Name: Ácido graxo 13C Isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda o perfil de isotopólogos de ácidos graxos para estudar a transferência trófica de carbono e o metabolismo lipídico em consumidores invertebrados do solo. Este método revela interações alimentares em ecossistemas crípticos.

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O apoio financeiro da R. Menzel e L. Ruess pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) é reconhecido com gratidão. R. Nehring foi financiado por RU 780/10-1. Finalmente, somos extremamente gratos ao Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke para revisão de nosso manuscrito.

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Isotopólogo de perfil
Uma análise detalhada dos aspectos quantitativos em distribuição de 13C no FAs precisa de tecnologia de ponta para atribuir carbono particionamento em teias alimentares. O presente trabalho empregado Isotopólogo de criação de perfil para avaliar a 13C /12C rácios em comuns biomarcadores de FA para interações tropicais. Esse método é bem estabelecido para a análise de aminoácidos por cromatografia líquida (LC-MS) e foi apli...

Em um habitat enigmático como o solo, relações tróficas são difíceis de abordar e são ainda mais restritos pelo pequeno tamanho da fauna. A última década viu avanços na ecologia bioquímica, particularmente no uso de ácidos graxos como biomarcadores para definição de estratégias de alimentação da fauna de solo sob condições de campo a1,2,3. Isto é baseado no fato de que ácidos graxos de recursos podem ser incorporados no tecido do consumidor como moléculas inteiras, um processo denominado de roteamento dietético4. Transferência de ácidos graxos relatou sobre três níveis tróficos, ou seja, dos fungos para nematoides de Collembola5. Recentemente, a fauna predatória considerou-se6,7 e os primeiro comentários sobre os ácidos graxos como marcadores tróficas em solo tróficas foram publicadas8,9.
Informações mais detalhadas sobre interações tróficas são alcançadas por ácido graxo isótopo estável sondagem (FA-SIP). A determinação de 13C /12C rácios em ácidos graxos em dietas e os consumidores podem atribuem links binário e estimam o fluxo de carbono associado e tem sido empregados em terrestre, água doce e marinhos tróficas10,11 ,12,13. O pressuposto básico é que a dietéticos roteado os ácidos graxos não são sujeitas a processos enzimáticos; Portanto, seus 13C sinal, ou seja, a 13C /12C relação do ácido gordo, em que o consumidor é semelhante ao que na dieta1. No entanto, um empobrecimento gradual da assinatura 13C a cadeia alimentar tem sido relatado em sistemas aquáticos, dificultando, assim, ampla aplicação da FA-SIP em estudos trófica14,15,16. Além disso, o conhecimento no metabolismo lipídico na maioria dos invertebrados terrestres teias alimentares é ainda limitado.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. Com isto em mente, 13C-Isotopólogo de criação de perfil, que em princípio pode ser aplicado para investigação do metabolismo carbono de qualquer sistema biológico17, é um método promissor. Após a introdução de um substrato de carbono marcado com 13, a distribuição dos 13C na rede metabólica é rastreável desde os produtos metabólicos gerados no show do consumidor uma distribuição específica de Isotopólogo. Isto pode ser avaliado por espectroscopia de ressonância metabólica nuclear quantitativa18,19 ou20,espectrometria de massa21, com as último favorecido em amostras biológicas com baixa biomassa devido à sua maior sensibilidade.
Embora Isotopólogo de criação de perfil foi com êxito aplicada aos aminoácidos e forneceu insights sobre o metabolismo de carbono na vivo de patógenos bacterianos17,22,23, sua implementação em gordos ácidos já ficou para trás. A primeira análise detalhada sobre o destino de um isótopo estável rotulados precursor de ácidos gordos, sua dieta roteamento ou degradação através da β-oxidação, em consumidores de invertebrados de solo, foi recentemente realizada por Menzel et al 24. aqui, os princípios metodológicos para experiências de incorporação com 13C rotulados de ácidos graxos, seguidos de análise Isotopólogo de chaves descendentes em invertebrados de solo frequentes, o Collembola, são fornecidos. Estas variedade é um grupo de modelo bom como eles formam componentes importantes do solo comida web são bem investigado por seus marcador trófica ácidos graxos8,25.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. O presente protocolo dá o projeto e configurar para um laboratório de experimento e os processos bioquímicos de extração e metilação de frações de lipídios dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) de alimentação de Collembola. Ele demonstra como a Isotopólogo a composição de ácidos graxos é analisada por espectrometria de massa e descreve a fórmula relacionada e cálculos. Este procedimento resulta em: (i) os rácios de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular do ácido graxo M+) por uma ou mais massa unidades (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.) e (ii) total 13 C enriquecimento em ácidos graxos derivado o precursor rotulados de 13C. Embora usado para Collembola, esta abordagem geralmente pode ser aplicada a qualquer outra interação predador-presa na premissa de que estes são viáveis em quantidade suficiente sob condições controladas para garantir uma absorção bem sucedido rótulo e subsequente verificação.

<table><tbody><tr><td>NeoLab-Frascos redondos</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm, 10 pacs/pacote</td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a., pó, CAS No. 7440-44-0</td></tr><tr><td>Alabaster Dental</td><td>R&Ouml; HRICH-GIPSE</td><td>---</td><td>http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>P717.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td>HPLC &ge; 98 %</td></tr><tr><td>terc-Butil metil éter (MTBE)</td><td>Carl Roth</td><td>T175.1</td><td>HPLC &ge; 99,5 % </td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>7328.2</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth</td><td>6771.1</td><td>p.a. &ge; 99 %, em pellets</td></tr><tr><td>di-Natriumhydrogenphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>p.a. &ge; 99%,</td></tr> livre <tr><td>de água Na-dihidrogenfosfato Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>T879.1</td><td>p.a. &ge; 99 %</td></tr><tr><td>Ácido hipoclórico (6 N)</td><td>VWR International</td><td>26.115.000</td><td>AVS TITRINORM vol. solução</td></tr><tr><td>Bond Elut (Colunas)</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK</td></tr><tr><td>Pr&auml; paratengl&auml; ser Duran</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>135215</td><td>&Oslash; 16 x 100 mm, mais tampa de rosca com recartilhado e junta integrada de PTFE/silicone</td></tr><tr><td>Supelco 37 Component FAME Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/mL em cloreto de metileno, padrão analítico</td></tr><tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>Malha de polipropileno, aproximadamente 0,3 mm de espessura, com espaçamento de fio de 1 mm</td></tr><tr><td>Mistura de Éster Metílico de Ácido Bacteriano (BAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/mL em caproato de metila, padrão analítico</td></tr><tr><td>Nonadecanoato de metila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>padrão analítico &ge; 98,0 %</td></tr><tr><td>Ácido hexadecanóico-1-13C (Palmítico)</td><td>Larodan Fine Chemicals</td><td>78-1600</td><td>GC &ge; 98,0 % (13C: 99,0%)</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>Concentrador</td></tr> <tr><td>midi de bancada compactoAlpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>Coletor de secagem</td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>Bomba de vácuo</td></tr><tr><td>Roto-Shake Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>Dispositivo combinado de balanço e rotação</td></tr><tr><td>XP64 Micro Comparador</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Balança de alta precisão</td></tr><tr><td>GC-System 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Cromatógrafo gasoso</td></tr><tr><td>7000 GC/MS Triple Quad</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Espectrômetro de massa triplo</td></tr><tr><td>Quad Série 7683B Injetor</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Injetor de amostra</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Centrífuga com rotor de tubo de 10 ml</td></tr></tbody></table>

Ácido graxo 13c isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Ácidos graxos (FAs) são úteis biomarcadores em ecologia alimentar da web porque eles são normalmente assimilados como uma molécula completa e transferidos para o tecido do consumidor com menor ou nenhuma modificação, permitindo o roteamento dietética entre diferentes níveis tróficos. No entanto, a abordagem de marcador trófica FA ainda é dificultada pelo conhecimento limitado no metabolismo lipídico da fauna do solo. Este estudo utilizou inteiramente rotulado ácido palmítico (13C16:0, 99% de átomo) como marcador no ácido graxo vias de metabolismo de dois generalizada do solo Collembola, Protaphorura fimata e Heteromurus nitidus. Para investigar o destino e modificações metabólicas deste precursor, é apresentado um método de criação de perfil Isotopólogo, realizada por espectrometria de massa usando o único íon monitoramento. Além disso, o montante laboratório experiência de alimentação é descrito, bem como a extração e a metilação de fracções lipídicas dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) e a fórmula relacionada e cálculos. Isotopólogo de perfil não só rendimento o enriquecimento global de 13C em ácidos graxos derivado a 13C rotulado precursor mas também produz o padrão de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular de FA M+) de cada rotulado FA por uma ou mais unidades de massa (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.). Este conhecimento permite conclusões sobre o rácio de roteamento dietético de um FA inteiramente consumido em comparação com a biossíntese de novo . Isotopólogo perfil é sugerido como uma ferramenta útil para a avaliação do metabolismo de ácidos graxos em animais de solo de desvencilhar interações tróficas.

Índice de peso e lipídios fresco de Collembola Durante o experimento descrito, o conteúdo em NLFAs e PLFAs não mudou significativamente ao longo do tempo, Considerando que o peso fresco de espécimes aumentou ligeiramente, mas não significativamente24. Ambos os parâmetros indicam um bom nível de aptidão física dos espécimes Collembola. Estar ciente para investigar peso e lipídios índice fresco do Collembola durante todo o experimento corresponden...

A abordagem de marcador trófica de ácido graxo, ou seja, a assimilação dos ácidos graxos como molécula inteira e transferência em tecido de consumidor com n ou menor modificação, é dificultado por lacunas de conhecimento no metabolismo de ácidos graxos de invertebrados de solo pequeno. Isotopólogo de criação de perfil é fornecida como uma valiosa ferramenta de desvencilhar interações tróficas.

Ácido graxo 13C Isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

O objetivo geral deste perfil isotopologue é acompanhar a transferência trófica de ácidos graxos dietéticos em consumidores de invertebrados, incluindo seu processamento e metabolismo lipídico, como alongamento da cadeia ou oxidação beta. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na ecologia da teia alimentar, como quem está comendo quem, uma pergunta difícil de responder em um ecossistema críptico, como o solo. Demonstrando a técnica estará Dilara Simsek, aluna de mestrado do laboratório da professora Liliane Ruess.Para preparar microcosmos de plástico com tampas bem ajustadas, em um pote de gesso, misture nove partes de gesso de Paris e uma parte de carvão ativado seco. Adicione 10 partes de água destilada e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente sem mexer por cinco minutos. Use uma colher de laboratório para mexer a mistura no sentido horário em velocidade moderada para evitar bolhas de ar até obter uma consistência espessa e ensopada.Em seguida, despeje a mistura nos microcosmos a uma altura de cerca de um centímetro. Alise o gesso batendo suavemente na bancada e girando. Observe que buracos de bolhas de ar e sulcos, adicionados com uma espátula estéril,

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Bioquímica

Profiling isotópica estável por análise de massa de gás cromatografia espectrometria de fluxo metabólico intermediário é descrito no...

Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo demonstrará a extração e análise de ácidos graxos bioativos livres e esterificados das células. Os ácidos graxos são quantificados com precisão usando diluição de isótopos estáveis, cromatografia líquida quiral, espectrometria de massa de monitoramento de reações múltiplas de ionização química atmosférica de captura de elétrons (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

Nós apresentamos robustos métodos bioquímicos e microscópicos para...

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Tegumento dos mamíferos contém lipídios solventes extraível que podem fornecer composições química característica de espécies individuais. Este trabalho apresenta um método de rotina para separar classes de lipídios amplas isoladas de tecidos tegumentar utilizando cromatografia em camada delgada e determinar o perfil triacilglicerídeos pelo laser de dessorção / espectrometria de massa por ionização assistida por matriz de tempo de vôo.

Perfil dos Conteúdos triacilglicerídeos em Bat Tegumentar Lipídeos por cromatografia em camada delgada preparativa e MALDI-TOF Espectrometria de Massa

ácidos graxos de fosfolipídios fornecer informações sobre a estrutura das comunidades microbianas do solo. Apresenta-se métodos para a extracção de amostras de solo com uma mistura de fase única de clorofórmio, fraccionamento de lípidos extraídos, utilizando colunas de extracção em fase sólida, e a metanólise para produzir ésteres de metilo de ácidos gordos, que são analisadas por cromatografia de gás capilar.

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

O peixe-zebra está emergindo como um modelo valioso de processamento de lipídios na dieta e doenças metabólicas. São descritos protocolos de alimentação de larvas ricas em lipídios, imagens ao vivo de análogos lipídicos fluorescentes da dieta e quantificação da ingestão de alimentos. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma variedade de técnicas de triagem, imagem e investigação orientada por hipóteses.

Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

O artigo descreve um método que aumenta o rendimento enquanto equilibra esforço e precisão para a extração de lipídios das membranas celulares de microorganismos para uso na caracterização de lipídios totais e abundância relativa de lípidos indicadores para determinar a estrutura da comunidade microbiana do solo em estudos com muitas amostras.

Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

Aqui, de alta resolução de 1 H e 13 C de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi usada como uma ferramenta rápido e fiável para a análise quantitativa e qualitativa dos suplementos de óleo de peixe encapsulado.

Espectroscopia de RMN como uma ferramenta robusta para a avaliação rápida do perfil lipídico do óleo de peixes suplementa

Este protocolo é para a determinação de lipídios na água do mar e espécimes biológicos. Lipídios em filtrados são extraídos com clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol no caso de sólidos. As classes lipídicas são medidas pela cromatografia de camada fina da haste com detecção de ionização de chamas e sua soma dá o teor lipíduo total.

Determinação de Aulas De Lipídios e Lipídios Totais em Amostras Marinhas

Apresentamos um método quantitativo de baixo custo utilizando óxido de deutério e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) para a análise da lipogênese de novo de ácidos graxos totais em tecido adiposo marrom in vivo.

Determinação quantitativa da síntese de novos ácidos graxos em tecido adiposo marrom utilizando óxido de deutério

Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.

Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

Aprenda o perfil de isotopólogos de ácidos graxos para estudar a transferência trófica de carbono e o metabolismo lipídico em consumidores invertebrados do solo. Este método revela interações alimentares em ecossistemas crípticos.

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