Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS
8 de maio de 2018
Aqui, apresentamos duas novas metodologias, psPACT e mPACT, para alcançar a máxima transparência óptica e posterior análise microscópica da vascularização do tecido no roedor intacta toda CNS.
O objetivo geral desses métodos psPACT e mPACT é a limpeza rápida de todo o tecido do SNC sem a necessidade de um sistema de limpeza eletroforético do tecido. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do modelo de pesquisa de doenças humanas, como doença de Alzheimer ou lesão e degeneração e tumorigênese. A principal vantagem dessa técnica é que o tecido do SNC do camundongo não é danificado pela limpeza do tecido eletroforético e é rapidamente eliminado pela limpeza passiva modificada.
Tivemos a ideia desse método depois de usar o PACT original e o método anterior para limpeza do cérebro. A demonstração visual desse método é crítica, pois o psPACT e o método mPACT são difíceis de executar porque esse método possui vários estágios de preparação da amostra. Comece preparando a solução de coquetel PACT adicionando pó de VA-044 a uma solução de 4% de PFA e 4% de acrilamida a uma concentração final de 0,25% Depois de perfundir os tecidos com solução de PACT, mergulhe completamente todo o cérebro e a medula espinhal em um tubo de 50 mililitros contendo solução PACT gelada e armazene a quatro graus Celsius por 24 horas.
24 horas depois, transfira o tecido para um tubo de 50 mililitros contendo solução PACT fresca e fria e conecte a tampa do tubo a um sistema de hibridização de gel de tecido, conectado a um tanque de nitrogênio e ajustado para 37 graus Celsius. Em seguida, ligue o vácuo e o gás por 10 minutos para incorporar a amostra em gás nitrogênio. Para polimerizar o hidrogel, coloque o tubo contendo a amostra em uma incubadora agitada ajustada para 150 rpm e 37 graus Celsius por três horas ou até que a polimerização esteja completa.
Após a incubação, use papel absorvente para remover o hidrogel polimerizado restante ao redor dos tecidos. Em seguida, transfira o tecido para um tubo de 50 mililitros contendo solução de limpeza. Coloque a amostra em uma incubadora agitada ajustada para 37 graus Celsius e 150 rpm até que o tecido tenha sido limpo.
Em média, leva cerca de 20 dias para o SNC do camundongo atingir a clareza total. Comece o psPACT com o SNC de um camundongo perfundido com 4% de PFA que foi pós-fixado em 4% de PFA a quatro graus Celsius por 24 horas. Lave o tecido fixo por uma hora em PBS 0,1 molar.
Após a lavagem, transfira o tecido para a solução A4P0 e incube a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, após lavar o tecido em PBS por cinco minutos, mergulhe o tecido em 0,25% VA-044 em PBS e incube a 37 graus Celsius por seis a 24 horas. A separação da acrilamida e a etapa subsequente do VA-044 evitam a necessidade de remoção dos monômeros de hidrogel não polimerizados restantes que circundam o tecido, o que pode comprometer a integridade final do tecido após obter transparência com o PACT.
Após a incubação, transfira os tecidos para uma solução fresca e fria de VA-044. Em seguida, embutir a amostra em gás nitrogênio por 10 minutos. Transfira o tecido para a solução de limpeza.
Em seguida, incubar a amostra em uma incubadora agitada ajustada para 37 graus Celsius e 150 rpm até que o tecido tenha sido limpo. Em média, leva aproximadamente 17 dias para o SNC do camundongo atingir a clareza total. Para o mPACT, siga o protocolo para psPACT até a etapa de limpeza da solução.
Em seguida, mergulhe totalmente a solução de limpeza de tecido contendo 0,5% de alfa-tioglicerol, um agente anti-escurecimento, além de 8% de SDS em PBS 0,1 molar. Coloque a amostra em uma incubadora agitada ajustada para 37 graus Celsius e 150 rpm até que o tecido tenha sido limpo. Em média, leva apenas duas semanas para o SNC do camundongo atingir clareza total usando o mPACT.
No presente estudo, as amostras de cérebro de camundongos tratadas pelo protocolo mPACT alcançaram transparência óptica após 14 dias, à frente das amostras tratadas pelos protocolos PACT e psPACT. Amostras inteiras do SNC de ratos limpas por mPACT alcançaram a depuração máxima em 20 dias. Cérebros de ratos adultos sozinhos, ao contrário de todo o SNC, foram eliminados com mPACT em apenas cinco dias.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas semanas com todo o SNC do camundongo, se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência e anatomia explorarem doenças fisiopatológicas, como lesão tecidual, malformações do desenvolvimento, câncer e doenças neurodegenerativas em modelos do SNC de mamíferos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta duas metodologias inovadoras, psPACT e mPACT, para aumentar a transparência óptica e facilitar a análise microscópica da vasculatura do sistema nervoso central (SNC) de roedores intactos. As técnicas visam clarear rapidamente todo o tecido do SNC sem danificá-lo, abordando questões fundamentais relacionadas a modelos de doenças humanas, como a doença de Alzheimer e a tumorigênese.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de clareamento de tecidos
- Imagem microscópica
Contexto
- O estudo baseia-se em métodos anteriores, destacando as limitações do clareamento tecidual eletroforético.
- Enfatiza a necessidade de processos de clareamento rápidos e eficazes para tecido SNC de roedores.
- Oferece soluções tanto para pesquisa básica quanto para implicações clínicas em neurociência.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e validar o psPACT e o mPACT como protocolos eficientes para a clareza de tecidos do SNC.
- Ampliar as capacidades dos pesquisadores que estudam condições neuropatológicas.
- Facilitar uma melhor visualização da vasculatura tecidual no SNC.
Métodos Utilizados
- Os métodos envolvem um protocolo multietapas para preparar e tornar transparente o tecido do SNC usando soluções PACT.
- Os modelos biológicos principais incluem amostras do SNC de camundongo e rato, com foco na obtenção de transparência óptica.
- O psPACT geralmente leva cerca de 20 dias para atingir transparência total, enquanto o mPACT pode alcançar isso em aproximadamente 14 dias.
- Soluções especializadas e ambientes de incubação são empregados para os processos de polimerização e clareamento.
Resultados Principais
- O mPACT oferece uma redução significativa no tempo de clareamento de tecidos em comparação com métodos tradicionais.
- As amostras tratadas com mPACT exibiram transparência óptica em um período mais curto, sugerindo eficiência aprimorada para aplicações de pesquisa.
- As técnicas demonstram-se eficazes em facilitar o estudo de diversas condições neurológicas.
Conclusões
- Este estudo permite a clareação rápida e eficiente de tecidos do SNC, aprimorando as capacidades de pesquisa na área de neurociência.
- As metodologias inovadoras funcionam como ferramentas valiosas para explorar mecanismos de doenças e lesões teciduais.
- As implicações para o entendimento de doenças neurodegenerativas e o aprimoramento de estudos patológicos por meio de técnicas de imagem aperfeiçoadas são substanciais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Métodos passivos de clareamento inovadores, como psPACT e mPACT, solucionam um gargalo crítico no desenvolvimento e pesquisa em neurociência, permitindo a transparência óptica rápida e de alta fidelidade de tecidos do SNC inteiro sem danos eletroforéticos. Essa capacidade sustenta a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em modelos de doenças neurodegenerativas, preservando a arquitetura subcelular enquanto acelera os prazos de imagem. As técnicas aumentam a confiança preditiva em estudos pré-clínicos de modelos de Alzheimer, tumorigênese e lesões por meio da melhoria na visualização de fenótipos neuropatológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em modelos do SNC intactos, preservando estruturas subcelulares e circuitos celulares para estudos de engajamento de alvos.
- Valor Operacional: Reduz artefatos de processamento de tecidos associados à clareamento eletroforético, melhorando a reprodutibilidade dos resultados de triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer leituras mais claras da progressão neurodegenerativa em sistemas relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera preparações padronizadas e transparentes do SNC adequadas para imageamento de alta resolução de biomarcadores subcelulares e modulação de vias.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de equipamentos eletroforéticos especializados, reduzindo as barreiras para a implementação do ensaio entre equipes de descoberta.
- Escalabilidade: O mPACT alcança a clareza do SNC de camundongo em aproximadamente 14 dias, permitindo cronogramas previsíveis para campanhas de triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Facilita a transição suave do descobrimento à validação pré-clínica, mantendo a integridade do tecido para estudos longitudinais de tumorigênese e malformações desenvolvimentais.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a visualização de estruturas subcelulares em tecidos patológicos, reduzindo ambiguidades na interpretação do mecanismo-alvo.
- Fidelidade do Modelo de Doença: Permite o clareamento consistente do SNC em espécies de roedores (camundongo/rato), aprimorando a comparabilidade entre estudos em farmacologia de segurança.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
psPACT e mPACT inserem-se na transição entre descoberta inicial e pré-clínico, apoiando especificamente a validação de alvos até a otimização de compostos líderes, por meio de modelos do SNC quantificáveis e prontos para imageamento.
- Biologia Descoberta: Permite testar hipóteses por meio do mapeamento tridimensional da expressão proteica e distribuição celular em tecido intacto, esclarecendo o envolvimento de vias em modelos de doenças.
- Triagem: Fornece preparações teciduais quantitativas e reprodutíveis que permitem a avaliação padronizada dos efeitos de compostos na arquitetura do SNC.
- Análises: Gera imagens de alta resolução que permitem às equipes comparar alterações estruturais entre diferentes condições de tratamento com melhor relação sinal-ruído.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade proteômica e estrutural desde a descoberta até as fases pré-clínicas, apoiando o alinhamento de biomarcadores em modelos de neurodegeneração e lesão.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de clareamento do SNC reutilizável, aplicável em múltiplos projetos de estudo de neuropatologias, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio da visualização de tecidos intactos.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade ao evitar parâmetros eletroforéticos variáveis e dependências de equipamentos.
- Valor Estratégico: Aperfeiçoa a eficiência na tomada de decisões de avanço ou interrupção ao acelerar a geração de dados pré-clínicos para candidatos direcionados ao SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de neurodegeneração e oncologia por meio de leituras fenotípicas mais rápidas e claras.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em histologia de tecidos, química de hidrogéis e execução de protocolos de incubação para gerenciar a preparação de amostras em múltiplas etapas.
- Depende de incubadoras com agitação, sistemas de gás nitrogênio e ambientes com controle de temperatura para as fases de polimerização e clareamento do hidrogel.
- Necessita padronização entre equipes na preparação de soluções (por exemplo, concentrações de VA-044, SDS) e controles de tempo para garantir reprodutibilidade entre laboratórios.
- A adaptação a tecidos não-CNS (por exemplo, rim, baço) requer validação dos tempos de clareamento e da preservação estrutural, conforme observado no material original.
- Limitação prática: o sucesso do protocolo depende de execução meticulosa devido às múltiplas etapas de preparação, com desvios podendo resultar em clareamento incompleto ou dano ao tecido.
