Name: Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a isolar e cultivar microglia de roedores em meio livre de soro, preservando a morfologia ramificada e a viabilidade celular. Este método permite estudar interações da microglia no SNC.

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Este trabalho foi apoiado pelo Christopher e Dana Reeve Foundation International Research Consortium na lesão da medula espinhal, o Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, Fundação JPB, o Instituto Novartis de pesquisas básicas, contribuições generosas de Vincent e Stella Coates e o Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Todos os procedimentos envolvendo roedores em conformidade com as diretrizes da Universidade de Stanford, que estejam em conformidade com políticas e leis estaduais e nacional. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo painel administrativo da Universidade de Stanford no cuidado do Animal de laboratório.
Nota: Todas as composições de buffer e solução são fornecidas na Tabela de materiais.
1. preparar um prato de Petri para Immunopanning CD11b (dia 0)
Nota: Prepare 1 prato de immunopanning para cada cérebro de rato juvenil de 1-2.
<ol><li>Adicione 25 mL de solução de Tris pH 9,5 de 50 mM para uma placa de Petri 15 cm.</li>
	<li>Adicione o anti-rato de cabra IgG (correntes de H + L) para o prato para uma concentração final de 6 µ g/mL. Redemoinho-placa para distribuir uniformemente.</li>
	<li>Incubar o prato para 1-3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Pratos de lavar três vezes com DPBS ++ (fosfato salino (PBS) com Ca2 + e Mg2 +), em seguida, substituir com uma solução de tampão contendo 1 µ g/mL OX42 anticorpo de garimpar. Deixe os pratos durante a noite em temperatura ambiente sobre uma superfície plana.</li>
</ol>2. tecido coleção (dia 1)
Nota: Este protocolo deve tomar ~ 3-4 h.
<ol><li>Antes de começar, certifique-se de todas as soluções são estéreis e refrigerados no gelo. Relaxa todos os instrumentos no gelo e esterilizar com etanol antes de usar.</li>
	<li>Seguintes procedimentos regulamentares adequados, sacrificar um rato de laboratório juvenil por asfixia de dióxido de carbono. Nota: Como alternativa, animais mais jovens podem ser sacrificados com uma dose letal de cetamina/xilazina (100-200 µ l de 24mg/mL cetamina, xilazina 2,4 mg/mL). Xilazina/cetamina deve ser usada se os animais são menos de 14 dias de idade. Se usar vários animais, extrair o tecido de um animal e colocá-lo em pre-refrigerados DPBS ++ no gelo antes de prosseguir para animais subsequentes.</li>
	<li>Beliscar um hindpaw e assegurar a completa apatia do animal antes de prosseguir.</li>
	<li>Transcardially perfundir o animal com 10-30 mL de tampão de perfusão gelada usando uma agulha de 27½-G até o tampão funciona claro. Nota: O Volume da reserva de perfusão pode variar dependendo da tamanho/idade do animal.</li>
	<li>Imediatamente após a perfusão remova a cabeça do animal. Vindo da medula espinhal, corte o côndilo occipital de cada lado com uma tesoura de dissecação, tenha cuidado para não danificar o cérebro. Após o corte cada lado corte cuidadosamente, por um lado, ao longo do parietal e osso frontal para o osso nasal. Com pinça puxe o topo do crânio, rapidamente Retire cuidadosamente o cérebro (ou estruturas de CNS de interesse) e coloque no pre-refrigerados DPBS ++ no gelo.</li>
	<li>Repita para todos os restantes animais. Nota: Todas as etapas do processo devem ser realizadas em uma capa de fluxo laminar, sob condições estéreis.</li>
</ol>3. mecânica dissociação (dia 1)
<ol><li>Depois que todos os cérebros foram recolhidos, cortar um cérebro em pedaços de3 de 1 mm em um prato de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi frio e transferir para um homogenizador homogenizacao gelada com 5-7 mL de tampão de douncing gelada. Dissocia um cérebro de cada vez.</li>
	<li>Dissocia o tecido através de movimentos de suaves e incompletos de 10-20 com um homogeneizador de homogenizacao folgadas. Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogenizador, mas em vez disso, impel o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogenizador.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Permitir que pedaços de tecido mal dissociada a ajustar-se ao fundo o homogenizador e transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico refrigerado 50 mL.</li>
	<li>Substituir o volume removido com buffer de douncing fresco e repita as etapas de 3.2 e 3.3, para um total de 3-4 rodadas, ou até que todo o tecido tem sido dissociado. Repita o procedimento para cada cérebro.</li>
</ol>4. a mielina remoção (dia 1)
Nota: Remoção de mielina é usada para a isolação de micróglia de animais mais velhos que P12.
<ol><li>Medir o volume da suspensão celular no tubo cónico de 50 mL com uma pipeta de 25 mL e, em seguida, adicione douncing gelada buffer para ajustar o volume total de 33,5 mL.</li>
	<li>Adicione 10 mL de tampão de separação de mielina (MSB) para a suspensão de células e misture cuidadosamente o tubo várias vezes por inversão. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta. Nota: A centrífuga deve tomar aproximadamente 1.5-2 min para desacelerar. Isso irá gerar uma camada superior de mielina e restos de células mortas, um sobrenadante um pouco turva e uma menor pelota que é enriquecida por células vivas.</li>
	<li>Remova a camada superior da mielina/detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir como muito do que é removido quanto possível.</li>
	<li>Ressuspender as células em 12 mL de tampão de garimpar. Delicadamente, Triture a suspensão de eritrócitos para quebrar qualquer aglomerados de células que possam permanecer.</li>
</ol>5. Immunopanning (dia 1)
<ol><li>Passe a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm para remover detritos grandes ou aglomerados de células.</li>
	<li>Enxague o prato panning revestido OX42 três vezes com DPBS ++. Não permitir que a placa completamente seco entre lavagens.</li>
	<li>Deite fora a última lavagem DPBS ++ e aplicar a suspensão de células filtrada para o prato de panning. Suavemente agitar a placa para distribuir as células e, em seguida, incubar a placa sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 min permitir que as células a aderir. Não incubar mais do que 20 min ou células se tornará muito difícil recuperar do prato.</li>
	<li>Enxague o prato panning com DPBS ++ 10 vezes para remover as células não-aderentes. Microglia será tão firmemente ligado à placa, agite a placa com cada enxágue para assegurar a remoção de outras células não-aderentes.</li>
	<li>Deite fora a última lavagem DPBS ++ e substitua com 15 mL DPBS ++ e 200 tripsina μL (1,25% solução estoque).</li>
	<li>Incube o prato para ≤ 10 min a 37 ° C, com 10% de CO2 para trypsinize. Nota: Não faça mais do que 10 min ou micróglia se tornará difícil de remover.</li>
	<li>Após 10 min de tripsinização, microglia ainda vai ser preso à placa. Decantar a tripsina/DPBS ++ e lave suavemente 2x com DPBS ++ para remover a tripsina, substituir com 12 mL de meio de crescimento microglia gelada (MGM).</li>
	<li>Garimpando o prato no gelo por 2 min para ajudar a enfraquecer a interação célula/substrato e certifique-se o prato é plana para evitar áreas do prato panning sequem.</li>
	<li>Pipetar vigorosamente com um 10 mL pipeta e pipeta controlador de alta velocidade para recuperar células do prato panning. Desenhe uma grade de 16 x 16 com o fluxo do líquido da pipeta para tentar remover todas as células.</li>
	<li>Verifique as células sob um microscópio ampliação de 20 X para certificar-se de células têm separada da placa. Marca pontos em cima do prato onde as células ainda estão presos e repetição de pipetagem nessas áreas.</li>
	<li>Recolha a suspensão de células e alíquota 3-4 mL do sobrenadante por tubo cônico de 15 mL. Rotação por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta. Nota: Microglia através de um pequeno volume de giro permite a máxima recuperação das células.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mL da MGM com o centrifugado.</li>
	<li>Cada Ressuspender em MGM restante e as células de todos os tubos da piscina.</li>
	<li>Contar as células com hemocytometer.</li>
	<li>Células de placa conforme descrito nos passos 6 - 7, dependendo da aplicação.</li>
	<li>Células de cultura a 37 ° C, com 10% de CO2. Nota: As células podem ser cultura para até 3-4 semanas com mudanças regulares de mídia ou uma semana sem alterações de mídia.</li>
</ol>6. lugar revestimento placas de cultura de tecidos/lamelas (dia 1)
<ol><li>Placa de 15 µ l de revestimento de colagénio IV directamente no centro de uma placa de cultura de tecido revestido 24-bem aniônicos catiônicos (consulte Tabela de materiais para obter detalhes) e incube por 15 min a 37 ° C, com 10% de CO2.</li>
	<li>Depois de contar células com hemocytometer dilua as células para 2.3 x 105/mL, no MGM. Aspire o colagénio IV spot e imediatamente placa 15 µ l de suspensão de células para este ponto; Isto dará 3.5 x 103 células/spot. Incube durante 5-10 min a 37 ° C, com 10% de CO2 para permitir que as células aderem, adicionar 500 µ l de CO2 -equilibrado meio de crescimento TGF-β2/IL-34/colesterol contendo (TIC) suavemente para o poço.</li>
	<li>Se chapeamento em lamelas, primeiro casaco lamelas de vidro estéril com 10 µ g/mL estratagema-D-lisina (PDL) em H2O por 1h no RT, lavar 3 vezes com H2O e deixe secar em um capuz sob luz UV. Uma vez que as lamelas são secas, prossiga com chapeamento local sobre as lamelas conforme descrito no passo 6.2.</li>
</ol>7. chapeamento para isolamento de RNA/proteína
<ol><li>No dia 1, casaco, toda a área de uma 24-bem aniônicos/catiônica revestido com placa de cultura de tecido com revestimento de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C, com 10% de CO2, retire e imediatamente placa 3-5 x 104 células/poço em CO2 incubado Mídia TIC.</li>
	<li>No dia 2, realizar uma alteração de mídia de 50% para cada um bem no dia após o preparo. Células mortas tendem a cluster no centro do poço, então assumo o mídia.</li>
	<li>Realizar uma alteração de mídia de 50% a cada 2-3 dias para manter as culturas. Se alterações mídia introduzirem uma variável indesejada para as culturas, as células podem sobreviver por cerca de 1 semana sem qualquer alteração de mídia, em oposição a mais de 3 semanas com uma manutenção regular.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Porque microglia servem como as células imunes Sentinela do SNC, eles são altamente sensíveis às mudanças ambientais; Portanto, muito cuidado é necessário para minimizar as respostas inflamatórias dentro das células durante seu isolamento e cultura8. Isso é feito no presente protocolo através de velocidade e temperatura. Sempre que possível reduz a ativação, para que todas as etapas de centrifugação ocorrem a 4 ° C, mantendo as células no gelo ou a 4 ° C, os animais são pintados com buffer de perf...

Como os macrófagos do parênquima CNS, microglia interagir com uma vasta gama de circuitos neuronais e gliais redes de sinalização. Eles desempenham um papel vital no desenvolvimento e na homeostase do cérebro através de poda sináptica, afastamento de célula apoptótica e transitórias interações com processos neuronais1,2. Microglia são primeiros respondentes a lesões neurológicas, estendendo seus processos longos e finos para sites de lesão para coordenar as respostas inflamatórias e limitar o sangramento3,4. Alterações na função e morfologia microglial são onipresentes em lesões de CNS agudas e crônicas, e microglia exposição alterou a expressão de mediadores inflamatórios em uma variada gama de Estados de doença1, localização e morfologia. Estudos de genéticos humanos indicam que mutações que alteram o risco para doenças neurodegenerativas são frequentemente predominantemente ou exclusivamente expressa pela micróglia no SNC intacta, apontando para um papel crucial para microglia na patogênese da doença ou progressão5 . Dada sua proeminência em ferimentos e doenças, promover a compreensão da biologia microglial é uma alta prioridade para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.
Muitos avanços importantes para a compreensão da biologia microglial surgiram extrapolando as técnicas e mecanismos descobertos em estudos de outras populações de macrófagos, incluindo métodos de cultura, perfis de expressão de gene e definições de funcional / morfológica dos Estados. Embora generalizada macrófago funções muitas vezes jogar em formas surpreendentes dentro da paisagem do CNS, microglia são eles próprios altamente especializado, exibindo uma morfologia ramificada e uma assinatura de expressão de gene único que os distingue de outros tecidos os macrófagos6. Microglia tem uma linhagem que é diferente da maioria dos outros macrófagos de tecido; Eles colonizam o CNS durante uma onda de embrionária precoce da hematopoiese primitivo e auto renovam ao longo da vida, independente de contribuições de hematopoiese definitivo7. A assinatura de expressão de gene totalmente maduro do adulto microglia não é alcançada até a segunda semana pós-parto8. Dicas ambientais no tecido circundante desempenham um papel importante em ditar o macrófago tecido-específica características6, que no SNC inclui limitada exposição a fatores transmitidas pelo sangue, concedido pelo barreira hemato - encefálica,9.
Um obstáculo para compreender plenamente microglial contribuições para a homeostase do CNS e doença é a dificuldade de sintetizando as propriedades especializadas do maduro microglia visto na vivo com células purificadas in vitro. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para isolar e cultura microglia intacta, mas a maioria das abordagens dependem de soro para apoiar a sobrevivência da pilha. Mostramos que além de soro, que é um reagente inerentemente variável que contém uma vasta gama de moléculas bioativas, é especialmente problemática quando trabalhar com microglia porque promove uma morfologia ameboide, aumentou a proliferação, e aumento da fagocitose9 muitas vezes visto em vivo quando microglia são expostas ao sangue a cargo de fatores após o rompimento da barreira do sangue - cérebro. Por essas métricas, células expostas ao soro se assemelham a micróglia em lesões ou doenças, mas tais alterações são reduzidas quando microglia são cultivadas em meio de crescimento definidos contendo CSF-1 (ou IL-34), TGF-β, colesterol e Selenito.
Este protocolo fornece detalhes sobre cultivo microglia juvenil rato sob condições isento de soro, relacionadas com o trabalho recentemente publicado9. Este protocolo foi racionalizado para ratos de pós-Natal dia 21-30 (P21 - P30), mas pode ser adaptado para isolar microglia de ratos e camundongos, de qualquer idade, embora o rendimento e a viabilidade global irão variar dependendo da espécie e idade do animal. Máximo rendimento e viabilidade ideal é alcançada quando usando um pouco imaturo microglia (~ P9), com rendimentos e viabilidade gradualmente afilado, um pouco mais baixos níveis em animais adultos. Microglia também pode ser isolado de ratos, mas achamos que pilhas do rato mostram significativamente mais elevados rendimentos, viabilidade e complexidade de morfologias ramificadas, quando comparado com as pilhas do rato em culturas isento de soro. Animais com idade superior a P50 não foram avaliadas com este protocolo. Este procedimento de isolamento de immunopanning foi otimizado para minimizar as alterações nos perfis transcriptional microglial durante o isolamento e para maximizar a jusante viabilidade das células. Usando estas técnicas e formulações de mídia, alta-viabilidade culturas primárias podem ser sustentadas por semanas. Microglia cultivada sob essas condições apresentam uma morfologia altamente ramificada envolvendo rápida extensão e retração dos processos e relativamente baixas taxas de proliferação. Podemos destacar a importância do soro-exposição sobre essas propriedades e discutir os pontos fortes e fraquezas deste método em relação a outras abordagens.

<table><tbody><tr><td>Rato: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>camundongo anti-rato CD11b monoclonal (clone OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panning: 1:1.000; Coloração: 1:500</td></tr><tr><td>Cabra policolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Coloração: 1:500</td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Coloração: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Coloração: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-cabra 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Coloração: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Coloração: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergente na coloração ICC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfato</td><td>Galen Suprimentos de Laboratório Cat</td><td># GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptona de sólidos do leite</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol de lã ovina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calceína AM corante</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/ Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glicose alta)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina&nbsp;</td><td>Placas Primaria Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes de stock&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Reconstituição: 10 mg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:100 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td></td><td></td><td>Reconstituição: 5 mg/mL em H2O Concentração utilizada: 1:1.000 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Reconstituição do selenito</td><td></td><td></td> de sódio<td>: 2,5 mg/mL em H2O Concentração utilizada: 1:25,000 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Reconstituição do Colágeno IV</td><td></td><td></td><td>: 200 &mu; g/mL em PBS Concentração usada: 1:100 Armazenamento: -80&deg; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstituição: 2 mg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:1.000 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstituição: 200 &mu; g/mL em PBS Concentração usada: 1:1.000 Armazenamento: -80&deg; C</td></tr><tr>Colesterol <td></td><td></td><td>de lã ovina</td><td>Reconstituição: 1,5 mg/mL em etanol 100% Concentração utilizada: 1:1,000 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr>Sulfato <td></td><td></td><td>de heparano</td><td>Reconstituição: 1 mg/mL em H2O Concentração utilizada: 1:1.000 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Ácido oleico/ácido</td><td></td><td></td> gondóico <td>Reconstituição: Gondóico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL em 100% de etanol Concentração usada: 1:1.000 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Reconstituição da heparina</td><td></td><td></td><td>: 50 mg/mL em PBS Concentração utilizada: 1:100 Armazenamento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; Receita de</td> tampão <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de <td>perfusão</td><td>: 50 &mu; g/mL de heparina em DPBS++ (PBS com Ca++ e Mg+) Comentários: Use quando gelado</td></tr><tr><td>Receita de tampão</td><td></td><td></td> de doucamento<td>: 200 &mu; L de 0,4% DNaseI em 50 mL de DPBS++ Comentários: Use quando estiver gelado</td></tr><tr><td>Receita de tampão</td><td></td><td></td> panorâmico<td>: 2 mg/mL de peptona de sólidos do leite em DPBS++</td></tr><tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td><td>Receita: DMEM/F12 contendo 100 unidades/mL de penicilina, 100 &mu; g/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 &mu; g/mL de N-acetilcisteína, 5 &mu; g/mL de insulina, 100 &mu; g/mL de apo-transferrina e 100 ng/mL de selenito de sódio Comentários: Use MGM gelado para retirar a microglia do prato de immnopanning.</td></tr><tr><td>Receita de revestimento</td><td></td><td></td> de colágeno IV<td>: MGM contendo 2 &mu; g / mL de colágeno IV</td></tr><tr><td>Receita de tampão</td><td></td><td></td> de separação de mielina<td>: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sem Ca ++ e Mg ++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2 Comentários: Misture bem após a adição de&nbsp; CaCl2 e MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Meios de crescimento contendo colesterol (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Receita: MGM contendo 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 &mu; g/mL de colesterol de lã ovina, 10 &mu; g / mL de sulfato de heparano, 0,1 &mu; g/ml de ácido oleico e 0,001 &mu; g/ml de ácido gondóico Comentários: Certifique-se de adicionar colesterol ao meio aquecido a 37 &deg; C e não adicione mais de 1,5 &mu; g/mL ou precipitará. Não filtre meios que contenham colesterol. Equilibre o meio TIC com 10% de CO2 por 30 min- 1 hora antes de adicionar às células para garantir o pH ideal.</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de roedor microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia representam 5-10% de todas as células do sistema nervoso central (SNC) e são cada vez mais atenção devido a suas contribuições durante o desenvolvimento, homeostase e doença. Embora os macrófagos têm sido estudados em detalhe por décadas, recursos especializados de micróglia, os macrófagos de tecido-residente do SNC, mantiveram-se em grande parte misteriosa, em parte devido às limitações na habilidade de recapitular microglial maduro Propriedades em cultura. Aqui, podemos ilustrar um procedimento simples para o isolamento rápido de puro microglia no cérebro de roedor maduro. Descrevemos também condições de cultura livre de soro que suportam níveis elevados de microglial viabilidade ao longo do tempo. Microglia cultivada sob essas condições definidas e médias apresentam elaborados processos ramificados e comportamento dinâmico de vigilância. Podemos ilustrar alguns efeitos de exposição de soro na microglia culta e discutir como essas culturas isento de soro comparam com culturas expostas ao soro, bem como micróglia em vivo.

Este protocolo descreve um método de cultura alta pureza ramificada microglia de ratos jovens. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando animais imaturos, perinatais e adultos, como discutido abaixo. Desde que os isolamentos de célula frequentemente incluem nuances sutis e muitas oportunidades para as células a morrer, usamos pontos de verificação de controle de qualidade para ajudar a determinar o sucesso em várias etapas. Nós normalmente monitorados suspensões celulares usando um ...

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

O objetivo geral deste protocolo de cultura de células é gerar culturas altamente puras de micróglia de roedores adultos ou em desenvolvimento que podem ser mantidas sem exposição ao soro. Este procedimento pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência relacionadas à morfologia da microglia, cetose fibrosa e interação da microglia com outros tipos de células do SNC. A principal vantagem deste protocolo é que a microglia pode ser rapidamente isolada do tecido de roedores de qualquer idade e cultivada sem exposição ao soro.Para remover o cérebro, corte o côndilo occipital da medula espinhal de um animal em ambos os lados com uma tesoura de dissecação, tomando cuidado para não danificar o cérebro. Em seguida, corte a pele ao longo da parte superior do crânio e corte um lado ao longo do osso parietal e frontal em direção ao osso nasal. Puxe cuidadosamente a parte superior do crânio com uma pinça, remova rapidamente o cérebro e coloque-o em DPBS pré-resfriado no gelo.Repita o procedimento para todos os animais restantes. Depois que os cérebros forem coletados em DPBS frio, pique cada cérebro em pedaços de um milímetro cúbico em uma placa de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi fria e transfira para um homogeneizador de dounce gelado com cinco a sete mililitros de tampão de dobramento gelado. Em seguida, use um homogeneizador dounce solto para dissociar o tecido com 10 a 20 movimentos suaves e incompletos.Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogeneizador. Em vez disso, impulsione o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogeneizador. É importante homogeneizar lentamente o tecido com várias rodadas de duplicação para preservar a viabilidade da microglia.Depois, remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Deixar que os pedaços de tecido mal dissociados se depositem no fundo do homogeneizador e transferir o sobrenadante para um novo tubo cónico de 50 mililitros refrigerado. Em seguida, substitua o volume removido por um novo tampão duplo e repita o procedimento de dissociação por um total de três a quatro rodadas, ou até que todo o tecido tenha sido dissociado.Neste procedimento, adicione tampão de duchas gelado ao tubo cônico de 50 mililitros contendo a suspensão celular e ajuste o volume total para 33,5 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de MSB à suspensão celular e misture bem invertendo o tubo várias vezes. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mililitros.Depois disso, centrifugue as células por 15 minutos a 500 x g a 4 graus Celsius com frenagem lenta. Em seguida, remova a camada superior de mielina e detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir que o máximo possível seja removido.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 12 mililitros de tampão panorâmico. Triture suavemente a suspensão celular para quebrar quaisquer aglomerados de células restantes. Nesta etapa, passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 micrômetros para remover grandes detritos ou aglomerados de células.Enxágue o prato panorâmico revestido OX42 três vezes com DPBS. Não deixe a placa secar completamente entre as lavagens. Despeje a última lavagem do DPBS e aplique a suspensão de células filtradas no prato panorâmico.Gire suavemente a placa para distribuir as células. Em seguida, incube a placa em uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 minutos para permitir que as células adiram. Não incube por mais de 20 minutos ou as células se tornarão muito difíceis de recuperar do prato.Depois, lave o prato panorâmico com DPBS 10 vezes para remover as células não aderentes. A microglia ficará firmemente presa à placa, portanto, gire a placa a cada enxágue para garantir a remoção de outras células não aderentes. Despeje a última lavagem do DPBS e substitua por 15 mililitros de DPBS e 200 microlitros de tripsina.Para tripsinizar as células, incube o prato por menos ou igual a 10 minutos a 37 graus Celsius. Após 10 minutos de tripsinização, a microglia ainda estará presa à placa. Despeje a mistura e lave suavemente a placa duas vezes com DPBS para remover a tripsina.Em seguida, substitua por 12 mililitros de MGM gelado. Em seguida, coloque o prato panorâmico no gelo por dois minutos para ajudar a enfraquecer a interação celular e substrato e certifique-se de que o prato esteja plano para evitar que as áreas do prato sequem. Depois disso, pipete vigorosamente com uma pipeta de 10 mililitros e controlador de pipeta em alta velocidade para recuperar as células do prato panorâmico.Desenhe uma grade de 16 por 16 com o fluxo de líquido da pipeta para tentar remover todas as células. É importante encontrar um equilíbrio entre a recuperação celular geral e a saúde de sua cultura. A pipetagem repetida do sobrenadante celular contra a placa panorâmica resultará na redução da viabilidade de sua cultura.Verifique as células ao microscópio com ampliação de 20x para certificar-se de que elas se desprenderam da placa. Marque os pontos no topo do prato onde as células estão presas e repita a pipetagem nessas áreas. Recolher a suspensão celular e atribuir três a quatro mililitros de sobrenadante em cada tubo cónico de 15 mililitros.Gire-o por 15 minutos a 500 x g a quatro graus Celsius com frenagem lenta. Após 15 minutos, aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mililitros de MGM com o pellet celular. Em seguida, ressuspenda cada pellet no MGM restante e puxe as células de todos os tubos.Em seguida, conte as células com um hemocitômetro. Agora, coloque 15 microlitros de revestimento de colágeno IV diretamente no centro de uma placa de cultura de tecidos com revestimento catiônico aniônico de 24 poços e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Depois de contar as células com um hemocitômetro, dilua-as para 2,3 x 10 elevado a cinco por mililitro em MGM.Aspire o ponto de colágeno IV e imediatamente coloque 15 microlitros de suspensão celular neste local para produzir 3,5 x 10 para as três células por ponto. Em seguida, incube por cinco a dez minutos a 37 graus Celsius para permitir que as células adiram. Em seguida, adicione suavemente 500 microlitros de TIC equilibrado com CO2 ao poço.Se estiver chapeando lamínulas, primeiro cubra as lamínulas de vidro estéril com 10 microgramas por mililitro PDL em água por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave-os três vezes com água e deixe-os secar em um capuz sob luz ultravioleta antes de prosseguir com o revestimento localizado nas lamínulas. A fim de demonstrar o isolamento e a cultura bem-sucedidos de microglia altamente pura, isolamos a microglia de ratos P21 e cultivamos essas células em TIC ou TIC suplementado com 10% FCS por oito dias.As células foram então fixadas e coradas com marcadores microgliais e marcadores de proliferação. As células cultivadas em TIC mostram uma morfologia ramificada, baixos níveis de proliferação e expressão de marcadores de microglia. Em comparação, as células cultivadas em TIC suplementadas com 10% FCS também coraram para marcadores microgliais, mas mostram altos níveis de proliferação e morfologia amebóide, propriedades frequentemente observadas na microglia ativada.Além da coloração para marcadores celulares, o RNA-Seq em células recém-isoladas pode fornecer uma ferramenta poderosa e sensível para avaliar o perfil de RNA das células e pode ajudar a informar a pureza inicial das culturas. O micropanning de CD11b geralmente resulta em uma pequena porcentagem de neutrófilos CD11b positivos e transferência de monócitos, além de microglia CD11b positiva. Essas células morrerão no TIC após alguns dias, mas podem complicar a análise de pontos de tempo anteriores.Aqui está um filme de lapso de tempo da microglia de rato P21 após 14 DIV em TIC. Após duas semanas, as culturas livres de soro mostram comportamento de vigilância dinâmico com rápidas extensões de processo e retrações em todo o prato. Aqui está um filme de lapso de tempo da microglia de rato P21 após cinco DIV em TIC antes e depois da exposição ao soro fetal de bezerro.Uma rápida mudança morfológica é evidente após a exposição sérica. Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em quatro a cinco horas, se executado corretamente. Após este procedimento, outros ensaios para monitorar fagocitose, quimiotaxia, sobrevivência, liberação de citocinas, respostas transcricionais a estímulos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a função da micróglia.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como isolar rapidamente a microglia do tecido de roedores adultos e cultivá-los em condições livres de soro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Este vídeo demonstra um método para isolar e cultivar microglia de cérebros de ratos. Envolve a separação da microglia de outras células neuronais e não neuronais usando placas revestidas com um anticorpo monoclonal específico para a microglia.

Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

Este vídeo demonstra uma técnica para a remoção seletiva da microglia de uma cultura neuronal primária de rato. Os neurônios do grânulo cerebelar são tratados com um antimetabólito para eliminar as células gliais em proliferação. Além disso, eles são tratados com agentes direcionados ao lisossomo para esgotar a micróglia da cultura.

Remoção seletiva de microglia de uma cultura de neurônios de grânulos cerebelares de rato

Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.

Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos

Aprenda a isolar e cultivar microglia de roedores em meio livre de soro, preservando a morfologia ramificada e a viabilidade celular. Este método permite estudar interações da microglia no SNC.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

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