Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

O objetivo geral deste método é avaliar a atividade de potenciais compostos antifúngicos, utilizando uma modificação do teste de suscetibilidade à microdiluição em caldo, utilizado em laboratórios clínicos. Este método é utilizado para avaliar a atividade fúngica de compostos naturais ou sintéticos, um dos primeiros testes no desenvolvimento de terapias antifúngicas. Fornecemos instruções para uma triagem inicial de novos antifúngicos usando pequenos volumes em um curto espaço de tempo, especialmente se os experimentos forem realizados com automação.

Demonstrando o procedimento estará Daniel Zamith-Miranda, um pós-doutorando em meu laboratório. Comece este procedimento cultivando as cepas de fungos para o ensaio, conforme descrito no protocolo de texto. No dia seguinte, recolher as células centrifugando os tubos cónicos a 1200 G, durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Descarte o sobrenadante, adicione dez mililitros de PBS a cada tubo e ressuspenda as células. Centrifugar novamente a 1200 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Repita a lavagem e centrifugação do PBS mais duas vezes.

Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio RPMI 1640 de dupla resistência. Dependendo da turbidez da suspensão celular, preparar um mililitro de uma diluição de um a 100, ou de um a 1000, de cada cepa, em um tubo de microcentrífuga. Aliquat dez microlitros dessa diluição, coloque-a em uma câmara de hemocitômetro e conte o número total de células nos quatro quadrantes de canto sob o microscópio.

Depois de calcular a densidade de cada suspensão celular, prepare as suspensões de células estoque em meio RPMI 1640 de dupla resistência. Prepare 4.000 células por mililitro para cepas de C. albicans e 20.000 células por mililitro para cepas de C. neoformans. Os peptídeos linfizados são armazenados em aliquats para uso único a menos 20 graus Celsius e apenas dissolvidos em água deionizada antes de cada experimento.

A concentração de peptídeos deve ser o dobro da concentração final mais alta testada no ensaio. Antifúngicos de referência também são preparados. O ensaio antifúngico é realizado em microplacas de poliestireno triplicado e 96 poços.

Usando uma diluição serial de duas vezes de cada peptídeo e controle antifúngico, e um volume final de 50 microlitros por poço. A etapa mais crucial do protocolo são as diluições em série, portanto, tenha muito cuidado durante as próximas etapas para evitar qualquer erro que comprometa toda a sua análise. Usando uma pipeta, adicione 100 microlitros do peptídeo antifúngico na concentração de força dupla da concentração final desejada mais alta nas colunas de um a três na linha A.Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitros de água estéril aos outros poços nas linhas B a H.Remova 50 microlitros dos poços com a concentração mais alta.

Transfira para os poços correspondentes da próxima concentração e homogeneize pipetando para cima e para baixo várias vezes. Repita a diluição seriada até atingir os poços com a menor concentração e descarte 50 microlitros desses poços. Deixe as colunas 11 e 12 das linhas A, B e C com apenas água para controles em branco ou controles de crescimento negativos.

Adicione 50 microlitros do inóculo ajustado de dupla força em meio RPMI 1640 a cada poço das colunas um a três, mais a coluna 11. A concentração final para C. albicans será de 2.000 células por mililitro. A concentração final para C. neoformans será de 10.000 células por mililitro.

Prepare controles de crescimento negativos misturando 50 microlitros de água e 50 microlitros de inóculo ajustado sem o antifúngico. Prepare controles em branco combinando 50 microlitros de água e 50 microlitros de meio sem células. Carregue os controles nos poços apropriados.

Observe todos os poços usando um microscópio óptico invertido e, em seguida, incube as placas a 37 graus com agitação a 200 rpm. Após o período de incubação, observe todos os poços novamente para verificar mudanças na morfologia, bem como para verificar se há sinais de contaminação. Adquira uma imagem de cada placa usando uma câmera digital.

Neste ensaio representativo, três peptídeos antimicrobianos, ou AMPs, com concentrações variando de 100 micromolares a sete oito micromolares, foram avaliados quanto à atividade antifúngica contra C. neoformans. Um controle de crescimento e um branco foram incluídos. Qualquer poço com meio claro semelhante aos poços em branco é considerado um resultado positivo, enquanto qualquer poço com turbidez análoga aos poços de controle de crescimento negativo é considerado negativo.

Como a concentração inibitória mínima, ou CIM, é definida como a menor concentração de composto antimicrobiano que inibe completamente o crescimento visível de fungos no final do período de incubação, 25 micromolares são considerados o CIM para AMP1. E, 12 vírgula cinco micromolar, o MIC para AMP2. O AMP3 terá que ser reavaliado, pois o fungo cresceu em todas as concentrações testadas.

Da mesma forma, três peptídeos distintos testados contra C. albicans, indiciados 50 micromolares é o MIC para AMP1. Seis micromolares é a CIM para AMP2 e 25 micromolares é a CIM para AMP3. Um exemplo de um resultado ruim, provavelmente devido à pipetagem inadequada durante a etapa de diluição, é ilustrado pelas colunas cinco a sete da linha C nesta placa, onde as diferenças no crescimento de C. neoformans estão presentes entre as réplicas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas, mais o tempo de crescimento do fungo, se for realizada corretamente. Lembre-se de estar ciente das características físico-químicas dessas moléculas testadas. Em seguida, use solventes apropriados como controle, caso sejam necessários, e use sempre as células na mesma fase de crescimento.

Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como o ensaio de morte por tempo, o uso de corantes de viabilidade e ensaios ST60 para responder a perguntas adicionais, como se o composto tem um efeito fungicida ou fungistático. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de micrologia médica explorassem diversas fontes de compostos naturais ou sintéticos na busca por compostos antifúngicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como iniciar uma cultura de fungos, preparar células para o ensaio, realizar as diluições em série e ler os resultados após incubar as cepas de fungos com nossos compostos testados.

Não se esqueça de que trabalhar com patógenos fúngicos pode ser extremamente perigoso. E a preparação, como usar equipamento de proteção individual, trabalhar dentro de um capuz de segurança biológica e usar práticas de segurança apropriadas, deve ser tomada durante a execução deste procedimento.