Name: Microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de enxertos de córnea. Esta técnica de alta resolução melhora a triagem de tecidos doadores e diferencia condições normais de patológicas.

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Este trabalho recebeu financiamento da Agence Nationale de Recherche (ANR), ao abrigo de uma subvenção PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) n.º ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) e do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie n.º 709104 (K.I.). Os autores agradecem a Céline de Sousa pela ajuda na contagem celular e processamento histológico.

Todos os métodos aqui descritos foram realizados de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e seguiram os requisitos éticos internacionais para tecidos humanos. Trata-se de um estudo prospectivo observacional caso-controle. Consentimento informado foi obtido dos pacientes. Não foram feitas modificações nos padrões franceses de tratamento ou acompanhamento. A aprovação do Comitê de Revisão Institucional (CEP) foi obtida do Comitê de Proteção ao Paciente, Ile-de-France V (14944).
1. Seleção e Preparo de Tecidos
<ol><li>Selecione córneas doadoras.
	<ol><li>Transferir córneas de doadores armazenadas em meio de cultura de órgãos 26 para meio de cultura de órgãos suplementado com dextrano por 3 dias para permitir deturgescência27 antes da imagem FF-OCM28 (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare as amostras.
	<ol><li>Posicionar a córnea, imersa em meio de armazenamento, no porta-amostras com o epitélio voltado para cima.</li>
		<li>Coloque uma lamínula de sílica limpa (fornecida com o suporte da amostra) sobre a córnea e feche o suporte girando suavemente sua base até que a amostra seja ligeiramente achatada e imobilizada sob a lamínula, proporcionando uma superfície de imagem relativamente uniforme. Tome precauções para evitar bolhas de ar.</li>
		<li>Aplique uma camada espessa de gel oftálmico ou óptico sobre a lamínula como meio de imersão.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inicialização, configuração e aquisição de imagens do FF-OCM
<ol><li>Inicialize o dispositivo.
	<ol><li>Ligue o dispositivo acionando o botão liga/desliga na parte traseira do dispositivo; iluminação de um LED verde na parte frontal do dispositivo indica que a energia está ligada.</li>
		<li>Ligue o computador dedicado e a fonte de luz halógena operando o interruptor de energia na parte frontal.</li>
		<li>Inicie o software de aquisição (consulte a Tabela de Materiais) clicando duas vezes no atalho da área de trabalho.</li>
		<li>Certifique-se de que o estágio de imagem esteja limpo, exceto para a bandeja móvel. Em seguida, clique em "OK" para inicializar os motores no prompt.</li>
		<li>Retire a bandeja e insira o porta-amostras no recipiente dedicado e, em seguida, empurre suavemente a bandeja para trás.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure o dispositivo.
	<ol><li>Digite um "identificador de amostra" no campo designado e obrigatório; opcionalmente, insira uma "descrição da amostra" e/ou "descrição do estudo".</li>
		<li>Clique em "Adquirir imagem de macro" quando estiver pronto, para criar um instantâneo da amostra que possa ser usado para fins de posicionamento lateral e navegação posteriormente; uma vez satisfeito, valide a imagem no prompt clicando em "Sim", após o que o dispositivo move a bandeja de amostra abaixo da objetiva e executa um ajuste automático.</li>
		<li>Certifique-se de que a objetiva do microscópio esteja bem imersa no gel óptico antes de prosseguir.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquira as pilhas.
	<ol><li>Selecione a guia "Explorar" para preparar uma aquisição.
		<ol><li>Antes de adquirir uma pilha de imagens, navegue até o centro da córnea, através da tradução do joystick ou seleção manual na tela (ou seja, clicando e arrastando o quadrado vermelho na imagem macro adquirida para o local desejado).</li>
			<li>Varie a profundidade da imagem por meio da rotação do joystick, ajuste do controle deslizante ou entrada manual do teclado na interface gráfica do usuário (GUI) e ajuste o valor médio (uma média de 40 é geralmente recomendada para imagens ideais da córnea). NOTA: Isso é feito para determinar a espessura da amostra da córnea e a média necessária para obter imagens através de toda a espessura da córnea, observando a primeira e a última localização da imagem em profundidade. A superfície inferior da lamínula cria franjas de interferência paralelas que são vistas na imagem tomográfica (no lado direito da GUI), que facilitam a localização da superfície da córnea.</li>
			<li>Insira o valor da superfície da córnea ou a localização da primeira imagem em profundidade no campo "Profundidade".</li>
		</ol></li>
		<li>Selecione a aba "Adquirir", para adquirir imagens.
		<ol><li>Selecione o "Espaçamento entre fatias" (a configuração padrão e recomendada é de 1 μm, correspondendo à resolução axial do dispositivo) e insira o valor da espessura da córnea de acordo, em "Número de cortes".</li>
			<li>Revise os parâmetros e o tempo de aquisição e, quando estiver satisfeito, pressione "OK" para iniciar a aquisição.</li>
			<li>Durante a aquisição, evite qualquer contato com a mesa na qual o FF-OCM está posicionado.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Gestão de Imagens Adquiridas
<ol><li>Visualize e exporte imagens.
	<ol><li>Inicie o software de visualização FF-OCM (consulte Tabela de Materiais) clicando duas vezes no atalho da área de trabalho; as imagens adquiridas (identificadas pelo ID da amostra) aparecem na lista "Estudos Locais".</li>
		<li>Selecione o estudo com o ID de amostra correspondente, que contém a imagem macro e a pilha de imagens adquiridas, e "exporte" a última clicando com o botão direito do mouse na série de imagens e selecionando o formato "DICOM" para reter os dados brutos de pixel e metadados para análise posterior.</li>
		<li>Exiba as pilhas de imagens 3D em visualizações en face e transversais usando o modo de reconstrução multiplanar (MPR), clicando duas vezes na série de imagens; Navegue pelas imagens (por exemplo, por meio de rolagem da roda do mouse ou ajuste deslizante) e selecione visualizações representativas de cada pilha.</li>
		<li>Exporte as visualizações selecionadas clicando no ícone no canto inferior direito da janela, usando o formato "DICOM".</li>
	</ol></li>
	<li>Importar imagens.
	<ol><li>Abra o software de processamento de imagens (consulte Tabela de Materiais) clicando duas vezes no atalho da área de trabalho e navegue até o "Bio-Formatos" "Importador" em "Plugins" para importar imagens DICOM; certifique-se de que "Agrupar arquivos com nomes semelhantes" esteja selecionado na janela "Opções de importação de bioformatos".</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise de Imagem: Avaliação Qualitativa e Quantitativa da Morfologia e Características Estromais
<ol><li>Avalie o estroma e a espessura da camada de Bowman.
	<ol><li>Meça distâncias manualmente em seções transversais da córnea, por exemplo, em cinco pontos igualmente espaçados ao longo da seção transversal25.<ol><li>Desenhe uma linha entre dois pontos de distância conhecida (como, da esquerda para a direita de toda a imagem, ou seja, de acordo com o campo de visão padrão, 1.024 pixels ou 780 μm), vá em "Analisar" e selecione "Definir escala", digite a "Distância conhecida" e a "Unidade de comprimento" nos campos apropriados e clique em "OK".</li>
			<li>Traçar uma linha entre dois pontos de distância desconhecida; Leia o comprimento ou a distância medida diretamente da barra de status.</li>
		</ol></li>
		<li>Registre a média e o coeficiente de variação (COV). Espessura da camada de Bowman menor que 6,5 μm e COV maior que 18,6% têm sido associados a estroma corneano anormal25.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar a densidade de ceratócitos.
	<ol><li>Seguindo a convenção da microscopia confocal: soma imagens estromais na face em grupos de 7 para produzir cortes de espessura comparável. Para isso, vá até a aba "Imagem" e selecione "Resfatia Z" em "Pilhas".</li>
		<li>Levar em conta a diferença (decrescente) da densidade celular na progressão pelo estroma24,25. Para isso, o estroma pode ser considerado como sendo composto por 4 regiões de acordo com a profundidade: (1) o estroma muito anterior abaixo da camada de Bowman, que é 2% de toda a espessura do estromal; o estroma remanescente (ou seja, 98% de toda a espessura do estroma), com três zonas de espessura idêntica: (2) estroma anterior, (3) estroma médio e (4) estroma posterior.</li>
		<li>Para análise posterior, incluir todos os cortes disponíveis na face para o estroma muito anterior, 15 imagens para o estroma anterior, 5 imagens para o estroma médio, bem como 5 imagens para o estroma posterior (onde o número de imagens por região necessário para uma contagem confiável foi determinado por análise stepwise29).</li>
		<li>Em cada imagem em face , selecione uma região de interesse de 300 μm x 300 μm. Para melhorar a visualização do núcleo, inverta a imagem, usando "Inverter" na guia "Editar", e ajuste o contraste e o brilho. Para este último, vá para "Imagem" e navegue até "Brilho/Contraste" em "Analisar".</li>
		<li>Contagem manual dos núcleos celulares, utilizando, por exemplo, a função "contador de células"25. Para isso, vá em "Plugins" e navegue até "Cell Counter" em "Analyze". Pressione "inicializar" e selecione um tipo de contador. Em seguida, comece a contar os núcleos celulares clicando em feições ovais escuras na imagem invertida, considerando aquelas que pousam em uma borda de imagem apenas para dois dos quatro lados da imagem25.</li>
		<li>Registrar a densidade celular em termos de densidade de área, ou seja, em células/mm² (dividir o número de células contadas por 0,09, para converter de células/90.000 μm² para células/mm²), seguindo a convenção de microscopia confocal, onde as densidades de ceratócitos demonstraram ser menores em pacientes (por exemplo, com ceratocone) do que em indivíduos saudáveis e correlacionadas com a gravidade da doença25. NOTA: Mais estudos clínicos são necessários para determinar se um limiar mínimo de densidade de ceratócitos é necessário para obter um enxerto de córnea perfeitamente claro após o transplante.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliar a refletividade estromal.
	<ol><li>Gerar perfis de profundidade de intensidade média de pilhas de imagens estromais, utilizando, por exemplo, a função "perfil do eixo Z" e/ou software personalizado25,30,31. NOTA: Estes são, na verdade, perfis de profundidade de amplitude, pois FF-OCM mede a amplitude da luz retroespalhada pela amostra em vez de sua intensidade.<ol><li>Calcule o nível médio de cinza para cada pilha de faces .</li>
			<li>Subtraia o valor cinza mínimo e normalize pelo valor cinza máximo.</li>
			<li>Exibição em escala logarítmica em função da profundidade do estroma (% da espessura do estroma).</li>
			<li>Aproximar o perfil logarítmico resultante por uma linha de regressão linear, que minimiza a soma dos resíduos quadrados (ajuste de mínimos quadrados).</li>
			<li>Registre o valor do R-quadrado (R²) como uma medida de linearidade. Valores abaixo de 0,94 poderiam ser indicativos de patologiacorneana25. OBS: Para diferenciar a inadequação de um modelo de regressão logarítmica linear (ou modelo de decaimento monoexponencial) devido à presença de uma patologia de mero ruído de medição, a análise de sinais por inferência bayesiana pode ser realizada31. Além disso, em córneas com perfis lineares logarítmicos (ou monoexponenciais) de profundidade estromal (por exemplo, representados por valores de R-quadrado30 ou razões de Birge 31 próximos a 1), o cálculo do caminho livre médio de fótons a partir da taxa de decaimento do sinal pode ser usado para quantificar ainda mais o grau de transparência31.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Avaliar a visibilidade de outras características estromais e indicadores de doenças.
	<ol><li>Verifique a presença de cicatrizes, tecido fibrótico, lagos ou estrias de Vogt.</li>
		<li>Avaliar a espessura média dos nervos no estroma, se suficientemente visível para a mensuração24.<ol><li>Selecione uma imagem na face onde o nervo estromal é mais visível (geralmente na região do estroma médio).</li>
			<li>Meça a espessura do nervo, por exemplo, em cinco pontos24, depois calcule a média e o desvio padrão. Espessuras nervosas acima de 9 μm podem ser um indicador adicional de patologia, como o ceratocone24.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui descrito para a avaliação qualitativa e quantitativa do estroma doador de córnea utilizando FF-OCM baseia-se na análise histológica de características macroscópicas e microscópicas indicativas de condição estromal, além das capacidades de OCT de domínio espectral e microscopia confocal21,24,25, e permite a diferenciação de tecidos humanos doentes de normais.
Além de uma excelente avaliação da qualidade endotelial de córneas de doadores humanos por meio de microscopia especular, a avaliação da qualidade estromal é desafiadora em bancos de olhos, e geralmente limitada a uma observação macroscópica com biomicroscopia com lâmpada de fenda e/ou microscopia óptica nos protocolos atuais. A falta de resolução fina com os métodos existentes não só significa que podem ser selecionadas córneas com alguma doença estromal que comprometam o resultado da ceratoplastia, mas também que as córneas podem ser rejeitadas por opacidades estromais que são, de fato, restrição ao estroma anterior ou regiões epiteliais e ainda poderiam ser usadas para procedimentos de ceratoplastia endotelial14.
O protocolo atual do banco de olhos poderia ser complementado com a adição do FF-OCM, que devido à sua resolução superior, constitui uma ferramenta poderosa e não invasiva para completar a avaliação da qualidade da córnea, especialmente do estroma (incluindo a camada de Bowman). Ao contrário do exame com lâmpada de fenda, o enxerto permanece imerso em uma câmara fechada preenchida com meio de armazenamento durante toda a aquisição da imagem FF-OCM, diminuindo qualquer risco potencial de contaminação.
Para uma aquisição de imagens bem-sucedida com FF-OCM (ver Tabela de Materiais), é importante que a objetiva do microscópio esteja bem imersa no gel óptico que é aplicado na parte superior da lamínula do porta-amostras (passo 2.2.3). Recomenda-se ainda verificar regularmente a calibração do aparelho, procedimento também a ser realizado após ajuste automático malsucedido (passo 2.2.2) e acessado via "Ferramentas e opções" no software de aquisição (vide Tabela de Materiais). O procedimento, que envolve a utilização de um espelho de calibração no porta-amostras, é o mesmo que a preparação habitual da amostra (ver passo 1.2), com a excepção de que o gel óptico deve ser aplicado no espelho antes do posicionamento da lamínula.
Uma série de enxertos de córnea de doadores, considerados normais pelos procedimentos existentes em banco de olhos, foi utilizada para descrever o protocolo deste manuscrito e demonstrar especificamente a adequação do FF-OCM para avaliação precisa e confiável da qualidade do estroma do doador. Essas córneas de doadores normais foram comparadas com córneas patológicas imersas em meio de armazenamento, mostrando que a análise histológica possibilitou com FF-OCM várias características estromais (ilustradas na Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8) em enxertos de córnea permite distinguir tecidos corneanos humanos doentes de normais.
Além das alterações morfológicas, como a presença de cicatrizes (Figura 5 e Figura 7), tecido fibrótico (Figura 8), lagos (Figura 2), estrias de Vogt (Figura 4) ou aumento do diâmetro do nervo estromal (Figura 4), características estromais típicas estão presentes nas córneas doentes. Parâmetros estromais particularmente relevantes na avaliação da qualidade do estroma parecem ser a espessura da camada de Bowman e sua variabilidade, e a refletividade do estroma. As etapas críticas dentro do protocolo são, portanto, as etapas 4.1 e 4.3.
Embora secretada durante o desenvolvimento corneano humano, a camada de Bowman, em particular, torna-se distinta às 19 semanas de gestação e nunca se repara após o nascimento32. Os danos à camada de Bowman são, portanto, irreversíveis e servem como um indicador ideal de danos estromais prévios no tecido corneano do doador, incluindo danos causados por cirurgia refrativa, ceratite infecciosa, ceratocone. Tais doenças corneanas, que constituem contraindicações para o uso da córnea do doador, estão associadas à diminuição e variação da espessura da camada de Bowman devido à interrupção e cicatrização (Figura 5), e provavelmente não serão detectadas pelos protocolos atuais do banco de olhos quando a história do doador não for conhecida com precisão.
Embora a transparência da córnea esteja prejudicada após a morte do doador devido ao edema corneano post mortem , espera-se que a quantidade de luz retroespalhada, ou refletividade do estroma, diminua exponencialmente com a profundidade do estroma (ver Figura 3 e Figura 4A); como resultado, o logaritmo da refletividade estromal normalizada será uma função linear da profundidade do estroma em córneas doadoras normais, representada por valores de R-quadrado próximos a 1. Por outro lado, a presença de características macroscópicas está associada a perfis logarítmicos não lineares de profundidade e indicativos de doença estromal (Figura 4B e Figura 7)25.
Uma vez que a densidade de queratócitos é responsável pela síntese e renovação da fibrila do colágeno estromal e da matriz extracelular, parece razoável supor que a densidade de queratócitos seja outro parâmetro relevante para avaliar a qualidade do estroma do doador, e que tecidos com contagens muito baixas de ceratócitos não devam ser transplantados. O protocolo inclui, portanto, um método preciso e confiável para medir a densidade de ceratócitos a partir de imagens FF-OCM que pode ser facilmente utilizado em bancos de olhos25 e segue a convenção da microscopia confocal. Note-se que, com FF-OCM, a densidade de ceratócitos também pode ser determinada pela contagem de queratócitos diretamente no corte transversal33, uma vantagem potencial sobre a microscopia confocal, que requer que os queratócitos sejam contados em múltiplos cortes na face. No entanto, ao contrário de pacientes vivos, em que a densidade de ceratócitos demonstrou ser menor em pacientes com doença do que em controles normais 34,35,36,37 e correlacionar-se com a gravidade da doença 34,38, esse não foi o caso em amostras de tecido humano ex vivo 25 , e mais estudos são necessários para determinar se um número mínimo de queratócitos é necessário nas córneas doadoras para resultar em boa recuperação visual após o transplante. A baixa densidade de ceratócitos tanto no tecido doador quanto no tecido patológico poderia ser explicada pelo envelhecimento, perda post mortem de células induzida por isquemia e/ou armazenamento de tecido doador 27,39,40,41. Deve-se ressaltar também que as córneas de doadores normais obtidas e imageadas neste protocolo estavam armazenadas e edemaciadas ou desinchadas, ou haviam sido descartadas pelo banco de olhos antes do transplante devido à má qualidade endotelial de acordo com os padrões da EU Eye Bank Association. Se as imagens de FF-OCM juntamente com o protocolo descrito fossem incluídas no banco de olhos, as córneas normalmente seriam avaliadas em um estado mais fresco do que foi possível aqui, o que pode afetar as densidades de queratócitos.
O protocolo aqui descrito para a análise da qualidade do estroma poderia ser estendido para avaliação da membrana de Descemet, que também pode ser resolvida com FF-OCM em termos de espessura e estrutura21,24. Isso pode ser útil para a seleção de tecidos para ceratoplastia endotelial de membrana de Descemet, onde membranas finas de Descemet podem ser mais difíceis de separar do estroma.
Em conclusão, o FF-OCM permite a avaliação precisa e confiável do estroma corneano de doadores humanos durante o armazenamento. Ao melhorar a qualidade do enxerto, a adição desse protocolo aos procedimentos atuais de banco de olhos tem o potencial de melhorar a triagem e seleção de tecidos doados e, consequentemente, os resultados da ceratoplastia. A integração na vida real do dispositivo FF-OCM na rotina do banco de olhos deve ser facilitada pelas recentes atualizações tecnológicas, incluindo aquisição de imagens mais rápida e maior campo de visão graças ao desenvolvimento de uma câmera CMOS personalizada e ao design de descartáveis estéreis personalizadas para armazenamento e manuseio de córneas durante a aquisição de imagens.

As doenças da córnea estão entre as principais causas de cegueira nomundo1. Algumas doenças só podem ser tratadas cirurgicamente, muitas vezes envolvendo a substituição de parte (isto é, ceratoplastia lamelar) ou de toda (isto é, ceratoplastia penetrante) córnea doente, por tecido doado, o enxerto, retirado de um indivíduo recentemente falecido. Para doenças corneanas que não afetam o endotélio (por exemplo, ceratocone, cicatrizes estromais após ceratite infecciosa, trauma e distrofias estromais), a ceratoplastia lamelar anterior profunda (DALK) é atualmente considerada a técnica cirúrgica de escolha2,3,4,5. Essa técnica possibilita a preservação do endotélio corneano do receptor, substituindo apenas o epitélio corneano central e o estroma, que está associado à menor incidência de rejeição do enxerto, ausência de rejeição endotelial, menor perda de células endoteliais e relação custo-efetividade favorável6,7,8,9,10,11 . A DALK permite ainda que córneas com qualidade endotelial abaixo do ideal sejam utilizadas como enxertos, uma vez que essa camada comprometida não será transplantada12. Por outro lado, a qualidade do estroma corneano do doador provavelmente será o principal fator limitante para o sucesso do enxerto e a recuperação da visão, pois o estroma é a única camada córnea doadora a permanecer, enquanto o epitélio do doador será substituído pelo epitélio do receptor. Infelizmente, os meios para avaliar o estroma corneano do doador em bancos de olhos são limitados. Geralmente incluem o exame com lâmpada de fenda do globo ocular do doador quando a recuperação tecidual é feita por enucleação e exame fotomicroscópico do estroma doador13. Alguns bancos de olhos começaram a complementar esses procedimentos padrão usando a tomografia de coerência óptica no domínio de Fourier (FD-OCT)14.
A tomografia de coerência óptica (OCT), análogo óptico à ultrassonografia15, utiliza a interferência da luz de banda larga ou sintonizável para gerar cortes ópticos daretina16 e do segmentoanterior17. Na OCT no domínio do tempo, a base dos primeiros sistemas clínicos, a posição de um espelho de referência é alterada, de modo que os padrões de interferência aparecem sempre que o feixe de referência percorre quase a mesma quantidade de tempo que o feixe refletido nas várias interfaces teciduais, com varreduras A sendo geradas em função do tempo. No FD-OCT (também chamado de OCT no domínio espectral ou da frequência), a base da maioria dos sistemas clínicos modernos, o espelho de referência é fixado em uma posição e um A-scan individual, com todos os padrões de interferência misturados, é adquirido de cada vez, e dissecado separadamente através da análise de Fourier.
Embora os sistemas de OCT clínicos (tempo ou domínio espectral) permitam visões transversais da córnea e a detecção de opacidades estromais em uma resolução axial mais alta do que a biomicroscopia com lâmpada de fenda, sua resolução lateral é limitada. A microscopia confocal18 permite o exame da córnea em resolução lateral aproximando-se dos detalhes histológicos, mas é limitada axialmente.
A microscopia tomográfica de coerência óptica de campo total (FF-OCT ou FF-OCM)19,20 combina elementos da microscopia confocal e da OCT, alcançando uma resolução lateral comparável à resolução axial de cerca de 1 μm. Mais especificamente, o FF-OCM usa fontes de luz de banda larga incoerentes (por exemplo, uma lâmpada halógena) e óptica de alta abertura numérica para adquirir imagens tomográficas 2D em face sem varredura lateral. Ao escanear na direção da profundidade, o FF-OCM permite imagens 3D não invasivas de amostras de tecido biológico ex vivo fresco ou fixo. Tem sido utilizado para obtenção de imagens da córnea21,22,23. Ao fornecer imagens de alta resolução em face e transversais, o FF-OCM fornece informações sobre a estrutura histológica e detalhes celulares da córnea. De fato, o FF-OCM demonstrou fornecer informações estruturais superiores à histologia e foi capaz de identificar mais indicadores de doença, como foi possível com a combinação de OCT de domínio espectral e microscopia confocal24,25.
Descrevemos um protocolo para avaliação qualitativa e quantitativa do estroma de doadores de córnea utilizando FF-OCM. O método é baseado na análise histológica de características macroscópicas e microscópicas indicativas da condição estromal, incluindo três parâmetros quantitativos do estroma (isto é, espessura da camada de Bowman e sua variabilidade, e refletividade estromal). O protocolo descrito é, portanto, aplicado a tecidos normais e anormais da córnea e permite a diferenciação de tecidos corneanos humanos doentes de normais.

<table><tbody><tr><td>Light-CT Scanner</td><td>LLTech, França</td><td>http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/</td> <td>Dispositivo FF-OCM usado neste manuscrito para imagens</td></tr><tr><td>CorneaJet</td><td>EuroBio, França</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html</td><td>Meio de cultura de órgãos no qual as córneas do doador são armazenadas</td></tr><tr><td>CorneaMax</td><td>EuroBio, França</td><td>http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html</td><td>Meio de cultura de órgãos suplementado com Dextrana usado para deturgescência&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD, EUA</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Software de processamento de imagem de código aberto</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, Inc., Natick, MA, EUA</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>Software de computação matemática</td></tr></tbody></table>

microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea

Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts

A qualidade do estroma corneano doador, que representa cerca de 90% da espessura total da córnea, é provavelmente um dos principais, senão o maior, fator limitante para o sucesso da ceratoplastia lamelar anterior profunda e penetrante. São procedimentos cirúrgicos que envolvem a substituição de parte ou da totalidade das camadas corneanas doentes, respectivamente, por tecido doado, o enxerto, retirado de um indivíduo falecido recentemente. No entanto, os meios para avaliar a qualidade estromal dos enxertos de córnea em bancos de olhos são limitados e carecem da capacidade de avaliação quantitativa de alta resolução dos indicadores da doença. A microscopia de coerência óptica de campo total (FF-OCM), que permite imagens 3D de alta resolução de amostras de tecido biológico vivo vivo fresco ou fixo, é uma técnica não invasiva adequada para a avaliação da córnea do doador. Descrevemos um método para análise qualitativa e quantitativa do estroma corneano utilizando FF-OCM. O protocolo tem sido aplicado com sucesso em córneas de doadores normais e botões patológicos da córnea, podendo ser utilizado para identificar características patológicas e sadias tanto em nível macroscópico quanto microscópico, facilitando a detecção de distúrbios estromais que possam comprometer o resultado da ceratoplastia. Ao melhorar o controle de qualidade do enxerto, esse protocolo tem o potencial de resultar em melhor seleção (e rejeição) dos tecidos doados e, consequentemente, na diminuição da falha do enxerto.

O dispositivo FF-OCM (ver Tabela de Materiais)28 e o arranjo geral usado neste manuscrito são mostrados na Figura 1. A Figura 2 mostra uma córnea de doador humano inchada, após armazenamento em meio de cultura de órgãos, dando um modelo fisiopatológico de córnea edematosa e impedindo a aquisição de imagens FF-OCM através de toda a espessura corneana devido à profundidade limitada de penetração. A transferência para meio de cultura de órgãos suplementado com dextrano causa desinchamento e resulta em córneas doadoras de espessura normal, conforme representado na Figura 3. As córneas doentes podem ser reconhecidas por alterações morfológicas e características estromais típicas, incluindo espessura diminuída e variável do estroma (Figura 4) e/ou da camada de Bowman (Figura 5). A avaliação da densidade de ceratócitos (Figura 6) e da refletividade estromal (Figura 7) pode auxiliar ainda mais na análise histológica e diferenciação de tecidos corneanos normais de patológicos com FF-OCM, além das capacidades dos sistemas clínicos de OCT (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig1.jpg"> Figura 1: Esquema e fotografias do setup geral e do dispositivo FF-OCM utilizado neste trabalho. (A) Fotografia do dispositivo FF-OCM (ver Tabela de Materiais)28. (B) Configuração esquemática e óptica do dispositivo. (C) Fotografia de uma córnea de doador humano no porta-amostras. (D) Zoom na objetiva de imersão e no porta-amostras. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig2.jpg"> Figura 2: Córnea humana normal em cultura de órgãos antes da deturgescência. Corte transversal (A) e em face (B, corte através do estroma) de córnea inchada ("edematosa") causada pelo armazenamento em meio de cultura de órgãos, onde lagos podem ser vistos como áreas escuras (como indicado por setas). A espessura da córnea dobrou para mais de 1.100 μm, impedindo a aquisição de imagens em toda a profundidade. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig3.jpg"> Figura 3: Córnea humana normal cultivada em órgãos após deturgescência. Corte transversal em toda a córnea (A) e na face estromal (B) de córnea desinchada, imersa em meio suplementado com dextrano, mostrando queratócitos hiper-reflexivos (brancos) regularmente distribuídos. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig4.jpg"> Figura 4: Avaliação global da morfologia e características estromais, incluindo espessura estromal. Em comparação com a córnea humana normal (A), as córneas com ceratocone (B) apresentam espessura estromal diminuída e variável, juntamente com numerosas estrias de Vogt paralelas que são observáveis como bandas verticais escuras em cortes transversais e nervos estromais espessos que podem ser encontrados em cortes médio-estromais na face (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig5.jpg"> Figura 5: Avaliação da espessura da camada de Bowman, que é delimitada anteriormente pela membrana basal epitelial hiper-reflexiva e posteriormente pelos queratócitos hiper-reflexivos no estroma muito anterior. Em comparação com uma córnea humana normal (A), a córnea patológica (por exemplo, ceratocone) (B) apresenta diminuição e espessura variável da camada de Bowman devido à interrupção e cicatrização. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig6.jpg"> Figura 6: Avaliação da densidade de ceratócitos. (A) Os núcleos de queratócitos são contados manualmente em imagens de face aumentada e invertida após a seleção de uma região de interesse de 300 μm x 300 μm. (B) Os núcleos contados são indicados por setas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig7.jpg"> Figura 7: Avaliação da refletividade estromal. A quantidade de luz retroespalhada diminui (exponencialmente) com a profundidade no estroma das córneas doadoras normais (ver Figura 3 e Figura 4A), resultando em perfis lineares logarítmicos de profundidade, representados por valores de R-quadrado próximos a 1 (traço verde). Isso pode não ser verdadeiro para córneas patológicas que caracterizam regiões estromais de retroespalhamento de luz aumentada (ver Figura 4B). A presença de tais características macroscópicas, como no exemplo de uma córnea com cicatriz estromal após ceratite infecciosa (representada no inset), criará perfis de profundidade de intensidade logarítmica não lineares, representados por um valor de R-quadrado abaixo de um determinado limiar (por exemplo, menor que 0,9425; traço vermelho). Note que os perfis de profundidade de amplitude logarítmica são de fato mostrados quando FF-OCM mede a amplitude da luz retroespalhada pela amostra em vez de sua intensidade.  <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57104/57104fig8.jpg"> Figura 8: Demonstração dos benefícios do FF-OCM sobre a histologia e o domínio espectral do OCT. (A) Histologia e (B) correspondente imagem de domínio espectral-OCT adquirida na mesma córnea in vivo antes da ceratoplastia. (C) Corte transversal FF-OCM correspondente do botão corneano ex vivo pós-ceratoplastia, ilustrando resolução superior em comparação com as imagens clínicas de OCT no domínio espectral. A fibrose também é mais claramente visível nas imagens de FF-OCM do que na histologia. A alta densidade de queratócitos no estroma superior pode ser claramente observada tanto nas incidências transversais (C) quanto nas faces (D). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57104/57104fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos o uso da microscopia de coerência óptica de campo total como método para avaliação de alta qualidade do estroma doador de córnea. Esse protocolo pode ser utilizado para identificar características indicativas de saúde ou doença, e visa melhorar a triagem e seleção de tecidos doados e, consequentemente, os resultados da ceratoplastia.

Microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea

The quality of donor corneal stroma, which makes up about 90% of total corneal thickness, is likely to be one of the main, if not the major, limiting ...

Este método pode melhorar a triagem e seleção de tecidos doadores de córnea em bancos de olhos, melhorar os resultados do transplante de córnea. A principal vantagem desta técnica é sua capacidade de avaliação de alta resolução e que a córnea permanece imersa em uma câmara fechada preenchida com meio de armazenamento durante toda a aquisição das imagens, diminuindo qualquer risco potencial de contaminação. Quem demonstrará o procedimento será Maelle Vilbert, doutora em nosso laboratório.Para começar, posicione a córnea imersa em meio de armazenamento no porta-amostras com o epitélio voltado para cima. Coloque uma tampa de sílica limpa fornecida com o porta-amostras em cima da córnea. Em seguida, feche o suporte girando suavemente sua base até que a amostra seja levemente achatada e imobilizada sob a lamínula da tampa, proporcionando uma superfície de imagem relativamente uniforme.Tome precauções para evitar bolhas de ar. Aplique uma camada espessa de gel oftálmico ou óptico sobre a tampa como meio de imersão. Inicialize o dispositivo ligando o botão liga/desliga na parte traseira do dispositivo.A iluminação de um LED verde na parte frontal do dispositivo indica que a energia está ligada. Certifique-se de que o estágio de imagem esteja limpo, exceto para a bandeja móvel. Em seguida, clique em OK no software de aquisição para inicializar os motores no prompt.Para configurar o dispositivo, insira um identificador de amostra no campo designado e obrigatório. E, opcionalmente, insira uma descrição da amostra e a descrição do estudo. Em seguida, clique em Adquirir imagem de macro para criar um instantâneo da amostra que pode ser usado posteriormente para fins de posicionamento lateral e navegação.Quando estiver satisfeito, valide a imagem no prompt clicando em Sim. Após o que o dispositivo moverá a bandeja de amostra abaixo da objetiva e executará um ajuste automático. Certifique-se de que a objetiva do microscópio esteja bem imersa no gel óptico antes de prosseguir.Prepare a aquisição acessando a guia Explorar. Antes de adquirir uma pilha de imagens, navegue até o centro da córnea através do joystick ou seleção manual na tela. Varie a profundidade da imagem através da rotação do joystick, ajuste do controle deslizante ou entrada manual do teclado na interface gráfica do usuário.Em seguida, ajuste o valor médio para 40 para obter imagens ideais da córnea. Insira o valor da superfície da córnea ou a localização da primeira imagem no campo de profundidade. Em seguida, selecione a guia Adquirir para adquirir imagens.Selecione e defina o espaçamento de fatia correspondente à resolução axial do dispositivo. Insira o valor de espessura da córnea em Número de fatias. Revisão de parâmetros e tempo de aquisição.E quando estiver satisfeito, pressione OK para iniciar a aquisição. Durante a aquisição, evitar o contato com a mesa em que o microscópio está posicionado. Para avaliar a espessura do estroma e da camada de Bowman, meça as distâncias dos cortes transversais da córnea.Por exemplo, adicione cinco pontos igualmente espaçados na seção transversal, conforme descrito no manuscrito de texto. Desenhe uma linha entre dois pontos de distância conhecida de acordo com o campo de visão padrão. Em seguida, vá para a guia Analisar e selecione Definir escala.Insira a distância conhecida e a unidade de comprimento nos campos apropriados. Defina em 1024 pixels ou 780 micrômetros e clique em OK. Desenhe uma linha entre dois pontos de distância desconhecida e leia o comprimento ou a distância medida diretamente da barra de status. Registre a média e o coeficiente de variação.Clique na guia Imagem e selecione Reslice Z em Pilhas para determinar a densidade de queratinócitos. Isso somará as imagens estromais em face em grupos de sete para produzir cortes de espessura comparável. Para análise posterior, incluir todos os cortes disponíveis na face para o estroma anterior, 15 imagens para o estroma anterior, cinco imagens para o estroma médio e cinco imagens para o estroma posterior.Em cada imagem voltada, selecione uma região de interesse de 300 por 300 micrômetros. Para melhorar a visualização do núcleo, inverta a imagem usando Inverter na guia Editar. Ajuste o contraste e o brilho clicando na guia Imagem e navegando até Brilho-Contraste.Para contar manualmente os núcleos das células, vá para Plug-ins e navegue até Contador de células na guia Analisar. Pressione Inicializar e selecione um tipo de contador. Em seguida, conte os núcleos celulares clicando em feições ovais escuras na imagem invertida, considerando aquelas que pousam em uma borda de imagem apenas para dois dos quatro lados da imagem.A córnea doadora humana selecionada estava inchada após o armazenamento em meio de cultura de órgãos, dando um modelo fisiopatológico da córnea edematosa e impedindo a aquisição de imagens através de toda a espessura corneana devido à profundidade limitada de penetração. A transferência para o meio de cultura de órgãos suplementado com dextrina, reduziu o inchaço e resultou em córneas doadoras de espessura normal. As córneas doentes foram reconhecidas por alterações morfológicas e características estromais típicas, incluindo uma diminuição na espessura variável do estroma ou na camada de Bowman.A avaliação da densidade de queratinócitos e da refletividade estromal auxiliou ainda mais na análise histológica e diferenciação de tecidos corneanos normais de patológicos com microscopia de coerência óptica de campo total, o que está além das capacidades dos sistemas clínicos de tomografia de coerência óptica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar análises qualitativas e quantitativas semelhantes à histologia do estroma corneano, permitindo a diferenciação da doença dos tecidos normais da córnea humana.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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