Filamentos intermediários e microtúbulos com microscopia 2-dimensional direta estocástico reconstrução óptico de imagem
6 de março de 2018
O objetivo geral desta metodologia é dar as condições experimentais ideais de preparação da amostra para aquisição de imagem e reconstrução para realizar imagens de dSTORM 2D cor dupla de microtúbulos e filamentos intermediários em células fixas
O objetivo geral desta metodologia é criar as condições experimentais ideais, desde a preparação da amostra até a aquisição e reconstrução da imagem, a fim de realizar imagens D-STORM 2D de duas cores de microtúbulos e filamentos intermediários em células fixas. Este método pode ajudar a caracterizar as interações físicas entre redes densas e complexas do citoesqueleto, como filamentos intermediários e microtúbulos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a observação de estruturas celulares, que não são resolvidas com a microscopia de fluorescência convencional.
A demonstração visual desse método é crítica, pois o controle da preparação da amostra e a aquisição de dados de vinculação de robe são cruciais para limitar a geração de artefatos. Depois de cultivar as células U373 de acordo com o protocolo de texto, fixe as células usando primeiro PBS para lavá-las uma vez. Em seguida, remova o PBS e adicione um mililitro por poço de solução de fixação de extração pré-aquecida.
Incube as células em temperatura ambiente por 60 segundos. Em seguida, remova a solução e adicione um mililitro por poço de PFA a 4% recém-preparado e pré-aquecido diluído em tampão citoesqueleto. Coloque a placa de 12 poços de volta na incubadora a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, remova o PFA e adicione três mililitros de PBS por poço. Use PBS para lavar as células duas vezes. Em seguida, remova o PBS e adicione borohidreto de sódio de 10 milimolares recém-preparado diluído em PBS para extinguir a autofluorescência do glutaraldeído.
Incube as células à temperatura ambiente por sete minutos e transfira o borohidreto de sódio reciclado para uma caixa específica. Use PBS para lavar os poços três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, remova o PSB e adicione 5% BSA em PBS como uma solução de bloqueio.
Após a imunocoloração das amostras e a preparação das soluções em tampões de acordo com o protocolo de texto, monte a lamínula contendo as células marcadas em um suporte magnético de amostra. E adicione o tampão de imagem para preencher completamente a câmara. Aplique a tampa e certifique-se de que não haja bolhas de ar entre o tampão de imagem e a tampa.
Usando etanol absoluto, limpe o fundo da amostra e verifique se não há vazamentos. Em seguida, se necessário, use graxa para selar adequadamente o suporte de amostra. Para realizar a geração de imagens, ligue o microscópio e o software de aquisição.
Configure os parâmetros de aquisição de acordo com o protocolo de texto, usando a objetiva NA 1.46 de 100 vezes, a lente Optivar de 1.6 vezes e o modo TIRF UHP. Crie uma faixa 647 para criar imagens dos filamentos de vimentina rotulados com Alexa Fluor 647. Selecione as linhas de laser de 405 e 642 nanômetros e o filtro de emissão LP 655.
Em seguida, crie uma faixa 555 para obter imagens dos microtúbulos marcados com Alexa Fluor 555. Selecione as linhas de laser de 561, 488 e 405 nanômetros para obter imagens dos fluoróforos e do filtro de emissão BP 570 a 650. Em seguida, adicione óleo à objetiva e coloque a amostra na lente.
Em seguida, selecione a guia localizar e abra o obturador da lâmpada de fluorescência. Encontre o foco e use a ocular para procurar as células para a imagem. Em seguida, use o joystick para posicionar as células no centro do campo.
Clique na guia de aquisição para retornar ao modo de aquisição. Em seguida, selecione a faixa 647 e defina a potência do laser 642 para 0.2% e a potência do laser 405 para seu valor mínimo. Defina o tempo de exposição para 50 milissegundos e o ganho para 50.
Em seguida, escolha o modo de aquisição contínua para observar a célula na tela. Certifique-se de que haja pelo menos uma conta fluorescente no campo de view. Use um modo de dimensionamento automático para a exibição e ajuste o foco.
Em seguida, tire uma imagem de epifluorescência de campo amplo da rede de vimentina clicando em snap e salve a imagem. Para verificar a iluminação TIRF, clique em TIRF, pressione contínuo, ajuste os parâmetros de aquisição para obter um campo de iluminação homogêneo. Em seguida, pressione snap e salve a imagem.
Verifique a faixa 555. Desmarque a faixa 647 e selecione a faixa 555. Pegue uma imagem de epifluorescência da rede de microtúbulos e salve-a.
Em seguida, pegue uma imagem TIRF e salve-a. Agora, verifique a faixa 647. Desmarque a faixa 555 e selecione a faixa 647.
Defina o ganho como zero e o tempo de exposição como 10 milissegundos. Em seguida, pressione contínuo. Defina a potência do laser de 642 nanômetros para 100% para bombear a maioria dos corantes Alexa 647 para o estado escuro.
Assim que os fluoróforos começarem a piscar, aumente a exposição para 15 milissegundos e o ganho para 300. Use o modo indicador de alcance para verificar se os sinais de molécula única não saturam a câmera conforme indicado pela cor vermelha. Nesse caso, diminua o ganho até que a saturação desapareça.
As contas permanecerão saturadas no início da aquisição. Pressione parar para interromper a observação da célula. Expanda a ferramenta de processamento on-line e clique em processamento on-line PALM para visualizar a imagem STORM durante a aquisição.
Use nove para o tamanho máximo da máscara e seis para o pico de intensidade do ruído. Agora, pressione iniciar aquisição. Durante a aquisição, concentre-se novamente na célula, se necessário.
Ajuste o tempo de exposição e, eventualmente, ligue a linha de laser de 405 nanômetros começando no 0,001%para manter uma densidade média de fluoróforos com uma distância mínima de um micrômetro entre moléculas individuais. Certifique-se de que o pico de precisão de localização no histograma abaixo da imagem reconstruída esteja centralizado em torno ou abaixo de 10 nanômetros. Pressione parar para encerrar o filme quando mais de um milhão de localizações tiverem sido alcançadas.
Salve os dados brutos da aquisição do STORM com o formato CZI. Em seguida, na ferramenta de canais, marque a faixa 555, desmarque a faixa 647 e selecione a faixa 555. Em seguida, pressione o botão contínuo.
Defina o tempo de exposição para 30 milissegundos e o ganho para zero. Em seguida, defina os lasers 488 e 561 para 100%para bombear os corantes Alexa 555 para o estado escuro. Use o modo de iluminação HILO.
Quando os fluoróforos estiverem esgotados, pressione parar. Defina o ganho para 250 e diminua o laser 488 para 50%Use o indicador de alcance para verificar se moléculas individuais não saturam a câmera. Se for esse o caso, diminua o ganho.
Agora, pressione iniciar aquisição. Durante a aquisição, aumente o ganho gradualmente até atingir o limite de saturação. Aumente passo a passo a potência do laser de 405 nanômetros para ativar as moléculas e atingir uma densidade média no campo de visão.
Diminua a potência do laser de 488 nanômetros para 30%quando o laser 405 for cerca de 15%Em seguida, diminua gradualmente o 488 enquanto aumenta a potência do laser 405 para manter o piscar das moléculas o mais rápido possível e com uma densidade média. A linha de laser 488 acoplada ao laser de excitação 561 na intensidade máxima aumenta as taxas de ligar e desligar dos fluoróforos, enquanto a linha de laser 405 apenas aumenta a taxa de ativação. Pare a aquisição quando 500.000 localizações ou mais forem alcançadas ou quando não houver mais moléculas piscando.
Em seguida, salve os dados brutos da aquisição STORM com o formato CZI. Para realizar a reconstrução da imagem usando a ferramenta PAL-Drift, escolha o tipo de correção baseada em modelo com segmentos automáticos com um tamanho máximo de oito. Pressione aplicar várias vezes seguidas até que o desvio seja corrigido.
Essa correção baseada em modelo aplica um algoritmo baseado na análise de correlação cruzada, que corrige o desvio. Usando as ferramentas de filtro PAL, melhore a aparência da imagem STORM selecionando apenas as moléculas que foram melhor localizadas. Por exemplo, limite a precisão de localização a 30 nanômetros e o PSF a 120 a 180 nanômetros.
Com a ferramenta PAL-Render, use uma resolução de pixels de cinco ou 10 nanômetros e parâmetros de acordo com o protocolo de texto. Selecione renderizar intervalo dinâmico automático HR com um valor de 95% e renderizar intervalo dinâmico automático SWF com um valor de 90%. Em seguida, selecione renderizar melhor qualidade.
No menu PALM da guia de processamento, selecione PALM convert. Pressione selecionar e aplicar. Por fim, salve a imagem criada com o formato LSM e não CZI.
Esta figura mostra um exemplo típico de uma imagem D-STORM de filamentos de vimentina imunomarcados com Alexa 647. O aumento na resolução pode ser claramente observado em comparação com a imagem adquirida com um microscópio padrão de campo amplo. Os perfis de intensidade de fluorescência apresentados neste gráfico mostram que a imagem microscópica de super resolução permite a resolução de feixes de vimentina.
A resolução D-STORM é suficiente para contar o número de filamentos presentes nos feixes. Aqui é mostrado um exemplo típico da imagem D-STORM de duas cores de redes de vimentina e microtúbulos imunomarcadas com Alexa 647 e Alexa 555, respectivamente. Boas imagens de vimentina devem ter pelo menos 5.000 localizações por micrômetro quadrado e 2.500 por micrômetro quadrado para microtúbulos.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante adaptar os métodos de fixação e parametrização à proteína que seria visualizada. Por exemplo, a fixação apenas com glutaraldeído dá resultados ruins para filamentos intermediários, mas é melhor para a fixação de microtúbulos.
É importante lembrar de usar amostras e soluções recém-preparadas, especialmente MEA, cujo pH deve ser cuidadosamente ajustado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia celular explorarem a morfologia das estruturas celulares nanoscópicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a preparação de amostras, aquisição de imagens e reconstrução de imagens D-STORM 2D de duas cores de filamentos intermediários e microtúbulos.
Não se esqueça de que trabalhar com algumas soluções, especialmente PFA, NABH4 pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas, trabalhar sob o capuz químico e usar caixas específicas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.
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Visão Geral
Esta metodologia tem como objetivo estabelecer condições experimentais ideais para a imagem dSTORM bidimensional com dupla coloração de microtúbulos e filamentos intermediários em células fixadas. Ela aprimora a caracterização das redes citoesqueléticas, que muitas vezes não são resolvidas pela microscopia de fluorescência convencional.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- A imagem D-STORM fornece visualização de alta resolução das estruturas celulares.
- Microtúbulos e filamentos intermediários são componentes críticos do citoesqueleto.
- A microscopia de fluorescência convencional pode não resolver interações complexas nessas redes.
- A preparação da amostra e a aquisição de dados são cruciais para minimizar artefatos.
Objetivo do Estudo
- Otimizar as condições para a imagem de microtúbulos e filamentos intermediários.
- Aprimorar o entendimento das interações do citoesqueleto.
- Fornecer uma demonstração visual da metodologia.
Métodos Utilizados
- Preparação de células U373 de acordo com um protocolo especificado.
- Lavagem das células com PBS antes da fixação.
- Uso de uma solução de fixação por extração pré-aquecida para a fixação celular.
- Aquisição de imagens dSTORM para analisar estruturas do citoesqueleto.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de microtúbulos e filamentos intermediários.
- Resolução aprimorada de estruturas celulares em comparação com métodos convencionais.
- Controle demonstrado sobre o preparo da amostra e a aquisição de dados.
- Caracterização de interações dentro de redes citoesqueléticas.
Conclusões
- A metodologia fornece uma abordagem robusta para o estudo da dinâmica do citoesqueleto.
- Ela destaca a importância de uma preparação cuidadosa das amostras.
- Aplicações futuras podem incluir a exploração de outras estruturas celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A resolução de redes densas do citoesqueleto, como filamentos intermediários e microtúbulos, é fundamental para compreender as funções celulares coordenadas em modelos de doenças. A imagem dual-color dSTORM fornece resolução em escala nanométrica para visualizar associações físicas entre essas redes, permitindo a eliminação mecanicista de riscos em alvos envolvidos na regulação do citoesqueleto. Essa capacidade apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios ao revelar dependências estruturais que influenciam a motilidade celular, a polaridade e o tráfego intracelular—fenótipos-chave na pesquisa de doenças neurodegenerativas e no câncer.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização de associações diretas entre filamentos intermediários e microtúbulos com resolução inferior a 10 nm.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas sobre o agrupamento de filamentos e a densidade da rede, apoiando a validação funcional de alvos.
- Valor Preditivo: Esclarece as ligações mecanicistas entre componentes do citoesqueleto, reduzindo a ambiguidade na interpretação de vias durante a seleção de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados padronizados de imagem de alta resolução adequados para avaliação de ensaios em telas de moduladores do citoesqueleto.
- Valor Operacional: Estabelece protocolos reprodutíveis para aquisição e reconstrução dSTORM em duas cores, permitindo consistência entre diferentes laboratórios.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes linhagens celulares e alvos proteicos quando as condições de fixação e marcação forem adaptadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a organização citoesquelética em escala nanométrica a fenótipos celulares relevantes para modelos de doenças, como ativação de células gliais ou integridade neuronal.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece como os filamentos intermediários de vimentina moldam e estabilizam a organização dos microtúbulos, fornecendo subsídios para modelos preditivos de defeitos no tráfego vesicular.
- Relevância para Modelos Pré-clínicos: Utiliza células gliais U373 — um sistema relevante para o estudo da neuroinflamação e da progressão de glioma.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese sobre o alvo até a identificação de compostos promissores, no qual a integridade do citoesqueleto atua como um indicador fenotípico dos efeitos do composto sobre a estrutura e a função celular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao determinar se compostos interrompem ou estabilizam a coorganização dos filamentos intermediários com microtúbulos.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de saídas quantificáveis, como densidade de localização (>5.000/µm² para vimentina, >2.500/µm² para microtúbulos) e resolução de feixes.
- Análises: Fornece medidas precisas do espaçamento dos filamentos e da colocalização, permitindo que as equipes comparem fenótipos estruturais entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a imagem em escala nanométrica a processos dependentes de microtúbulos, como o tráfego vesicular, relevantes para o desenvolvimento de neuroterapêuticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de imagem de super-resolução para o estudo de qualquer par de proteínas no citoesqueleto, quando marcadas com fluoróforos compatíveis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao resolver interações do citoesqueleto em escala nanométrica, invisíveis à microscopia convencional.
- Valor Operacional: Oferece padronização por meio de parâmetros fixos de aquisição (por exemplo, laser de 642 nm a 0,2% para ativação, 100% para esgotamento) e limiares de reconstrução (precisão de localização <10 nm).
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao permitir a detecção precoce de disregulação do citoesqueleto em modelos pré-clínicos.
- Impacto no Portfólio: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer evidências estruturais do engajamento do alvo em vias do citoesqueleto.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia de super-resolução, imunomarcação e alinhamento óptico TIRF/HILO.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo objetiva de 100x NA 1,46, lente Optivar e linhas a laser em 405, 488, 561 e 642 nm.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de fixação (por exemplo, concentração de PFA, bloqueio com borohidreto de sódio) para minimizar a autofluorescência e preservar a integridade do epítopo.
- Requer adaptação da densidade de marcação e da potência do laser ao direcionar diferentes proteínas, conforme demonstrado por configurações distintas para Alexa 647 versus Alexa 555.
- Limitado pela necessidade de soluções recém-preparadas e controles ambientais rigorosos para evitar desvios e garantir o comportamento de piscamento de molécula única.
