Microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea

Este método pode melhorar a triagem e seleção de tecidos doadores de córnea em bancos de olhos, melhorar os resultados do transplante de córnea. A principal vantagem desta técnica é sua capacidade de avaliação de alta resolução e que a córnea permanece imersa em uma câmara fechada preenchida com meio de armazenamento durante toda a aquisição das imagens, diminuindo qualquer risco potencial de contaminação. Quem demonstrará o procedimento será Maelle Vilbert, doutora em nosso laboratório.

Para começar, posicione a córnea imersa em meio de armazenamento no porta-amostras com o epitélio voltado para cima. Coloque uma tampa de sílica limpa fornecida com o porta-amostras em cima da córnea. Em seguida, feche o suporte girando suavemente sua base até que a amostra seja levemente achatada e imobilizada sob a lamínula da tampa, proporcionando uma superfície de imagem relativamente uniforme.

Tome precauções para evitar bolhas de ar. Aplique uma camada espessa de gel oftálmico ou óptico sobre a tampa como meio de imersão. Inicialize o dispositivo ligando o botão liga/desliga na parte traseira do dispositivo.

A iluminação de um LED verde na parte frontal do dispositivo indica que a energia está ligada. Certifique-se de que o estágio de imagem esteja limpo, exceto para a bandeja móvel. Em seguida, clique em OK no software de aquisição para inicializar os motores no prompt.

Para configurar o dispositivo, insira um identificador de amostra no campo designado e obrigatório. E, opcionalmente, insira uma descrição da amostra e a descrição do estudo. Em seguida, clique em Adquirir imagem de macro para criar um instantâneo da amostra que pode ser usado posteriormente para fins de posicionamento lateral e navegação.

Quando estiver satisfeito, valide a imagem no prompt clicando em Sim. Após o que o dispositivo moverá a bandeja de amostra abaixo da objetiva e executará um ajuste automático. Certifique-se de que a objetiva do microscópio esteja bem imersa no gel óptico antes de prosseguir.

Prepare a aquisição acessando a guia Explorar. Antes de adquirir uma pilha de imagens, navegue até o centro da córnea através do joystick ou seleção manual na tela. Varie a profundidade da imagem através da rotação do joystick, ajuste do controle deslizante ou entrada manual do teclado na interface gráfica do usuário.

Em seguida, ajuste o valor médio para 40 para obter imagens ideais da córnea. Insira o valor da superfície da córnea ou a localização da primeira imagem no campo de profundidade. Em seguida, selecione a guia Adquirir para adquirir imagens.

Selecione e defina o espaçamento de fatia correspondente à resolução axial do dispositivo. Insira o valor de espessura da córnea em Número de fatias. Revisão de parâmetros e tempo de aquisição.

E quando estiver satisfeito, pressione OK para iniciar a aquisição. Durante a aquisição, evitar o contato com a mesa em que o microscópio está posicionado. Para avaliar a espessura do estroma e da camada de Bowman, meça as distâncias dos cortes transversais da córnea.

Por exemplo, adicione cinco pontos igualmente espaçados na seção transversal, conforme descrito no manuscrito de texto. Desenhe uma linha entre dois pontos de distância conhecida de acordo com o campo de visão padrão. Em seguida, vá para a guia Analisar e selecione Definir escala.

Insira a distância conhecida e a unidade de comprimento nos campos apropriados. Defina em 1024 pixels ou 780 micrômetros e clique em OK. Desenhe uma linha entre dois pontos de distância desconhecida e leia o comprimento ou a distância medida diretamente da barra de status. Registre a média e o coeficiente de variação.

Clique na guia Imagem e selecione Reslice Z em Pilhas para determinar a densidade de queratinócitos. Isso somará as imagens estromais em face em grupos de sete para produzir cortes de espessura comparável. Para análise posterior, incluir todos os cortes disponíveis na face para o estroma anterior, 15 imagens para o estroma anterior, cinco imagens para o estroma médio e cinco imagens para o estroma posterior.

Em cada imagem voltada, selecione uma região de interesse de 300 por 300 micrômetros. Para melhorar a visualização do núcleo, inverta a imagem usando Inverter na guia Editar. Ajuste o contraste e o brilho clicando na guia Imagem e navegando até Brilho-Contraste.

Para contar manualmente os núcleos das células, vá para Plug-ins e navegue até Contador de células na guia Analisar. Pressione Inicializar e selecione um tipo de contador. Em seguida, conte os núcleos celulares clicando em feições ovais escuras na imagem invertida, considerando aquelas que pousam em uma borda de imagem apenas para dois dos quatro lados da imagem.

A córnea doadora humana selecionada estava inchada após o armazenamento em meio de cultura de órgãos, dando um modelo fisiopatológico da córnea edematosa e impedindo a aquisição de imagens através de toda a espessura corneana devido à profundidade limitada de penetração. A transferência para o meio de cultura de órgãos suplementado com dextrina, reduziu o inchaço e resultou em córneas doadoras de espessura normal. As córneas doentes foram reconhecidas por alterações morfológicas e características estromais típicas, incluindo uma diminuição na espessura variável do estroma ou na camada de Bowman.

A avaliação da densidade de queratinócitos e da refletividade estromal auxiliou ainda mais na análise histológica e diferenciação de tecidos corneanos normais de patológicos com microscopia de coerência óptica de campo total, o que está além das capacidades dos sistemas clínicos de tomografia de coerência óptica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar análises qualitativas e quantitativas semelhantes à histologia do estroma corneano, permitindo a diferenciação da doença dos tecidos normais da córnea humana.