Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

O objetivo geral deste procedimento é isolar células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicos no trato reprodutivo feminino humano para avaliar suas características fenotípicas e funcionais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre células dendríticas residentes no tecido no trato genital feminino, como a compartimentalização anatômica de subconjuntos específicos e suas características funcionais. A principal vantagem desta técnica é que nosso protocolo de digestão tecidual não cliva marcadores de superfície, o que permite o isolamento imediato de células dendríticas sem incubação noturna ou ativação celular.

Embora esse método tenha sido otimizado para isolar células dendríticas do trato reprodutivo feminino humano, ele também pode ser adaptado para isolar outras células imunológicas ou células dendríticas de outros tecidos. Demonstrando o procedimento estarão Fiona Barr e Jared Fortier, técnicos em nosso laboratório. Comece este procedimento enxaguando o tecido com HBSS modificado.

Coloque o tecido em uma placa de Petri quadrada de 100 por 15 milímetros e adicione aproximadamente três mililitros de um coquetel de enzimas de digestão para evitar que o tecido seque. Ao usar uma pinça para estabilizar o tecido, pique-o com um bisturi para aumentar a área de superfície do tecido exposto ao coquetel de enzimas de digestão. Corte o tecido em pedaços pequenos.

Adicione coquetel de enzimas de digestão suficiente para cobrir todos os pedaços de tecido e coloque a tampa na placa de Petri. Incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em um rotador a aproximadamente 80 rpm por 45 minutos. Certifique-se de que a velocidade do rotador misture completamente o coquetel de enzimas de digestão sem derramar ou produzir bolhas.

Após 45 minutos, visualize o preparo do tecido com um microscópio de luz invertida com as objetivas 4X e 10X. Uma digestão enzimática bem-sucedida deve liberar folhas e glândulas epiteliais, como mostrado nesta imagem representativa. Realize a separação de células individuais em um ambiente estéril.

Primeiro, coloque uma malha esticada de 250 micrômetros com suporte em uma placa de Petri quadrada de 150 por 15 milímetros e certifique-se de que a malha esteja cerca de 0,5 centímetros acima da superfície da placa de Petri. Em seguida, molhe a tela com dois mililitros de HBSS modificado e transfira o tecido digerido para a tela. Usando a superfície plana de um êmbolo de seringa de 10 mililitros, triture suavemente, mas com firmeza, o tecido picado digerido através da malha.

Uma vez que os fragmentos de tecido tenham sido completamente dispersos, eleve a tela e o suporte dois a três centímetros acima da placa de Petri e enxágue com três mililitros de HBSS modificado para recuperar células adicionais. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros. Coloque uma malha de 20 micrômetros com suporte cerca de dois a três centímetros acima de uma nova placa de Petri e molhe com dois mililitros de HBSS modificado.

Passe a suspensão celular pela malha e enxágue com seis mililitros de HBSS modificado. Recolher a suspensão de células mistas e centrifugar a 500 vezes g durante 10 minutos. Aspire o líquido e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de HBSS modificado.

Coloque a suspensão de células mistas sobre três mililitros de solução de polissacarose para centrifugação com gradiente de densidade. Centrifugue à temperatura ambiente a 500 vezes g durante 30 minutos sem travão. Colete a faixa branca do topo da solução de polissacarose e lave com PBS.

Uma vez coletada a suspensão enriquecida de células mistas, conte as células usando um hemocitômetro em um microscópio óptico com a objetiva 10X. Gire todas as células da suspensão celular por 10 minutos. Aspire completamente e descarte o sobrenadante.

Em seguida, adicione grânulos de remoção de células mortas e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, coloque um filtro de 30 micrômetros no topo da coluna para reter quaisquer detritos de tecido ou agregados celulares restantes. Enxágue o filtro e a coluna com tampão de remoção de células mortas.

Em seguida, aplique a suspensão celular e permita que as células marcadas com esferas fluam através da coluna magnética. Enxágue a coluna com três mililitros de tampão de remoção de células mortas quatro vezes. Colete o fluxo que contém as células vivas.

Após a remoção das células mortas, gire as células para baixo. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em tampão de seleção magnética, 80 microlitros de tampão por um vezes 10 elevado às sete células. Para seleção positiva de populações de células dendríticas, adicione esferas magnéticas CD1a ou CD14 e incube a quatro graus Celsius por 15 minutos.

Lave as células com o tampão de seleção magnética, gire para baixo, remova o tampão completamente e ressuspenda as células em um mínimo de 500 microlitros de tampão de seleção magnética. Prenda a coluna ao ímã e adicione um filtro de 30 micrômetros no topo da coluna para reter quaisquer detritos de tecido ou agregados celulares restantes. Enxágue o filtro e a coluna com tampão de seleção magnética.

Aplique a suspensão da célula à coluna. Enxágüe três vezes com três mililitros de tampão de seleção magnética. Transfira a coluna para um tubo de 15 mililitros.

Adicione cinco mililitros de tampão de seleção magnética e aplique o êmbolo para liberar as células selecionadas da coluna. Para aumentar a pureza, repita as etapas de purificação com as células recuperadas usando uma nova coluna. Posteriormente, avaliar a pureza celular por citometria de fluxo e microscopia, conforme descrito no protocolo de texto.

Antes de iniciar este ensaio, as células T virgens são isoladas de células mononucleares do sangue periférico usando um kit disponível comercialmente. Lave as células T ingênuas duas vezes com PBS. Ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS.

O restante do protocolo é realizado no escuro. Enquanto vórtice suavemente as células no gabinete de biossegurança, adicione 500 microlitros de uma solução 2X de corante de proliferação celular às células. Incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Pare a marcação celular adicionando às células cinco mililitros de meio de cultura celular com soro AB humano a 10%. Incubar no gelo durante cinco minutos, protegido da luz. Centrifugue as células a cerca de 500 vezes g durante sete minutos.

Aspire o meio e ressuspenda as células em cinco mililitros de meio de cultura celular com soro AB humano a 10%. Antes da última centrifugação, pegue uma alíquota de células para contar. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em meio de cultura celular com soro AB humano a 10% na concentração celular desejada.

Para iniciar a co-cultura de células T ingênuas alogênicas de células dendríticas, coloque as células dendríticas isoladas e as células T virgens em uma placa de fundo redondo de 96 poços em uma proporção de um para 15 de células dendríticas para células T. Centrifugue a placa a cerca de 500 vezes g por três minutos para garantir que as células estejam localizadas no centro do poço. Incubar a 37 graus Celsius por seis dias.

Monitore as células por microscopia. Após seis dias, avaliar a proliferação celular por citometria de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto. Este gráfico mostra o intervalo do número total de células viáveis recuperadas após o processamento do tecido e a remoção de células mortas em cada compartimento do trato reprodutivo feminino, endométrio, endocérvix e ectocérvix.

O número de células dendríticas viáveis recuperadas por grama de tecido após o isolamento do grânulo magnético é mostrado a seguir. A morfologia dendrítica das células isoladas foi determinada por microscopia após a coloração de Giemsa. A expressão de marcadores fenotípicos antes e depois do isolamento do grânulo foi determinada por citometria de fluxo.

Após o isolamento do grânulo CD1a positivo e CD14 positivo, a pureza variou entre 85 e 92% Um ensaio de estimulação alogênica foi realizado para avaliar a funcionalidade das células dendríticas. A formação de aglomerados de células T durante a proliferação foi confirmada pela coloração do corante de proliferação. A proliferação foi então quantificada por citometria de fluxo.

Aqui é mostrada a estratégia de gating para identificar diferentes células dendríticas na suspensão de células mistas. Cada população fechada em gráficos multicoloridos é mostrada no próximo painel. Seguindo a estratégia de gating, subconjuntos específicos de células dendríticas são identificados.

Espera-se um baixo número de células, pois as células dendríticas teciduais são populações raras. Uma vez dominado, o isolamento de células dendríticas dos tecidos pode ser feito em quatro a cinco horas, se for realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como digerir e processar enzimaticamente os tecidos para gerar uma única suspensão de células mistas e realizar a seleção de células dendríticas por esferas magnéticas para caracterização posterior.