Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave em biologia celular e bioquímica, como a forma como a montagem dinâmica de proteínas e complexos de proteínas controla as vias de sinalização e o comportamento celular. A principal vantagem dessa técnica é que podemos isolar especificamente duas proteínas que interagem, excluindo proteínas individuais não complexadas e parceiros de ligação concorrentes. Embora usemos esse método para fornecer informações sobre a dimerização receptiva da tirosina quinase no câncer de mama, ele também pode ser aplicado a qualquer outro ambiente fisiológico ou doença.

Tivemos uma ideia para esse método quando percebemos que o nanocorpo GFP reconhecia o epítopo tridimensional de GFP e outras proteínas fluorescentes. Para começar, adicione 150 nanogramas de vetor de entrada, 150 nanogramas de vetor de destino e oito microlitros de tampão TE a um tubo de 0,2 mililitro. Em seguida, adicione dois microlitros de recombinase e ZiMex e centrifugue os dois brevemente.

Incube a reação por uma hora em temperatura ambiente, adicione um microlitro de solução de proteinase K e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos para interromper a reação. Em seguida, descongele as células competentes ao choque térmico no gelo. E transfira 50 microlitros das células para um tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mililitros.

Adicione um microlitro de produto de reação às células e misture delicadamente. Incube as células por 20 minutos no gelo. Em seguida, choque térmico das células em um banho-maria de 42 graus Celsius por 45 segundos antes de retornar as células ao gelo.

Adicione um mililitro de meio LB às células. E incube a amostra com agitação por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, coloque a transformação em uma placa de ágar de 10 centímetros com ampicilina e incube a 37 graus Celsius durante a noite.

Para iniciar a purificação do plasmídeo, adicione ampicilina e 100 mililitros de meio LB a um grande frasco cônico. Em seguida, use um loop de inoculação para remover uma única colônia da placa de ágar. Mergulhe a alça de inoculação em meio LB e misture brevemente, cubra a parte superior do frasco com papel alumínio e incube-o durante a noite, a 37 graus Celsius com agitação.

A partir daqui, purifique o DNA do plasmídeo usando um kit de purificação de DNA de plasmídeo Maxiprep padrão, antes de prosseguir com a transfecção. Primeiro, semeie células HEK 293T em placas de 10 centímetros, contendo 10 mililitros de DMEM. Em seguida, dilua 2,5 microgramas de cada vetor de complementação de fluorescência bimolecular em 500 microlitros de tampão de transfecção.

Adicione 10 microlitros do reagente de transfecção e vortex a mistura por 10 segundos. Em seguida, centrifugue brevemente as amostras e incube-as em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione a mistura de transfecção de DNA gota a gota ao prato.

Em seguida, incube as amostras por oito a 24 horas. Prepare um tampão de lise celular e um tampão de lise celular suplementado conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, lave as células com PBS gelado duas vezes.

Aspire o PBS e adicione um milímetro de tampão de lise celular suplementado com gelo. Em seguida, coloque o prato no gelo e incube por cinco minutos. Em seguida, use um raspador de células para remover as células e transfira-as para um tubo de microcentrífuga resfriado.

Centrifugue o tubo a 18.000 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius, para remover os detritos celulares e, em seguida, transfira o sobrenadante transparente para um novo tubo de microcentrífuga. Lave um volume apropriado de contas de agarose em um mililitro de PBS, centrifugue as contas a 300 vezes a gravidade e remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 20 microlitros de contas de agarose a cada amostra.

E incubar a quatro graus Celsius por duas horas, com rotação de ponta a ponta. Centrifugue os grânulos a 300 vezes a gravidade e lave-os no tampão de lise celular três vezes. Em seguida, ressuspenda os grânulos lavados em 50 microlitros de tampão de amostra diluído.

Finalmente, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por dois a três minutos. Neste estudo, o método BiCAP é usado para observar uma interação positiva para vários tipos de proteínas aproximadamente 16 horas após a co-transfecção de HEK293T células. A microscopia confocal é usada para observar a dimerização do RTKERBB2 na membrana plasmática e a ligação da ubiquitina à E3 ligase UBR5.

Após a purificação de afinidade com o nanocorpo GFB, apenas a proteína de controle de Vênus de comprimento total e as proteínas marcadas com V1 e V2 interagindo podem ser detectadas na amostra de co-transfecção. Ao tentar este procedimento, lembre-se de otimizar o posicionamento da etiqueta de complementação de fluorescência bimolecular e a extremidade C-terminal ou N-terminal de sua proteína de interesse. Isso é necessário para observar uma interação proteína/proteína positiva.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a técnica BiCAP e como aplicá-la à sua interação proteica de interesse. Seguindo este procedimento, muitas das técnicas de caracterização a jusante podem ser empregadas, como o ChIPseek para responder a perguntas adicionais, como a dimerização dos fatores de transcrição controla a ligação ao DNA.