Name: Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprenda a isolar células dendríticas do trato reprodutivo feminino humano para análise fenotípica e funcional. Este método preserva marcadores de superfície e pode ser adaptado para outras células imunes.

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Bolsas de estudo suportado pelo NIH, AI102838 e AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para obter assistência técnica. Análise de fluxo cytometric foi realizado em DartLab, o recurso compartilhado no Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).

Estudos envolvendo seres humanos foram conduzidos de acordo com os princípios expressados na declaração de Helsinque. Estudos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional Dartmouth College e o Comitê para a proteção de assuntos humanos (CPHS). Termo de consentimento informado foi obtido antes da cirurgia seronegativo mulheres passando por histerectomia no Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Líbano, NH). Patologistas treinados selecionadas amostras de tecido da EM, CX e ECX, livre de lesões patológicas e distante dos locais de patologia. Obtiveram-se amostras de sangue de doadores saudáveis voluntários recrutados no Dartmouth Hitchcock Medical Center. Doadores de sangue eram anônimos. Recentemente isolado ECX, CX e EM tecidos de centro cirúrgico foram transferidos para patologia para isolamento e classificação prévia transferir para o nosso laboratório em tubos de polipropileno separados, estéril.
1. enzimática digestão dos tecidos
Nota: Use material esterilizado e trabalhar em uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Prepare um modificado do Hank equilibrado sal solução (HBSS) usando 1 x HBSS com vermelho de fenol, 100 U/mL penicilina-estreptomicina, 0,35 g/L NaHCO3e 20 mM HEPES.</li>
	<li>Prepare o coquetel enzimático (modificado desoxirribonuclease de 0,01% [wt/vol] HBSS, 450 U/mL colagenase IV, I e D-glicose de 2 mg/mL). Passe a solução através de um filtro de 0,22 µm estéril. Idealmente, preparar a enzima digestão no dia do uso, mas ele pode ser congelado a-20 ° C para armazenamento. Evite repetidos congelamentos e descongelamentos ciclos.</li>
	<li>Lave o tecido com modificados HBSS e coloque em um prato de Petri 100 x 15mm2 . Ajustar o tamanho da placa de Petri com base na quantidade de tecido disponível e a quantidade da enzima coquetel utilizada (ver passo 1.4.2 abaixo). Nota: Os tecidos variam em tamanho, dependendo do exemplo cirúrgico obtido a partir da patologia, variando de 1-10 g.</li>
	<li>Processamento físico com bisturi descartável e fórceps:<ol>
<li>Adicione cerca de 3 mL de enzima digestão cocktail ao tecido para impedir a secagem durante o corte.</li>
		<li>Use fórceps para estabilizar o tecido e picar com um bisturi para aumentar a área da superfície do tecido exposto para a coquetel de enzimas de digestão. Corte o tecido em pequenos pedaços (< 2 mm de um lado). Adicione o cocktail de enzima digestão suficientes para cobrir todos os pedaços de tecido (5 mL/g de tecido). Coloque a tampa na caixa de Petri.</li>
		<li>Incube a 37 ° C com 5% CO2 em rotacao em aproximadamente 80 rpm de 45 min. Certifique-se de que a velocidade do rotor mistura cuidadosamente o coquetel de enzimas de digestão sem derramar ou produzindo bolhas.</li>
		<li>Visualize a preparação do tecido com um microscópio invertido com o 4 X e 10 X de objectivos. Nota: Após a digestão, pequenos fragmentos de tecido e uma suspensão de células mistas incluindo glândulas epiteliais visíveis devem estar presentes (ver figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. física separação de células únicas
<ol><li>Em um ambiente esterilizado, coloque uma malha tensionada 250 µm com suporte em uma placa de Petri 150 x 15 mm2 . Certifique-se de que a malha é de cerca de 0,5 cm acima da superfície da caixa de Petri.</li>
	<li>Molhar a malha com 2 mL de HBSS modificado e transferir o tecido digerido para a malha.</li>
	<li>Usando a superfície plana de um êmbolo de seringa de 10 mL, com delicadeza mas com firmeza, moa o tecido digerido picado através da malha. Cuidado: Moagem muito agressivamente irá danificar a rede e aumentar a mortalidade de célula. Esta etapa irá separar as células epiteliais e células do estroma (incluindo células do sistema imunológico) o tecido conjuntivo e muco.</li>
	<li>Uma vez que os fragmentos de tecido tem sido completamente dispersos, elevar a malha e o titular modificado de 2-3 cm acima da placa de Petri e enxágue com 3 mL de HBSS recuperar células adicionais.</li>
	<li>Recolha a suspensão de eritrócitos. Coloque a 20 µm de malha com suporte em uma placa de Petri e molhado com 2 mL de HBSS modificado. Despeje a suspensão de eritrócitos através da malha segurando a malha de 2-3 cm acima da placa de Petri e enxágue com 6 mL de HBSS modificado. Nota: Este passo irá separar as folhas epiteliais, que são retidas na parte superior, de células únicas que atravessam a malha. A passagem é uma suspensão de células mistas, que inclui as células imunes e fibroblastos do estroma.</li>
	<li>Recolher a suspensão de células mistas e centrifugar 500 x g por 10 min. Aspire o líquido e resuspenda o pellet em 4 mL de HBSS modificado para centrifugação gradiente de densidade.</li>
	<li>Camada a suspensão de células mistas mais 3 mL de solução de polysucrose e centrifugar a temperatura ambiente a 500 x g por 30 min com sem freio. Recolher a faixa branca do topo da solução polysucrose e lave com PBS. Nota: Esta fração é a suspensão de célula mista enriquecida, que é rico em células do sistema imunológico e contém alguns fibroblastos do estroma.</li>
</ol>3. remoção de célula morto
Nota: Se uma grande percentagem de células mortas (> 20%) está presente na suspensão de célula mista enriquecido após centrifugação gradiente de densidade, remoção de células mortas com grânulos magnéticos é recomendada. Células mortas precisam ser removidos, pois eles podem interferir com o processo de seleção do grânulo magnética positiva.
<ol><li>Conte as células usando um hemocytometer em um microscópio de luz com o objetivo de X 10. Spin para baixo de todas as células na suspensão de célula mista enriquecido (500 x g, 10 min, 4 ° C). Completamente, aspirar e desprezar o sobrenadante. Adicione 100 µ l de grânulos de remoção de células mortas por 10 x 17 total células (vivos e mortos), de acordo com as instruções do fabricante. Incube a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Coloque um filtro de 30 µm na coluna magnética, aplicar a suspensão de células e permitem que as células grânulo-etiquetadas a cair através da coluna magnética.</li>
	<li>Lave a coluna com buffer de remoção de células mortas como recomendado (3 mL). Colete o escoamento contendo as células vivas. O intervalo de recuperação celular após a remoção de células mortas é apresentado na figura 1B. Nota: Estas células podem ser usadas para executar a citometria de fluxo, coloração para estudos fenotípica (secção 5) ou continuar com isolamento DC (secção 4).</li>
</ol>4. DC purificação pela seleção positiva do grânulo magnético
<ol><li>Após a remoção de células mortas (passo 3.2), girar as células para baixo, remover o sobrenadante e ressuspender as células no buffer de seleção magnética 80 µ l por 1 x 107 células (PBS, 0,5% inactivadas pelo calor AB soro humano (HS), 2 mM EDTA).</li>
	<li>Para a seleção positiva das populações de DC, adicione CD1a ou CD14 grânulos magnéticos de acordo com as instruções do fabricante (20 µ l magnético grânulos por 1 x 107 células). Incube por 15 min a 4° C.
</li>
	<li>Lavar as células com o buffer de seleção magnética, spin para baixo e retire o tampão completamente. Ressuspender as células em um mínimo de 500 µ l de tampão de seleção magnética.</li>
	<li>Unir a coluna ao ímã e adicionar um filtro de 30 µm no topo da coluna para reter qualquer restantes aglomerados de células. Lave o filtro e a coluna com seleção magnética como recomendado.</li>
	<li>Aplica a suspensão de células para a coluna. Lavar 3 vezes com tampão de seleção magnética.</li>
	<li>Transfira a coluna para um tubo de 15 mL, adicionar 5 mL de tampão de seleção magnética e aplicar o êmbolo para liberar as células selecionadas da coluna.</li>
	<li>Para aumentar a pureza, repita etapas 4.4-4.6 com as células recuperadas usando uma nova coluna. O intervalo de recuperação celular após seleção magnética do grânulo é apresentado na Figura 1.</li>
</ol>5. avaliação da pureza de célula: microscopia e citometria de fluxo
<ol><li>Anticorpo que mancha para citometria de fluxo:<ol>
<li>Ressuspender a 1 x 106 células em 100 µ l de PBS contendo 20% inactivadas pelo calor HS para bloquear receptores de Fc e incubar durante 10 min no gelo.</li>
		<li>Adicionar o desejado fluorescente etiquetado anticorpos e o reagente para identificação de células mortas (por exemplo, consulte a seção 6.5). Conjunto de fluorescência menos um controles (FMO) para estabelecer os portões e usar contas de compensação para preparar a única mancha controles de compensação. Exemplos de anticorpos usados são descritos na tabela 1. Incube durante 20 min a 4 ° C, protegido da luz.</li>
		<li>Lave as células com 2 mL de tampão de seleção magnética. Nota: A presença de EDTA é importante para evitar a formação de célula de aglutinação para análise de fluxo cytometric. Spin para baixo e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Corrigi as células adicionando-se 100 µ l de solução de paraformaldeído 2% pelo tubo.</li>
		<li>Analise as amostras em por um citômetro de fluxo10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girar a coluna (por exemplo, cytospin) e usar para analisar a morfologia de coloração de Giemsa:<ol>
<li>Ressuspender as células em 200 µ l de tampão de seleção magnética.</li>
		<li>Carregar em uma coluna de girar e girar por 5 min. Que o slide fique completamente seco.</li>
		<li>Corrigir o slide por imersão em metanol 100% por 2 min. Enxágue o slide com água desionizada e deixe-o ar seco.</li>
		<li>Realize uma coloração de Wright-Giemsa padrão. Cobrir as células com eosina e incubar durante 10 min, enxaguar com água desionizada e deixe secar. Cobrir as células com mancha Wrights-Geimsa, incubar por 1 min, enxaguar com água desionizada e secar ao ar.</li>
		<li>Examine os preparativos com um microscópio invertido (Figura 2A, objectivo de X 40).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. alogênico estimulação ensaio para avaliar a função da célula de DC
<ol><li>Descongelar as células mononucleares congelados de sangue periférico (PBMC)<ol>
<li>Aquecer o meio de cultura celular com 10% HS 37 ° c.</li>
		<li>Descongele os PBMCs colocando o criotubo num banho de água a 37 ° C, até que uma pequena quantidade de mídia congelados célula permanece no criotubo. Em um ambiente estéril, transferir o conteúdo do criotubo a 10 mL de meio de cultura celular previamente aquecido com 10% HS em um tubo de 15mL.</li>
		<li>Centrifugar a ~ 500 x g, durante 7 min. Remova a mídia, dispersar a pelota, resuspenda os PBMCs em 10 mL de meios de cultura celular com 10% HS e centrifugar as células.</li>
		<li>Repita a etapa de lavagem, uma terceira vez. Conte as células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleção de células T Naïve:<ol>
<li>Use um kit de seleção de célula de anticorpo magnético seleção negativa para isolar ingênuo células T de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Após o isolamento, verificar a pureza usando anticorpos CD45RA e CCR7. Nota: Pureza típica é > 99% ingênuo células T.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve T-proliferação tintura coloracao celular:<ol>
<li>Prepare-se 600 µ l da solução de 2 x de corante de proliferação celular, protegendo o corante de exposição à luz.</li>
		<li>Lave o ingênuo células T 2 x com PBS. Ressuspender as células em 500 µ l de PBS.</li>
		<li>Enquanto suavemente num Vortex as células no armário, a biossegurança adicionar 500 µ l de proliferação corante para o ingênuo células T.</li>
		<li>Incube as celulas por 10 min a 37° C.
</li>
		<li>Parar a rotulagem de célula pela adição de 5 mL de meio de cultura celular com 10% HS às células. Incube no gelo por 5 min, protegido da luz.</li>
		<li>Centrifugar as células no ~ 500 x g, durante 7 min, aspirar a mídia e ressuspender as células em 4 ° C, de meios de cultura celular com 10% HS. Repita mais duas vezes para um total de 3 lavagens. Tome uma alíquota de células para contar antes a última centrifugação. Nota: Normalmente, ingênuo final números de células T variam entre 5% e 15% da contagem inicial PBMC células.</li>
		<li>Ressuspender as células com o meio de cultura celular com 10% HS na concentração celular desejado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC-alogênico ingênuo células T co-cultura:<ol>
<li>O DCs isolado e ingênuo células T em uma placa de 96 poços, fundo redondo, a placa em um 01:15 proporção de DCs para células T. Garantir que o número ideal para DCs varia entre 3.000 e 5.000 células/poço.</li>
		<li>Centrifugue a placa no ~ 500 x g durante 3 minutos garantir que as células estão localizadas no centro do poço. Contato célula a célula é importante para a sinalização adequada para ocorrer.</li>
		<li>Incube a 37 ° C por 6 dias. Monitore o aglomerado de células, que aparecem em poços como proliferação ocorre, com microscopia (Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração para avaliar a proliferação de citometria de fluxo:<ol>
<li>Depois de 6 dias, as células podem ser examinadas por citometria de fluxo. Manche a co-cultura por citometria de fluxo.</li>
		<li>Prepare uma solução de 2 x de corante amarelo viabilidade (máximo de emissão 572 nm) em PBS. Nota: O uso de PBS sem soro é importante, como soro de proteínas interferem com o corante).</li>
		<li>Centrifugue a placa com células em ~ 500 x g durante 5 min.</li>
		<li>Remova 100 µ l do sobrenadante. Nota: neste momento coletar e armazenar o sobrenadante para análise separada dos fatores solúveis.</li>
		<li>Lavar as células duas vezes com PBS: Adicionar 150 µ l/poço de PBS, centrifugar a ~ 500 x g, durante 5 min, remover 150 µ l do sobrenadante com uma pipeta. Certifique-se de que não há 50 µ l do sobrenadante restantes em cada poço.</li>
		<li>Adicione 50 µ l de 2 x tintura de viabilidade para cada poço. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.</li>
		<li>Durante a incubação, prepare uma mistura de mestre dos marcadores do anticorpo desejado. Por exemplo: CD3 APC/Cy7, PE de CD4, CD8 FITC, etc.
</li>
		<li>Adicione a mistura de anticorpo para cada poço. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.</li>
		<li>Lavar as células 2 x com PBS + 2% HS: Adicionar 150 µ l/poço de PBS + 2% HS. Centrifugar a ~ 500 x g durante 5 min. remover 150 µ l do sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Corrigi as células adicionando-se 100 µ l/poço de 2% pará-formaldeído. Se necessário: transferir as células e mídia para tubos de citometria de fluxo de polipropileno. Os tubos podem ser mantidos a 4 ° C e protegidos da luz, até a análise de fluxo cytometric.</li>
		<li>Tubos de leitura em um citômetro de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

DCs da mucosa são uma população de células raras fortemente influenciada pelo ambiente de tecido, que muda seu fenótipo e a função, uma vez que eles entram os tecidos3. Enquanto o sangue derivado DCs são um modelo muito útil, totalmente não representam a diversidade de populações de DC, encontrado em tecidos. Portanto, para entender as características únicas do DCs da mucosa, o isolamento de células primárias de tecidos é necessário. Isolamento de DCs em locais anatômicos diferentes na FRT oferece...

A FRT tem a dupla função de proteger contra patógenos, permitindo a implantação e gravidez1. Para realizar isto, a FRT é compartimentada, com cada região anatômica, mostrando características histológicas, imunológicas e funcional1.
DCs presentes em superfícies mucosas fazem contato com micróbios no pulmão, intestino e do trato genital e fornecer vigilância imune para potenciais patógenos2. DCs têm a capacidade única de prime ingênuo células T e desencadear respostas imunes adaptáveis3. DCs no FRT também são especializados para tolerar a antígenos estranhos, tais como aqueles encontrados no esperma e o desenvolvimento do feto, para permitir que a gravidez bem sucedida4. Portanto, dependendo da localização, o fenótipo de DC e a função será distintos. É conhecido que DCs são fortemente influenciados pelo ambiente de tecido, tal que o seu número, fenótipo e funções são modificadas pelo ambiente de tecido em que residem3. Portanto, para entender o papel que FRT DCs desempenham na gravidez, doenças infecciosas e câncer no FRT, DCs residentes precisam ser estudados, desde sangue derivada DC modelos são insuficientes para resolver as complexidades regulamentares encontradas em tecidos FRT.
A caracterização do tecido humano residentes DCs é um desafio devido ao baixo número de células presentes nos tecidos da mucosa e a dificuldade de obtenção de amostras de tecido humano. DCs têm sido estudadas no FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre a localização da célula dentro do tecido, mas se opõe a estudos funcionais e é limitado o número de identificação de marcadores de células que podem ser analisados ao mesmo tempo. Além disso, os protocolos de isolamento única célula para análise de fluxo cytometric foram desenvolvidos7,8,9. Alguns desses protocolos tirar proveito da capacidade migratória do DCs para isolar as células que migram. Esses métodos normalmente exigem a incubação do durante a noite e seleção de DCs ativados, mas não permitem o estudo da DCs no estado estacionário.
Aqui, usando amostras de histerectomia, nós aperfeiçoamos um protocolo para isolar DCs em locais anatômicos diferentes no FRT, o endométrio (EM), a endocérvice (CX) e a ectocérvice (ECX), que permite a análise fenotípica e funcional. Usando um protocolo não-proteolíticas digestão enzimática, podemos prosseguir imediatamente após a digestão do tecido celular isolamento e fluxo cytometric uma caracterização sem ativação de células. Utilizando citometria de fluxo multicolor e adaptação de estudos funcionais para baixo número de células, nós podemos identificar e caracterizar raros subconjuntos de DCs em diferentes locais do Frist

<table><tbody><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Filtro Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um Stericup 500 mL&nbsp; Placa</td> de poliestireno <td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm Placa de Petri de poliestireno</td><td>FB0875712</td><td></td><td>Fisherbrand</td></tr><tr><td>150mm x 15mm</td><td>Placa</td><td></td> de poliestireno FB0875714 <td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Placa</td></tr> <tr>de cultura de células tratadas<td>Incubadora</td><td>Isotemp Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5,0% CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 μm malha de nylon</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 μm malha de náilon</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman GS-6R</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 com gentamicina L-Gln, Vermelho de Fenol, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Solução Tampão de Fosfato (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Células Mortas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de pré-separação (30um)</td><td>Coluna Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS multi-suporte</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microesferas, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas CD14, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 corante de proliferação celular</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 placa inferior redonda de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Corante de viabilidade amarelo zumbi</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC / Cy7, anti-humano</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-humano</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-humano</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Citômetro de Fluxo</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 cores, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 cores, VBR</td></tr></tbody></table>

isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

A caracterização das humano as células dendríticas (DCs) residentes nos tecidos da mucosa é um desafio devido à dificuldade na obtenção de amostras e o baixo número de DCs presentes por tecido. Ainda, como o fenótipo e a função de DCs é modificado pelo ambiente de tecido, é necessário analisar as populações residentes de tecido DC, desde sangue derivado DCs incompleta refletem as complexidades de DCs em tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar DCs de humano feminino trato reprodutivo (FRT) usando amostras de histerectomia que permite análise fenotípica e funcional. O protocolo é composto por digestão do tecido para gerar uma única célula misturado a suspensão de células, seguido pela seleção de grânulo magnética positiva. Nosso protocolo de digestão do tecido não cleave marcadores de superfície, que permite a análise fenotípica e funcional de DCs no estado estacionário, sem ativação de incubação ou celular durante a noite. Este protocolo pode ser adaptado para o isolamento de outros tipos de células imunes ou isolamento de DCs de outros tecidos.

Após digestão com tecido, o lançamento de folhas epiteliais e glândulas pode ser observado, como mostrado na figura 1A; Este é um controle positivo que indica que a digestão enzimática foi bem sucedida. O número de células viáveis totais e DCs recuperados por grama de tecido também é mostrado na figura 1B e Figura 1, respectivamente. As células imunes representam entre 5-30% das células do estroma an...

Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicos no trato reprodutivo feminino humano para avaliar suas características fenotípicas e funcionais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre células dendríticas residentes no tecido no trato genital feminino, como a compartimentalização anatômica de subconjuntos específicos e suas características funcionais. A principal vantagem desta técnica é que nosso protocolo de digestão tecidual não cliva marcadores de superfície, o que permite o isolamento imediato de células dendríticas sem incubação noturna ou ativação celular.Embora esse método tenha sido otimizado para isolar células dendríticas do trato reprodutivo feminino humano, ele também pode ser adaptado para isolar outras células imunológicas ou células dendríticas de outros tecidos. Demonstrando o procedimento estarão Fiona Barr e Jared Fortier, técnicos em nosso laboratório. Comece este procedimento enxaguando o tecido com HBSS modificado.Coloque o tecido em uma placa de Petri quadrada de 100 por 15 milímetros e adicione aproximadamente três mililitros de um coquetel de enzimas de digestão para evitar que o tecido seque. Ao usar uma pinça para estabilizar o tecido, pique-o com um bisturi para aumentar a área de superfície do tecido exposto ao coquetel de enzimas de digestão. Corte o tecido em pedaços pequenos.Adicione coquetel de enzimas de digestão suficiente para cobrir todos os pedaços de tecido e coloque a tampa na placa de Petri. Incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em um rotador a aproximadamente 80 rpm por 45 minutos. Certifique-se de que a velocidade do rotador misture completamente o coquetel de enzimas de digestão sem derramar ou produzir bolhas.Após 45 minutos, visualize o preparo do tecido com um microscópio de luz invertida com as objetivas 4X e 10X. Uma digestão enzimática bem-sucedida deve liberar folhas e glândulas epiteliais, como mostrado nesta imagem representativa. Realize a separação de células individuais em um ambiente estéril.Primeiro, coloque uma malha esticada de 250 micrômetros com suporte em uma placa de Petri quadrada de 150 por 15 milímetros e certifique-se de que a malha esteja cerca de 0,5 centímetros acima da superfície da placa de Petri. Em seguida, molhe a tela com dois mililitros de HBSS modificado e transfira o tecido digerido para a tela. Usando a superfície plana de um êmbolo de seringa de 10 mililitros, triture suavemente, mas com firmeza, o tecido picado digerido através da malha.Uma vez que os fragmentos de tecido tenham sido completamente dispersos, eleve a tela e o suporte dois a três centímetros acima da placa de Petri e enxágue com três mililitros de HBSS modificado para recuperar células adicionais. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros. Coloque uma malha de 20 micrômetros com suporte cerca de dois a três centímetros acima de uma nova placa de Petri e molhe com dois mililitros de HBSS modificado.Passe a suspensão celular pela malha e enxágue com seis mililitros de HBSS modificado. Recolher a suspensão de células mistas e centrifugar a 500 vezes g durante 10 minutos. Aspire o líquido e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de HBSS modificado.Coloque a suspensão de células mistas sobre três mililitros de solução de polissacarose para centrifugação com gradiente de densidade. Centrifugue à temperatura ambiente a 500 vezes g durante 30 minutos sem travão. Colete a faixa branca do topo da solução de polissacarose e lave com PBS.Uma vez coletada a suspensão enriquecida de células mistas, conte as células usando um hemocitômetro em um microscópio óptico com a objetiva 10X. Gire todas as células da suspensão celular por 10 minutos. Aspire completamente e descarte o sobrenadante.Em seguida, adicione grânulos de remoção de células mortas e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, coloque um filtro de 30 micrômetros no topo da coluna para reter quaisquer detritos de tecido ou agregados celulares restantes. Enxágue o filtro e a coluna com tampão de remoção de células mortas.Em seguida, aplique a suspensão celular e permita que as células marcadas com esferas fluam através da coluna magnética. Enxágue a coluna com três mililitros de tampão de remoção de células mortas quatro vezes. Colete o fluxo que contém as células vivas.Após a remoção das células mortas, gire as células para baixo. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em tampão de seleção magnética, 80 microlitros de tampão por um vezes 10 elevado às sete células. Para seleção positiva de populações de células dendríticas, adicione esferas magnéticas CD1a ou CD14 e incube a quatro graus Celsius por 15 minutos.Lave as células com o tampão de seleção magnética, gire para baixo, remova o tampão completamente e ressuspenda as células em um mínimo de 500 microlitros de tampão de seleção magnética. Prenda a coluna ao ímã e adicione um filtro de 30 micrômetros no topo da coluna para reter quaisquer detritos de tecido ou agregados celulares restantes. Enxágue o filtro e a coluna com tampão de seleção magnética.Aplique a suspensão da célula à coluna. Enxágüe três vezes com três mililitros de tampão de seleção magnética. Transfira a coluna para um tubo de 15 mililitros.Adicione cinco mililitros de tampão de seleção magnética e aplique o êmbolo para liberar as células selecionadas da coluna. Para aumentar a pureza, repita as etapas de purificação com as células recuperadas usando uma nova coluna. Posteriormente, avaliar a pureza celular por citometria de fluxo e microscopia, conforme descrito no protocolo de texto.Antes de iniciar este ensaio, as células T virgens são isoladas de células mononucleares do sangue periférico usando um kit disponível comercialmente. Lave as células T ingênuas duas vezes com PBS. Ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS.O restante do protocolo é realizado no escuro. Enquanto vórtice suavemente as células no gabinete de biossegurança, adicione 500 microlitros de uma solução 2X de corante de proliferação celular às células. Incube as células a 37 graus Celsius por 10 minutos.Pare a marcação celular adicionando às células cinco mililitros de meio de cultura celular com soro AB humano a 10%. Incubar no gelo durante cinco minutos, protegido da luz. Centrifugue as células a cerca de 500 vezes g durante sete minutos.Aspire o meio e ressuspenda as células em cinco mililitros de meio de cultura celular com soro AB humano a 10%. Antes da última centrifugação, pegue uma alíquota de células para contar. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em meio de cultura celular com soro AB humano a 10% na concentração celular desejada.Para iniciar a co-cultura de células T ingênuas alogênicas de células dendríticas, coloque as células dendríticas isoladas e as células T virgens em uma placa de fundo redondo de 96 poços em uma proporção de um para 15 de células dendríticas para células T. Centrifugue a placa a cerca de 500 vezes g por três minutos para garantir que as células estejam localizadas no centro do poço. Incubar a 37 graus Celsius por seis dias.Monitore as células por microscopia. Após seis dias, avaliar a proliferação celular por citometria de fluxo, conforme descrito no protocolo de texto. Este gráfico mostra o intervalo do número total de células viáveis recuperadas após o processamento do tecido e a remoção de células mortas em cada compartimento do trato reprodutivo feminino, endométrio, endocérvix e ectocérvix.O número de células dendríticas viáveis recuperadas por grama de tecido após o isolamento do grânulo magnético é mostrado a seguir. A morfologia dendrítica das células isoladas foi determinada por microscopia após a coloração de Giemsa. A expressão de marcadores fenotípicos antes e depois do isolamento do grânulo foi determinada por citometria de fluxo.Após o isolamento do grânulo CD1a positivo e CD14 positivo, a pureza variou entre 85 e 92% Um ensaio de estimulação alogênica foi realizado para avaliar a funcionalidade das células dendríticas. A formação de aglomerados de células T durante a proliferação foi confirmada pela coloração do corante de proliferação. A proliferação foi então quantificada por citometria de fluxo.Aqui é mostrada a estratégia de gating para identificar diferentes células dendríticas na suspensão de células mistas. Cada população fechada em gráficos multicoloridos é mostrada no próximo painel. Seguindo a estratégia de gating, subconjuntos específicos de células dendríticas são identificados.Espera-se um baixo número de células, pois as células dendríticas teciduais são populações raras. Uma vez dominado, o isolamento de células dendríticas dos tecidos pode ser feito em quatro a cinco horas, se for realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como digerir e processar enzimaticamente os tecidos para gerar uma única suspensão de células mistas e realizar a seleção de células dendríticas por esferas magnéticas para caracterização posterior.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Descrevemos aqui um método de isolamento para obtenção de linfócitos intraepiteliais endocervicais humanos para análise de células T gama delta intraepiteliais. Este protocolo pode ser estendido para a purificação de células T gama delta endocervicais por esferas magnéticas ou por classificação de células.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprenda a isolar células dendríticas do trato reprodutivo feminino humano para análise fenotípica e funcional. Este método preserva marcadores de superfície e pode ser adaptado para outras células imunes.

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

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