Name: Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda o método de microdiluição em caldo para triagem de compostos antifúngicos naturais ou sintéticos. Esta técnica automatizada permite avaliar rapidamente a atividade antifúngica com pequenos volumes e custo reduzido.

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Agradecemos a CAPES-Brasil, Brasil-CNPq, FAP/DF para apoio financeiro. Nós estamos gratos ao Dr. Hugo Costa Paes para a revisão do manuscrito.

1. soluções e meios de comunicação
<ol><li>Prepare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suporte, tampão fosfato salino (PBS), caldo de Sabouraud dextrose e ágar de Sabouraud dextrose conforme tabela 1.</li>
</ol>2. condições de crescimento do inóculo fúngicas
<ol><li>Armazene todas as estirpes fúngicas como estoques congelados em glicerol de 35% a-80 ° C, até que seja necessário.</li>
	<li>Execute as seguintes etapas antes de cada experimento.<ol>
<li>Por cepas de Candida albicans :<ol>
<li>Descongelar um frasco de estoque e transferir 200 µ l a 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo de polipropileno estéril 50 mL com tampa e cultura durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm). Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração da cultura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para cepas de Cryptococcus neoformans :<ol>
<li>Raspe a superfície congelada de um frasco de estoque. As células em placas de ágar Sabouraud dextrose da placa e incubar durante 48 h a 30 ° C. Depois visível crescimento de colônias isoladas, manter as placas no frigorífico (4 ° C) selado com película de parafina para até 15 dias.</li>
			<li>Recolher uma colônia isolada de médio porte da placa usando um palito estéril ou ansa inoculando estéril e inocular 10 mL de caldo de Sabouraud dextrose em um tubo cônico estéril 50 mL. Incube durante aproximadamente 24 horas a 30 ° C, sob agitação (200 rpm).</li>
			<li>Não exceda a incubação de 24 h. Lembre-se de inclinar o tubo e deixar a tampa um pouco aberta para melhor aeração. É sempre bom padronizar a fase de crescimento das células antes de cada ensaio, já que este é um fator importante que afecta a resistência antimicrobiana. Nota: Ambos os fungos foram cultivados a 30 ° C, de rápida propagação em nossos experimentos, mas a temperatura pode ser alterada para refletir os objetivos do estudo, o tratamento por exemplo clínico (37 ° C). Mais importante, este tempo de incubação inicial deve ser previamente estabelecido para cada isolado fúngico e mantido ao longo de todos os testes para garantir a reprodutibilidade.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o crescimento de fungos, colete as células por centrifugação dos tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e adicionar 10 mL de PBS.</li>
	<li>Ressuspender as células e centrifugar novamente a 1.200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repeti a lavagem PBS e centrifugação mais duas vezes. Após a terceira lavagem, Ressuspender as células em 5 mL (de acordo com o tamanho da pelota) de 2 X RPMI-1640 médio.</li>
	<li>Prepare-se 1 mL de uma diluição de 1: 100 ou 1:1,000 em um tubo de microcentrifugadora (dependendo da turvação de suspensão de células).</li>
	<li>Alíquota 10 µ l desta diluição, coloque-o em uma câmara de hemocytometer e conte o número total de células nos quadrantes quatro canto sob o microscópio. Calcular a concentração pela fórmula: (total de número de celular/4) x diluição fator x 104 (constante de diluição de câmara).<ol>
<li>Considere uma viabilidade de 100% se condições de viabilidade contagens e crescimento têm sido sistematicamente correlacionadas para o isolado a ser estudado. Nota: A padronização e controle de qualidade das contagens de viabilidade podem ser feitos por trás-chapeamento de acordo com o Comité Europeu de antifúngicos método de concentração inibitória mínima (CIM) teste de susceptibilidade aos antimicrobianos (EUCAST) para leveduras10 .</li>
		<li>Se a correlação de crescimento/viabilidade não foi estabelecida para o isolado sob estudo, medir a viabilidade de fungosa pela contagem de células vivas em um hemocytometer com o auxílio de corantes que cor seletivamente as células mortas, como Floxina B11, trypan azul 12, ou Janus verde13. Use as células fúngicas para este protocolo somente se a viabilidade da população neste momento é de 90% ou acima. Nota: Corantes mortos/vivos podem não funcionar bem com o fungo de escolha. Por favor, teste-os antes de usar. Por exemplo, o corante azul de Tripan não funciona bem com o c. neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois disso, preparar as suspensões celulares em 2 X RPMI-1640 médias (2 X ajustado inóculo em meio RPMI-1640). Para placas de 96 poços, considere um volume de 5 mL por cada placa.<ol>
<li>Para todas as cepas de c. albicans , prepare uma suspensão de célula estoque de 4 x 103 células/mL. Esta concentração é 2x da concentração celular final em cada poço (2 x 103 células/mL).</li>
		<li>Para cepas de c. neoformans , prepare uma estoque cultura de células de 2 x 104 células/mL. Esta concentração é duas vezes a concentração celular final em cada poço (1 x 104 células/mL).</li>
		<li>Para outros fungos, teste com um antifúngico conhecido qual concentração será ideal para o estudo particular em relação ao tempo de incubação. Tempo de duplicação e metabolismo do fungo em consideração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptídeos (agente desconhecido)
<ol><li>Armazenar os peptídeos liofilizados a-20 ° C e dissolvê-los em água desionizada antes de cada experimento. O tempo máximo de armazenamento, uma vez dissolvido em água vai depender da natureza de cada peptídeo.</li>
	<li>Prepare alíquotas de duas vezes a maior concentração final testados no ensaio (2 X). Idealmente, prepare um pequeno número de alíquotas com suficiente peptídeo para uma utilização evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Nota: A escolha da concentração deve ser baseada na literatura e as propriedades do peptide. Recomenda-se iniciar as diluições de série com cerca de 100 µM do peptide e, em seguida, diminuir ou aumentar este intervalo de concentração dependendo dos resultados obtidos.</li>
</ol>4. referência antifúngicos (controles positivos)
<ol><li>Para aqueles diluído em água: preparar uma solução X 2 de maior concentração da análise (ver secção 5: ensaio antifúngicos para as etapas de diluição).<ol>
<li>Por cepas de c. albicans , prepare uma solução de 128 µ g/mL de fluconazol ou 128 µ g/mL de caspofungina. A concentração de placa para ambos será 64 µ g/mL.</li>
		<li>Por cepas de c. neoformans , prepare uma solução de 32 µ g/mL de anfotericina B (solução hidrossolúvel). A concentração de placa será 16 µ g/mL. Nota: Normalmente anfotericina B é diluído em dimetilsulfóxido (DMSO), desde que este antifúngicos é pouco solúvel em água. No entanto, existem preparações hidrossolúveis anfotericina B disponível comercialmente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para antifúngicos diluídos em um solvente orgânico: preparar uma 100 X solução estoque em DMSO e, em seguida, diluir a 10 X na água para uso. Nota: Assim, no poço, a concentração final de DMSO não exceda 1%. Um poço onde o fungo irá crescer em meios contendo 1% DMSO como controle é necessário, dado que alguns fungos não toleram bem esta concentração do solvente. Lembre-se que o DMSO é fotossensível, então cubra o prato com papel alumínio ou coloque-o em uma câmara escura para a duração do período de incubação.</li>
</ol>5. antifúngico ensaio
Nota: Os ensaios In vitro antifungais são executados com base no teste de susceptibilidade de caldo como de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com algumas modificações.
<ol><li>Preparar uma diluição serial dupla de cada peptídeo e antifúngico em microplacas de poliestireno de 96 poços para um volume final de 50 µ l de controle.<ol>
<li>Usando uma pipeta Adicione 100 µ l do peptide/antifúngico na concentração X 2 da mais alta desejada concentração final nas colunas 1-3, em linha A.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicionar 50 µ l de água estéril em outros poços, nas linhas B-H.</li>
		<li>Remover 50 µ l de poços com a maior concentração (linha A), transferir para o próximo bem da próxima concentração (linha B) e homogeneizar.</li>
		<li>Repita os passos acima até o poço com a menor concentração e descartar 50 µ l desta bem (linha H). Deixe colunas 11 e 12 (linhas A, B, C) com água apenas para controle em branco ou controle negativo/crescimento.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l do 2 X inóculo ajustado em meio RPMI-1640 a cada poço (colunas 1-3 plus coluna 11 (controle negativo/crescimento)); a concentração final para c. albicans será 2 x 103 células/mL e a concentração final para cepas de c. neoformans será 104 células/mL.</li>
		<li>Prepare-se controles em branco (50 µ l água + 50 µ l 2 X RPMI-1640 meio sem células) e controle negativo/crescimento (50 µ l água + 50 µ l ajustado inóculo 2 X RPMI-1640 médio sem antifúngico) e carga na placa bem como descrito acima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o procedimento para cada composto a ser testado e o controle de antifúngico escolhido (colunas 4-10). Nota: As diluições de série podem ser feitas verticalmente como o experimento abaixo, ou horizontalmente na placa (ou seja, se o número de diluições de determinado composto/extracto que precisam ser testados é de oito ou mais).<ol>
<li>Se os compostos, referência drogas, ou qualquer dos seus componentes são fotossensíveis, realizar o ensaio em luz reduzida, cobrir as placas com papel alumínio ou coloque em uma câmara escura, durante a incubação do.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Considere as seguintes recomendações opcionais.<ol>
<li>Selo da placa com uma placa de tampa transparente que permite a troca gasosa, como este ajuda a reduzir a evaporação.</li>
		<li>Coloque a placa em uma câmara úmida; Isso também ajudará a reduzir a evaporação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as placas a 37 ° C por 24 h ou 48h para todas as cepas de c. albicans e por 48 h com 200 rpm agitação por c. neoformans. O volume final inferior (100 µ l) garante que não há repercussões ocorre. Nota: Nenhuma diferença significativa foi observada entre as leituras de MIC em 24 h e 48 h para cepas de c. albicans . No entanto, leituras em 48 h são mais fáceis de Visualizar.</li>
	<li>Observe todos os poços, com o auxílio de um microscópio óptico invertido, antes do período de incubação e depois verificar as alterações na morfologia, bem como para verificar se há sinais de contaminação. Nota: As leituras podem ser feitas visualmente e fotografadas no final do experimento. Antes de cada leitura, homogeneizar ligeiramente a placa. As leituras também podem ser realizadas medindo seu OD em 600 nm, se agrupa de célula ou filamentação não são observados.</li>
	<li>Realizar os experimentos que pelo menos três vezes em datas distintas.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
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<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Como testes podem analisar a potencial atividade antifúngica de um alvo composto usando pequenas quantidades do composto e ao mesmo tempo testá-lo em uma gama de concentrações. Nesse sentido, o presente protocolo é recomendado como um primeiro passo na triagem para potenciais novos compostos antifúngicos. O protocolo aqui apresentado é baseado no protocolo M27-A3, inicialmente projetado para auxiliar na seleção da terapia antifúngica em clínicas e pode ser adaptado a uma variedade de novos compostos antifúngicos. Globalm...

Infecções fúngicas tornaram-se uma preocupação médica importante nas últimas décadas, tendo aumentado consideravelmente principalmente devido a um aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, tais como aqueles submetidos a tratamento de câncer e aqueles que vivem com HIV/AIDS ou transplante de órgãos,1,2. No entanto, um conjunto muito limitado de drogas antifúngicas disponíveis e o número crescente de relatórios sobre resistência fúngica-lhes contribuam para os grandes problemas em relação a terapêutica de micoses sistêmicas3.
Uma potencial fonte de novos compostos antifúngicos são peptídeos antimicrobianos (AMPs), pequenos peptídeos catiônicos produzidos por muitos organismos como parte de sua resposta imune inata para infecção4. No entanto, o método de triagem para testar estes compostos contra patógenos fúngicos não é padronizado. Diferentes procedimentos têm sido utilizados para avaliar a atividade antifúngica de AMPs, às vezes para o mesmo modelo microorganismo5,6,7. Essas diferenças e a falta de detalhes em alguns protocolos complicam comparações entre compostos e dificulta a reprodutibilidade.
Uma forma de padronizar os testes de novos candidatos a fármacos é seguir diretrizes usadas para definir a susceptibilidade em ambientes clínicos, tais como o clínico e orientações Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. No entanto, estes testes de sensibilidade antifúngica são demasiado restritivas e não leva em variação de consideração no metabolismo em toda a espécie, como eles foram criados apenas para alguns agentes selecionados. Por exemplo, eles não levam em conta as necessidades metabólicas de leveduras não-fermentação.
Este protocolo permite a avaliação da atividade dos compostos antifúngicos em potencial e é implementado aqui para a procura de peptídeos antifúngicos. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações CLSI M27-A3 com modificações que otimizam a exibição de novos compostos8,9. Estas alterações permitem o uso de pequenas quantidades de composto, variações de temperatura ou inóculo inicial e de diferentes meios de comunicação para o crescimento ideal do pré-teste, enquanto padronizar os resultados com o uso de antifúngicos de referência como controles. Esse método, com o uso de placas de cultura multi bem, torna possível para um grande número de compostos de tela de forma rápida e confiável.
Devido à sua flexibilidade inerente, este protocolo pode ser usado com diferentes classes químicas de compostos e contra outros microorganismos, com algumas adaptações.

<table><tbody><tr><td><forte>Meios e Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio RPMI 1640 com l-glutamina, sem bicarbonato de sódio</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) ácido propano sulfônico (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use para tamponar 2X RPMI meio</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Din&acirc; mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2,7 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM para solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud caldo dextrose</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% para (solu&ccedil; &atilde; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &atilde; o?)</td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td>estéril</td><td>Para dilui&ccedil; &atilde; o das drogas na dilui&ccedil; &atilde; o seriada</td></tr><tr><td>Medicamentos antifúngicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>Plásticos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo</td> <td>cônicoSarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Prato petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório de Solução Estéril</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Use para pipetar as soluções usando o pippet multicanal</td></tr><tr><td>Equipamento e outros materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Nikon</td><td>Centrífuga E200MV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Conjunto para 37&deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Conjunto para 37&deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células, Neubauer</td><td>BOECO Alemanha</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

como caldo em vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Infecções fúngicas tornaram-se uma importante condição médica nas últimas décadas, mas o número de drogas antifúngicas disponíveis é limitado. Nesse cenário, a busca de novos medicamentos antifúngicos é necessária. O relatado aqui detalha um método péptidos de tela para suas propriedades antifúngicas. Ele se baseia o teste de sensibilidade como caldo de orientações Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 com modificações de acordo com a pesquisa de peptídeos antimicrobianos como potenciais novos antifúngicos. Este protocolo descreve um ensaio funcional para avaliar a atividade dos compostos antifúngicos e pode ser facilmente modificado para se adequar a qualquer classe particular de moléculas sob investigação. Desde que os ensaios são realizados em placas de 96 poços, usando volumes pequenos, uma triagem em larga escala pode ser concluída em um curto espaço de tempo, especialmente se realizado em um ambiente de automação. Este procedimento ilustra como um protocolo clínico padronizado e ajustável pode ajudar a busca de trabalho-banco de novas moléculas para melhorar a terapia de doenças fúngicas.

O MIC é definido como a menor concentração de compostos antimicrobianos que inibe completamente o crescimento fúngico visível no final do período de incubação. Desde que o objectivo do presente protocolo é ter um método rápido de antifúngicos potencial de tela, qualquer bem com clara mídia similar aos poços em branco é considerado um resultado positivo, Considerando que qualquer bem com turbidez análoga dos poços de controle negativo/crescimento considerados negativos. No entanto, se houv...

Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

O objetivo geral deste método é avaliar a atividade de potenciais compostos antifúngicos, utilizando uma modificação do teste de suscetibilidade à microdiluição em caldo, utilizado em laboratórios clínicos. Este método é utilizado para avaliar a atividade fúngica de compostos naturais ou sintéticos, um dos primeiros testes no desenvolvimento de terapias antifúngicas. Fornecemos instruções para uma triagem inicial de novos antifúngicos usando pequenos volumes em um curto espaço de tempo, especialmente se os experimentos forem realizados com automação.Demonstrando o procedimento estará Daniel Zamith-Miranda, um pós-doutorando em meu laboratório. Comece este procedimento cultivando as cepas de fungos para o ensaio, conforme descrito no protocolo de texto. No dia seguinte, recolher as células centrifugando os tubos cónicos a 1200 G, durante cinco minutos à temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante, adicione dez mililitros de PBS a cada tubo e ressuspenda as células. Centrifugar novamente a 1200 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Repita a lavagem e centrifugação do PBS mais duas vezes.Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em cinco mililitros de meio RPMI 1640 de dupla resistência. Dependendo da turbidez da suspensão celular, preparar um mililitro de uma diluição de um a 100, ou de um a 1000, de cada cepa, em um tubo de microcentrífuga. Aliquat dez microlitros dessa diluição, coloque-a em uma câmara de hemocitômetro e conte o número total de células nos quatro quadrantes de canto sob o microscópio.Depois de calcular a densidade de cada suspensão celular, prepare as suspensões de células estoque em meio RPMI 1640 de dupla resistência. Prepare 4.000 células por mililitro para cepas de C. albicans e 20.000 células por mililitro para cepas de C. neoformans. Os peptídeos linfizados são armazenados em aliquats para uso único a menos 20 graus Celsius e apenas dissolvidos em água deionizada antes de cada experimento.A concentração de peptídeos deve ser o dobro da concentração final mais alta testada no ensaio. Antifúngicos de referência também são preparados. O ensaio antifúngico é realizado em microplacas de poliestireno triplicado e 96 poços.Usando uma diluição serial de duas vezes de cada peptídeo e controle antifúngico, e um volume final de 50 microlitros por poço. A etapa mais crucial do protocolo são as diluições em série, portanto, tenha muito cuidado durante as próximas etapas para evitar qualquer erro que comprometa toda a sua análise. Usando uma pipeta, adicione 100 microlitros do peptídeo antifúngico na concentração de força dupla da concentração final desejada mais alta nas colunas de um a três na linha A.Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microlitros de água estéril aos outros poços nas linhas B a H.Remova 50 microlitros dos poços com a concentração mais alta.Transfira para os poços correspondentes da próxima concentração e homogeneize pipetando para cima e para baixo várias vezes. Repita a diluição seriada até atingir os poços com a menor concentração e descarte 50 microlitros desses poços. Deixe as colunas 11 e 12 das linhas A, B e C com apenas água para controles em branco ou controles de crescimento negativos.Adicione 50 microlitros do inóculo ajustado de dupla força em meio RPMI 1640 a cada poço das colunas um a três, mais a coluna 11. A concentração final para C. albicans será de 2.000 células por mililitro. A concentração final para C. neoformans será de 10.000 células por mililitro.Prepare controles de crescimento negativos misturando 50 microlitros de água e 50 microlitros de inóculo ajustado sem o antifúngico. Prepare controles em branco combinando 50 microlitros de água e 50 microlitros de meio sem células. Carregue os controles nos poços apropriados.Observe todos os poços usando um microscópio óptico invertido e, em seguida, incube as placas a 37 graus com agitação a 200 rpm. Após o período de incubação, observe todos os poços novamente para verificar mudanças na morfologia, bem como para verificar se há sinais de contaminação. Adquira uma imagem de cada placa usando uma câmera digital.Neste ensaio representativo, três peptídeos antimicrobianos, ou AMPs, com concentrações variando de 100 micromolares a sete oito micromolares, foram avaliados quanto à atividade antifúngica contra C. neoformans. Um controle de crescimento e um branco foram incluídos. Qualquer poço com meio claro semelhante aos poços em branco é considerado um resultado positivo, enquanto qualquer poço com turbidez análoga aos poços de controle de crescimento negativo é considerado negativo.Como a concentração inibitória mínima, ou CIM, é definida como a menor concentração de composto antimicrobiano que inibe completamente o crescimento visível de fungos no final do período de incubação, 25 micromolares são considerados o CIM para AMP1. E, 12 vírgula cinco micromolar, o MIC para AMP2. O AMP3 terá que ser reavaliado, pois o fungo cresceu em todas as concentrações testadas.Da mesma forma, três peptídeos distintos testados contra C. albicans, indiciados 50 micromolares é o MIC para AMP1. Seis micromolares é a CIM para AMP2 e 25 micromolares é a CIM para AMP3. Um exemplo de um resultado ruim, provavelmente devido à pipetagem inadequada durante a etapa de diluição, é ilustrado pelas colunas cinco a sete da linha C nesta placa, onde as diferenças no crescimento de C. neoformans estão presentes entre as réplicas.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas, mais o tempo de crescimento do fungo, se for realizada corretamente. Lembre-se de estar ciente das características físico-químicas dessas moléculas testadas. Em seguida, use solventes apropriados como controle, caso sejam necessários, e use sempre as células na mesma fase de crescimento.Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como o ensaio de morte por tempo, o uso de corantes de viabilidade e ensaios ST60 para responder a perguntas adicionais, como se o composto tem um efeito fungicida ou fungistático. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de micrologia médica explorassem diversas fontes de compostos naturais ou sintéticos na busca por compostos antifúngicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como iniciar uma cultura de fungos, preparar células para o ensaio, realizar as diluições em série e ler os resultados após incubar as cepas de fungos com nossos compostos testados.Não se esqueça de que trabalhar com patógenos fúngicos pode ser extremamente perigoso. E a preparação, como usar equipamento de proteção individual, trabalhar dentro de um capuz de segurança biológica e usar práticas de segurança apropriadas, deve ser tomada durante a execução deste procedimento.

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Um método de microdiluição em caldo para teste de suscetibilidade a antibióticos de bactérias Gram-positivas

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para rastrear compostos antifúngicos usando um ensaio de microdiluição em caldo. Os compostos de teste são diluídos em série em uma placa de microtitulação e incubados com um inóculo fúngico. Após a incubação, a placa é examinada em busca de poços sem crescimento fúngico visível para avaliar o potencial antifúngico dos compostos de teste e sua concentração inibitória mínima (CIM).

Um ensaio de microdiluição em caldo in vitro para a triagem de compostos antifúngicos

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

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Aqui, apresentamos um protocolo para determinação da suscetibilidade à dalbavancina de bactérias Gram-positivas clinicamente relevantes usando uma metodologia de referência de microdiluição em caldo.

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

Aqui, apresentamos protocolos para rastrear e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante utilizam substratos bacterianos alvo para avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

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Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.

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Aprenda o método de microdiluição em caldo para triagem de compostos antifúngicos naturais ou sintéticos. Esta técnica automatizada permite avaliar rapidamente a atividade antifúngica com pequenos volumes e custo reduzido.

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