchar a membrana com corante de proteína inteira para visualizar a eficiência do carregamento de proteínas. Aqui estão as frações solúveis e insolúveis de lisados de células HEK 293T resolvidas em géis de página de 4-12% Bis-Tris e 3-8% Tris-Acetato, respectivamente. A fração solúvel normalizada para o controle de carga de GAPDH mostra flutuação do monômero solúvel do exon 1 da huntingtina mutante com base na exposição ao inibidor de protease MG132.
A fração insolúvel mostra que as espécies acumuladas de huntingtina mutante de alto peso molecular também são moduladas pelo tratamento com MG132. E aqui estão as amostras de frações solúveis e insolúveis de lisados de células HeLA usando western blot e análise de retardo de filtro. Os dados mostram que a presença de uma isoforma SUMO superexpressa aumenta tanto a huntingtina mutante de alto peso molecular quanto a huntingtina mutante insolúvel fibrilar na fração insolúvel.
Esta figura mostra a regulação da acumulação de huntingtina mutante de alto peso molecular após a modulação de uma potencial terapêutica no fracionamento insolúvel de células HeLa sobre a expressão do exão 1 da huntingtina 97Q. O alvo terapêutico PIAS1 foi silenciado com um siRNA em direção a PIAS1 ou superexpresso. Frações insolúveis de estrias de camundongos tratadas com microRNA contra PIAS1 e resolvidas em géis de página de 3-8% de Tris-Acetato mostram modulação da huntingtina insolúvel de alto peso molecular.
Não se esqueça de que trabalhar com NEM pode ser extremamente perigoso e tomar precauções como usar máscara facial deve sempre ser tomado durante a execução deste protocolo. Uma vez dominada, esta técnica do lisado ao final do fracionamento pode ser feita em cerca de três a quatro horas, dependendo do número de amostras. Deve ser prevista uma hora adicional para a quantificação e alíquota das proteínas.
Após este procedimento, outros métodos, como eletroforese em gel de agarose ou retardo de filtro, podem ser realizados para detectar oligômeros solúveis ou fibrilas insolúveis, respectivamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e resolver proteínas insolúveis mal dobradas para análise quantitativa.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para fracionar espécies mutantes de huntingtina insolúveis e solúveis a partir do cérebro de camundongo e culturas celulares. A técnica auxilia na caracterização e quantificação do fluxo da proteína huntingtina, contribuindo para a análise da homeostase proteica na doença de Huntington e outras doenças neurodegenerativas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Doenças Neurodegenerativas
Contexto
- A proteína huntingtina está implicada na doença de Huntington.
- Compreender a homeostase proteica é crucial para a patogênese da doença.
- O mau dobramento proteico é uma característica comum em várias doenças neurodegenerativas.
- Este método também pode ser aplicado para estudar as doenças de Parkinson e Alzheimer.
Objetivo do Estudo
- Fornecer uma ferramenta para visualização e quantificação do fluxo da proteína huntingtina.
- Analisar a homeostase proteica em sistemas modelo da doença de Huntington.
- Avaliar o impacto de intervenções terapêuticas sobre a progressão da doença.
Métodos Utilizados
- Isolamento de espécies proteicas solúveis e insolúveis.
- Preparação do tampão de lise com inibidores apropriados.
- Análise quantitativa do fluxo proteico.
- Aplicação do método a diversos modelos de doenças neurodegenerativas.
Resultados Principais
- O método permite o isolamento eficaz de espécies da proteína huntingtina.
- A análise quantitativa revela informações sobre a homeostase proteica.
- Os achados contribuem para o entendimento dos mecanismos da doença.
- A técnica mostra potencial para aplicações mais amplas nas doenças por desdobramento incorreto de proteínas.
Conclusões
- Este método é uma ferramenta valiosa para o estudo da doença de Huntington.
- Ele aprimora a compreensão da dinâmica das proteínas na neurodegeneração.
- Aplicações futuras podem se estender a outras doenças relacionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite que equipes de P&D biofarmacêutica resolvam quantitativamente espécies solúveis e insolúveis da huntingtina mutante, fornecendo insights mecanicistas sobre a homeostase proteica em modelos da doença de Huntington. Ao isolar agregados de alto peso molecular relevantes para a doença, que se correlacionam com leituras fenotípicas e modulação terapêutica, a abordagem apoia a validação de alvos e a redução de riscos em estratégias de modulação de HTT. Oferece um fluxo de trabalho transponível aplicável em culturas celulares, tecidos e outros contextos de doenças neurodegenerativas, aumentando a confiança preditiva nos estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar o fluxo de espécies mutantes da HTT para esclarecer mecanismos patogênicos e validar a HTT como alvo terapêutico.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas dos compartimentos solúvel e insolúvel da HTT para avaliar o engajamento do alvo e a modulação da via.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar alterações bioquímicas nas espécies da HTT à progressão da doença e à resposta terapêutica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera frações solúveis e insolúveis padronizadas adequadas para ensaios downstream como western blot, retenção em filtro ou detecção de oligômeros.
- Saída Quantitativa: Permite a medição precisa da concentração de espécies de HTT por meio de ensaios proteicos compatíveis com detergentes, apoiando análises de dose-resposta e de curso temporal.
- Reprodutibilidade: Etapas definidas de lise, centrifugação e lavagem garantem uma fracionamento consistente entre diferentes tipos de amostras, facilitando a transferência do ensaio e o uso em diferentes funções.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Isola espécies de HTT de alto peso molecular que acompanham o comportamento do camundongo e são moduladas por intervenções terapêuticas, permitindo a ligação entre fenótipo e mecanismo.
- Continuidade Translacional: Apoia a progressão de modelos in vitro para validação baseada em tecidos, alinhando descobertas de pesquisa com avaliações de eficácia pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se as intervenções afetam monômeros solúveis, oligômeros ou agregados insolúveis, reduzindo a ambiguidade no mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial de descoberta, permitindo a verificação de hipóteses sobre estratégias de alvo da HTT antes da identificação de compostos líderes e da validação pré-clínica, por meio de leituras quantitativas baseadas em fracionamento da homeostase proteica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação mecanicista dos processos de clivagem, agregação e eliminação da HTT em modelos de doença.
- Triagem: Prepara frações bioquimicamente definidas para triagem confiável de compostos contra espécies solúveis ou insolúveis da HTT.
- Análises: Fornece dados quantitativos de concentração proteica e de western blot para comparar níveis de espécies da HTT entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a fracionamento da HTT em células e tecidos com desfechos comportamentais e patológicos em modelos pré-clínicos.
- Reutilização em Plataforma: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de desdobramento proteico anômalo em modelos da doença de Huntington, Parkinson e Alzheimer.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao esclarecer as contribuições específicas das espécies de HTT para a patogênese e resposta terapêutica.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de lise, fracionamento e quantificação proteica.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao associar a modulação do alvo a alterações mensuráveis nos agregados de HTT relevantes para a doença.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos que reduzem a expressão de HTT ou modulam a agregação, com base na redução de espécies insolúveis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em bioquímica de proteínas, técnicas de fracionamento e análise por western blot.
- Depende do acesso a centrífuga, sonicador e reagentes compatíveis, incluindo SDS e inibidores de proteases.
- Necessita de protocolos padronizados entre equipes para evitar contaminação cruzada de tampões e garantir a pureza das frações.
- Deve levar em conta a variabilidade na eficiência da homogeneização tecidual e na eficiência da sonicação ao ampliar os modelos.
- Limitado pela necessidade de manipulação cuidadosa para evitar perda de amostra durante etapas de sonicação e ressuspensão, especialmente com volumes pequenos.
