Name: Ácido graxo 13C Isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda o perfil de isotopólogos de ácidos graxos para estudar a transferência trófica de carbono e o metabolismo lipídico em consumidores invertebrados do solo. Este método revela interações alimentares em ecossistemas crípticos.

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O apoio financeiro da R. Menzel e L. Ruess pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) é reconhecido com gratidão. R. Nehring foi financiado por RU 780/10-1. Finalmente, somos extremamente gratos ao Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke para revisão de nosso manuscrito.

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Isotopólogo de perfil
Uma análise detalhada dos aspectos quantitativos em distribuição de 13C no FAs precisa de tecnologia de ponta para atribuir carbono particionamento em teias alimentares. O presente trabalho empregado Isotopólogo de criação de perfil para avaliar a 13C /12C rácios em comuns biomarcadores de FA para interações tropicais. Esse método é bem estabelecido para a análise de aminoácidos por cromatografia líquida (LC-MS) e foi apli...

Em um habitat enigmático como o solo, relações tróficas são difíceis de abordar e são ainda mais restritos pelo pequeno tamanho da fauna. A última década viu avanços na ecologia bioquímica, particularmente no uso de ácidos graxos como biomarcadores para definição de estratégias de alimentação da fauna de solo sob condições de campo a1,2,3. Isto é baseado no fato de que ácidos graxos de recursos podem ser incorporados no tecido do consumidor como moléculas inteiras, um processo denominado de roteamento dietético4. Transferência de ácidos graxos relatou sobre três níveis tróficos, ou seja, dos fungos para nematoides de Collembola5. Recentemente, a fauna predatória considerou-se6,7 e os primeiro comentários sobre os ácidos graxos como marcadores tróficas em solo tróficas foram publicadas8,9.
Informações mais detalhadas sobre interações tróficas são alcançadas por ácido graxo isótopo estável sondagem (FA-SIP). A determinação de 13C /12C rácios em ácidos graxos em dietas e os consumidores podem atribuem links binário e estimam o fluxo de carbono associado e tem sido empregados em terrestre, água doce e marinhos tróficas10,11 ,12,13. O pressuposto básico é que a dietéticos roteado os ácidos graxos não são sujeitas a processos enzimáticos; Portanto, seus 13C sinal, ou seja, a 13C /12C relação do ácido gordo, em que o consumidor é semelhante ao que na dieta1. No entanto, um empobrecimento gradual da assinatura 13C a cadeia alimentar tem sido relatado em sistemas aquáticos, dificultando, assim, ampla aplicação da FA-SIP em estudos trófica14,15,16. Além disso, o conhecimento no metabolismo lipídico na maioria dos invertebrados terrestres teias alimentares é ainda limitado.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. Com isto em mente, 13C-Isotopólogo de criação de perfil, que em princípio pode ser aplicado para investigação do metabolismo carbono de qualquer sistema biológico17, é um método promissor. Após a introdução de um substrato de carbono marcado com 13, a distribuição dos 13C na rede metabólica é rastreável desde os produtos metabólicos gerados no show do consumidor uma distribuição específica de Isotopólogo. Isto pode ser avaliado por espectroscopia de ressonância metabólica nuclear quantitativa18,19 ou20,espectrometria de massa21, com as último favorecido em amostras biológicas com baixa biomassa devido à sua maior sensibilidade.
Embora Isotopólogo de criação de perfil foi com êxito aplicada aos aminoácidos e forneceu insights sobre o metabolismo de carbono na vivo de patógenos bacterianos17,22,23, sua implementação em gordos ácidos já ficou para trás. A primeira análise detalhada sobre o destino de um isótopo estável rotulados precursor de ácidos gordos, sua dieta roteamento ou degradação através da β-oxidação, em consumidores de invertebrados de solo, foi recentemente realizada por Menzel et al 24. aqui, os princípios metodológicos para experiências de incorporação com 13C rotulados de ácidos graxos, seguidos de análise Isotopólogo de chaves descendentes em invertebrados de solo frequentes, o Collembola, são fornecidos. Estas variedade é um grupo de modelo bom como eles formam componentes importantes do solo comida web são bem investigado por seus marcador trófica ácidos graxos8,25.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. O presente protocolo dá o projeto e configurar para um laboratório de experimento e os processos bioquímicos de extração e metilação de frações de lipídios dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) de alimentação de Collembola. Ele demonstra como a Isotopólogo a composição de ácidos graxos é analisada por espectrometria de massa e descreve a fórmula relacionada e cálculos. Este procedimento resulta em: (i) os rácios de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular do ácido graxo M+) por uma ou mais massa unidades (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.) e (ii) total 13 C enriquecimento em ácidos graxos derivado o precursor rotulados de 13C. Embora usado para Collembola, esta abordagem geralmente pode ser aplicada a qualquer outra interação predador-presa na premissa de que estes são viáveis em quantidade suficiente sob condições controladas para garantir uma absorção bem sucedido rótulo e subsequente verificação.

<table><tbody><tr><td>NeoLab-Frascos redondos</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm, 10 pacs/pacote</td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a., pó, CAS No. 7440-44-0</td></tr><tr><td>Alabaster Dental</td><td>R&Ouml; HRICH-GIPSE</td><td>---</td><td>http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>P717.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td>HPLC &ge; 98 %</td></tr><tr><td>terc-Butil metil éter (MTBE)</td><td>Carl Roth</td><td>T175.1</td><td>HPLC &ge; 99,5 % </td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>7328.2</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth</td><td>6771.1</td><td>p.a. &ge; 99 %, em pellets</td></tr><tr><td>di-Natriumhydrogenphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>p.a. &ge; 99%,</td></tr> livre <tr><td>de água Na-dihidrogenfosfato Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>T879.1</td><td>p.a. &ge; 99 %</td></tr><tr><td>Ácido hipoclórico (6 N)</td><td>VWR International</td><td>26.115.000</td><td>AVS TITRINORM vol. solução</td></tr><tr><td>Bond Elut (Colunas)</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK</td></tr><tr><td>Pr&auml; paratengl&auml; ser Duran</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>135215</td><td>&Oslash; 16 x 100 mm, mais tampa de rosca com recartilhado e junta integrada de PTFE/silicone</td></tr><tr><td>Supelco 37 Component FAME Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/mL em cloreto de metileno, padrão analítico</td></tr><tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>Malha de polipropileno, aproximadamente 0,3 mm de espessura, com espaçamento de fio de 1 mm</td></tr><tr><td>Mistura de Éster Metílico de Ácido Bacteriano (BAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/mL em caproato de metila, padrão analítico</td></tr><tr><td>Nonadecanoato de metila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>padrão analítico &ge; 98,0 %</td></tr><tr><td>Ácido hexadecanóico-1-13C (Palmítico)</td><td>Larodan Fine Chemicals</td><td>78-1600</td><td>GC &ge; 98,0 % (13C: 99,0%)</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>Concentrador</td></tr> <tr><td>midi de bancada compactoAlpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>Coletor de secagem</td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>Bomba de vácuo</td></tr><tr><td>Roto-Shake Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>Dispositivo combinado de balanço e rotação</td></tr><tr><td>XP64 Micro Comparador</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Balança de alta precisão</td></tr><tr><td>GC-System 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Cromatógrafo gasoso</td></tr><tr><td>7000 GC/MS Triple Quad</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Espectrômetro de massa triplo</td></tr><tr><td>Quad Série 7683B Injetor</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Injetor de amostra</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Centrífuga com rotor de tubo de 10 ml</td></tr></tbody></table>

Ácido graxo 13c isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Ácidos graxos (FAs) são úteis biomarcadores em ecologia alimentar da web porque eles são normalmente assimilados como uma molécula completa e transferidos para o tecido do consumidor com menor ou nenhuma modificação, permitindo o roteamento dietética entre diferentes níveis tróficos. No entanto, a abordagem de marcador trófica FA ainda é dificultada pelo conhecimento limitado no metabolismo lipídico da fauna do solo. Este estudo utilizou inteiramente rotulado ácido palmítico (13C16:0, 99% de átomo) como marcador no ácido graxo vias de metabolismo de dois generalizada do solo Collembola, Protaphorura fimata e Heteromurus nitidus. Para investigar o destino e modificações metabólicas deste precursor, é apresentado um método de criação de perfil Isotopólogo, realizada por espectrometria de massa usando o único íon monitoramento. Além disso, o montante laboratório experiência de alimentação é descrito, bem como a extração e a metilação de fracções lipídicas dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) e a fórmula relacionada e cálculos. Isotopólogo de perfil não só rendimento o enriquecimento global de 13C em ácidos graxos derivado a 13C rotulado precursor mas também produz o padrão de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular de FA M+) de cada rotulado FA por uma ou mais unidades de massa (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.). Este conhecimento permite conclusões sobre o rácio de roteamento dietético de um FA inteiramente consumido em comparação com a biossíntese de novo . Isotopólogo perfil é sugerido como uma ferramenta útil para a avaliação do metabolismo de ácidos graxos em animais de solo de desvencilhar interações tróficas.

Índice de peso e lipídios fresco de Collembola Durante o experimento descrito, o conteúdo em NLFAs e PLFAs não mudou significativamente ao longo do tempo, Considerando que o peso fresco de espécimes aumentou ligeiramente, mas não significativamente24. Ambos os parâmetros indicam um bom nível de aptidão física dos espécimes Collembola. Estar ciente para investigar peso e lipídios índice fresco do Collembola durante todo o experimento corresponden...

A abordagem de marcador trófica de ácido graxo, ou seja, a assimilação dos ácidos graxos como molécula inteira e transferência em tecido de consumidor com n ou menor modificação, é dificultado por lacunas de conhecimento no metabolismo de ácidos graxos de invertebrados de solo pequeno. Isotopólogo de criação de perfil é fornecida como uma valiosa ferramenta de desvencilhar interações tróficas.

Ácido graxo 13C Isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

O objetivo geral deste perfil isotopologue é acompanhar a transferência trófica de ácidos graxos dietéticos em consumidores de invertebrados, incluindo seu processamento e metabolismo lipídico, como alongamento da cadeia ou oxidação beta. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na ecologia da teia alimentar, como quem está comendo quem, uma pergunta difícil de responder em um ecossistema críptico, como o solo. Demonstrando a técnica estará Dilara Simsek, aluna de mestrado do laboratório da professora Liliane Ruess.Para preparar microcosmos de plástico com tampas bem ajustadas, em um pote de gesso, misture nove partes de gesso de Paris e uma parte de carvão ativado seco. Adicione 10 partes de água destilada e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente sem mexer por cinco minutos. Use uma colher de laboratório para mexer a mistura no sentido horário em velocidade moderada para evitar bolhas de ar até obter uma consistência espessa e ensopada.Em seguida, despeje a mistura nos microcosmos a uma altura de cerca de um centímetro. Alise o gesso batendo suavemente na bancada e girando. Observe que buracos de bolhas de ar e sulcos, adicionados com uma espátula estéril, podem encorajar Collembola fértil a botar ovos lá.No entanto, este estudo evitou buracos e sulcos em favor de ter as mesmas condições reprodutíveis. Depois de deixar os microcosmos secarem e depois umedecê-los, use um tubo de sucção equipado com um pequeno pedaço de malha para transferir 30 Collembola recém-eclodidos para a base de gesso dos microcosmos. Forneça cerca de uma ponta de faca de fermento de padeiro seco granulado como alimento e renove-o pelo menos duas vezes por semana.Planeje três réplicas independentes por dia de amostragem. Neste estudo, foram amostrados os dias zero a sete e 14. Incube os microcosmos no escuro a 15 graus Celsius e mantenha uma temperatura constante, pois os ácidos graxos são alterados pelo metabolismo animal para atender aos requisitos de fluidez da membrana.Para colher os animais, logo após a pesagem de acordo com o protocolo de texto, transfira cuidadosamente os animais das panelas da balança para tubos de ensaio de vidro de 10 mililitros. Use um mililitro de metanol de grau HPLC para encher os tubos e armazene-os a 20 graus Celsius negativos até a análise. Depois de preparar três tubos de ensaio de vidro para cada lote de amostras e reduzir o metanol aplicado às amostras para armazenamento, adicione cinco mililitros de solvente de extração monofásica a cada amostra, incluindo brancos, e extraia os lipídios do colêmbolo à temperatura ambiente agitando a 200 rpm durante a noite.Depois de extrair as amostras de acordo com o protocolo de texto, para realizar a análise do padrão de ácidos graxos, pré-condicione uma coluna de ácido de sílica para cada amostra, adicionando dois mililitros de clorofórmio a cada coluna. Depois que o clorofórmio passar pelas colunas, use uma pipeta de vidro Pasteur para remover a fase inferior do clorofórmio das amostras. Em seguida, transfira-o para uma coluna individual.Use cinco mililitros de clorofórmio para eluir os lipídios neutros, ou NLFAs, em frações em recipientes de vidro individuais. Em seguida, use 10 mililitros de acetona para eluir os glicolipídios e cinco mililitros de metanol para eluir os ácidos graxos fosfolipídicos, ou PLFAs. Após a extração, transfira os tubos abertos NLFA e PLFA para um concentrador de vácuo rotacional, ou RVC, e evapore as amostras a 60 graus Celsius em um vácuo de 24 hPa por aproximadamente 90 minutos ou até secar.Depois de isolar e lavar os ésteres metílicos de ácidos graxos, ou FAMEs, use uma pipeta de vidro Pasteur para transferir a fase superior contendo lipídios para um frasco de amostra de cromatografia de vidro equipado com um septo de Teflon. Encapsular o frasco para injetáveis e conservá-lo a 20 graus Celsius negativos até à análise. Para identificar FAMEs em amostras NFLA e PLFA, em um GC-FID, configure uma sequência com o respectivo software do instrumento de acordo com as instruções do fabricante.Iniciar a sequência com as misturas-padrão externas, seguidas das amostras. Haverá um ligeiro atraso no tempo de eluição dos ácidos graxos da coluna GC a cada corrida. Inclua um padrão a cada 10 execuções na sequência de amostra ou use o bloqueio de tempo de retenção para ácido palmítico.Defina o programa e calcule o nmol de ácido graxo de acordo com o protocolo de texto. Para realizar a análise de carbono-13 por perfil isotopologue, use uma coluna capilar polar, pois permite ainda a separação de ácidos graxos insaturados, mesmo com o mesmo número de ligações duplas. A escolha da coluna GC é fundamental para os resultados, pois determina uma boa representação do íon molécula nos ácidos graxos.Para uma coluna DB-23, inicie a temperatura do forno a 130 graus Celsius e aumente-a em 6.5 graus Celsius por minuto para 170 graus Celsius. Siga com um aumento de três graus Celsius por minuto para 203 graus Celsius e segure por 1,9 minutos. Em seguida, prossiga com um aumento de 40 graus Celsius por minuto para 230 graus Celsius e mantenha pressionado por 8.3 minutos.Defina a temperatura da linha de transferência para 280 graus Celsius. Depois de concluir a configuração do programa de acordo com o protocolo de texto, determine a incorporação de carbono-13 no íon molecular de ácidos graxos, executando primeiro uma varredura inicial para ver o que está presente. Em seguida, execute o monitoramento de íons selecionados, ou SIM, nos íons apropriados e adquira dados em massas moleculares de interesse selecionando janelas de varredura m / z ou grupos SIM, abrangendo o tempo de pico cromatográfico do respectivo ácido graxo.Normalmente, monitore dois a quatro íons por analito e janela de tempo. Para o desenvolvimento em massa, usamos contagens totais de íons com padrões externos de ácidos graxos. Com base em seu tempo de retenção e íons de fragmento, os segmentos de tempo são escolhidos.Detecte o íon molecular, M mais, do respectivo ácido graxo e todos os seus isotopólogos, M mais um, M mais dois, etc. Atribua o fluxo trófico de carbono, a posição de incorporação de carbono-13 e calcule o enriquecimento de carbono-13 de acordo com o protocolo de texto. Esta figura apresenta um espectro SIM-MS de ácido palmítico puro de 16 a zero.A abundância natural de carbono-13 neste composto torna-se detectável pela presença de M mais um e M mais dois isotopólogos, além do íon molecular M mais. Em comparação, este espectrograma representa todo o ácido palmítico marcado. Aqui, a única ocorrência do íon M mais 16 reflete a alta pureza do composto marcado sinteticamente.As varreduras SIM a seguir são derivadas de quatro ácidos graxos dominantes na fração PLFA de Heteromurus nitidus no primeiro dia de amostragem após a rotulagem. A assimilação da molécula marcadora marcada no ácido palmítico torna-se visível pela abundância do isotopólogo M mais 16, pois representa todo o ácido graxo marcado. Além disso, pode ser atribuída uma dessaturação de 16 a zero ou alongamento mais dessaturação.Assim, a detecção de isotopólogos maiores que M mais 16, por exemplo, M mais 17 e M mais 18, demonstra o alongamento da cadeia do precursor marcado 16 a zero pelo uso de fragmentos C2-13. Apresentadas aqui, estão as porções relativas dos íons M mais um a M mais três e M mais 16 a M mais 20 dos cinco NLFA e PLFA mais fortemente rotulados de Protaphorura fimata, estimados no dia zero e no dia um. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os consumidores compreendem naturalmente certos isótopos C.Esta quantidade deve ser determinada em experiências de controlo sem dieta a marca. Este certo sinal C natural é subtraído como plano de fundo dos modelos de rótulo. Não se esqueça de que trabalhar com solvente pode ser extremamente perigoso e precauções devem ser tomadas.

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Biochemistry

Bioquímica

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