Name: Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a fabricar dispositivos microfluídicos para cristalização de proteínas e coleta de dados de difração de raios X em temperatura ambiente. Este método minimiza distúrbios mecânicos nos cristais e permite monitoramento por espalhamento de luz dinâmico.

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Este trabalho foi financiado pelo fundo de semente PIER PIF-2015-46, o BMBF concede 05K16GUA e 05K12GU3 e o cluster de excelência 'The centro de Hamburgo para Ultrafast Imaging – estrutura, dinâmica e controle da matéria na escala atômica' do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). O trabalho dos autores afiliado com o centro para a ciência do Laser de elétrons livres foi financiado pela Associação Helmholtz, através de fundos do programa orientado. Os dados de MX síncrotron foi coletados na trajetória P14 operado pelo EMBL de Hamburgo no anel de armazenamento de PETRA III (DESY, Hamburgo, Alemanha).

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Podemos fabricar dispositivos microfluídicos por difração de raios x em situ pela padronização de resina epóxi como preenchimento da folha de material e poliimida como material de janela. Nosso procedimento otimizado várias etapas do processo de fabricação mais raio-x anterior microplaqueta projetos16,21. Nós reduzimos a espessura de janela e, assim, o fundo dispersando enquanto também facilitando a fabricação menos etapas do processo são necessárias. cristalização em situ usando o protocolo descrito tem benefícios substanciais. Permite que coleta de dados de difração na temperatura e, assim, exclui a necessidade de proteção da cryo, que, em alguns casos, contém o risco de introdução de artefatos na estrutura da proteína. Além disso, os cristais não são sujeitos a estresse físico, porque a transferência dos cristais de seu ambiente nativo pode ser evitada. Através deste procedimento, os cristais de mantêm sua alta qualidade e não sofrem de qualquer tratamento.
Em nossa experiência, os passos mais críticos dentro do protocolo giram em torno de controlar o processo de cristalização. Os parâmetros para obter cristais adequados de raio-x com dimensões apropriadas precisam ser identificado empiricamente e não podem ser levados diretamente a partir de experiências de difusão de vapor. Usar idênticas concentrações de proteína e dessensibilizador não sempre resultou em cristais em fichas diferentes, ou às vezes em poços diferentes dentro do mesmo chip. Isto indica que todos os fatores que influenciam o crescimento e a nucleação de cristal devem ser considerados com cuidado, como mãe licor composição ou cristalização cinética (através da trajetória de evaporação). Como cristais maiores difração de maior resolução, devidamente grandes cristais são idealmente cultivados. O processo de nucleação de cristais e crescimento pode ser seguido com medições de DLS. Ajustar o foco do laser dentro do ~ 50 µm compartimentos de cristalização fina do chip podem ser desafiadoras e podem exigir cuidado alinhamento manual. Por meio de poços mais profundos do que 100 µm, laser autoalinhamento era viável e confiável, tal que vários poços podem ser monitorados através de sistemas automatizados de aquisição.
Os chips de raio-x de poliimida com base em produzem apenas um baixo fundo e demonstramos a adequação desses dispositivos para a rotina de coleta de dados de difração de raios-x através da resolução de estruturas para três proteínas do modelo. A melhor resolução obtida em chip diferem, em comparação com resoluções anteriormente alcançadas, de cristais de proteína significativamente maiores e coleta de dados de raio-x convencional. Isto pode ser devido a vários fatores, e ainda mais a otimização de condição de cristalização pode melhorar ainda mais a difração. Foi possível coletar dados em situ de difração em resoluções de até 1,8 Å aplicando cristal com dimensões menores que 30 µm. A análise detalhada dos dados de difração Taumatina forneceu insights sobre danos de radiação. Para limitar a extensão dos danos de radiação, apenas um único cristal deve ser exposto por compartimento no dispositivo microfluidic, como a difusão de radicais e em cristais vizinhos pode ocorrer. Para melhorar a velocidade de coleta de dados, isso deve ser automatizado no futuro.
Devido à morfologia do cristal, em alguns casos pode ocorrer uma orientação preferencial. Foi por exemplo o caso com o dataset tioredoxina, onde os cristais tinham uma orientação fortemente preferencial em relação ao windows chip. Até aqui, nós poderia coletar um conjunto de dados completo de difração. Se os cristais apresentam uma orientação preferencial no chip, e em particular se o correspondente grupo de espaço também tem uma baixa simetria, então a integralidade do conjunto de dados deve ser monitorada durante a coleta de tal que seja suficiente cana de padrões de difração coletados.
Estudos de tempo-resolvido utilizando esses chips são diretamente possíveis quando usar luz induziu reações com uma abordagem de bomba-sonda. A transmissão de luz de folha de poliimida para o laser da bomba precisa ser elucidado e Alternativamente, opticamente clara poliimida ou COC poderia ser usado. As geometrias microfluidic atual não permite substrato misturando experiências após os cristais são cultivados. No entanto, esperamos que o protocolo de fabricação de chip raio x descrito também ser adequado para tal mistura desenhos para ambos difração de raios x tempo-resolvido bem como espalhamento abordagens19.

Conhecer a estrutura 3D de uma proteína é essencial para compreender a sua funcionalidade. Estruturas de resolução atômica perto até agora são mais comumente obtidas por cristalografia de raios x. Esta técnica apresenta cristais de proteína à radiação de raios-x e os padrões de difração resultantes são então analisados para refinamento e determinação da estrutura. No tradicional cristalografia de raios x, um conjunto de dados completo de difração é gravado de um cristal único, idealmente grande, em temperaturas criogênicas. Tais cristais, no entanto, em sua maioria não são triviais para crescer, e identificar as condições de crio-preservação adequada pode se tornar um desafio em si mesmo e às vezes também pode causar desvios da estrutura nativa da proteína5.
Recentes avanços tecnológicos em laser de elétrons livres de raio-x (FEL) e de luz síncroton síncrotron permitiram resolver estruturas de cristais menores, como de luz síncroton novos microfoco, brilho do feixe maior raio-x e detectores de raio x melhorados tornou-se disponível6,7. Normalmente, pequenos cristais são mais fáceis de crescer do que grande e cristais livre8,9de defeitos. No entanto, pequenos cristais sofrem danos de radiação de raios-x muito mais rápido do que grandes cristais. Isto é porque em comparação com um grande cristal, uma dose maior de raios-x deve ser projectada em um menor volume de cristal para difração a resolução comparável. Portanto, proteção até criogênica muitas vezes não é suficiente para gravar um conjunto de dados de difração completa de um único microcrystal.
Para superar este obstáculo, cristalografia serial tornou-se o método de escolha para coletar e mesclar os padrões de difração de muitos microcristais aleatoriamente orientados para obter um conjunto de dados completo. Radiação dano induzido cristal é minimizado, espalhando a dose total de raio-x usado para resolver uma estrutura de proteína sobre um elevado número de cristais5,10. Em um ' difração antes que destruam ' FEL experimento, cada cristal é usado apenas para uma exposição usando pulsos de raio-x da femto segundos. Beamlines microfoco em fontes de síncrotron terceiros geração, por sua vez, pode executar serial cristalografia com alguns milissegundos curto raio x exposições11,12,13,14. Sem uma oscilação do cristal ou rotação durante a coleta de dados, no entanto, apenas reflexões de Bragg parciais podem ser gravados e, portanto, dezenas de milhares ou mais padrões de difração são normalmente necessários para a determinação de estrutura15. Até à data, foi desenvolvido um conjunto diversificado de métodos de entrega da amostra para cristalografia serial, como recentemente revisto14,16,17,18,19. Entre aqueles, vários fixo-alvo com base em entrega de amostra estratégias com êxito foram combinadas com rotação de cristal durante exposições de raios-x, tal que significativamente menos padrões de difração podem fornecer igualmente datasets completa enquanto também consome menos amostra em relação a cristalografia série clássica experimentos onde imagens ainda são gravadas7,16,20,21,22,23 , 24.
Apresentamos um protocolo para fabricar dispositivos microfluídicos com baixo fundo de raio-x. Os dispositivos são padronizados de cola epóxi 5-min usando litografia macia e são adequados para experimentos de difração de raios x in situ à temperatura que se beneficiam de integrar a preparação da amostra diretamente a afinação de raio-x, conforme o caso, com estudos de tempo-resolvido que seguem induzida pela mistura cinética18,19. Canais microfluídicos são pálpebras de ambos os lados com folha de poliimida poliméricos, resultando em windows de raio-x com uma espessura combinada de cerca de 16 µm que permitem a baixa imagem de plano de fundo do raio x. Todos os materiais utilizados proporcionam boa resistência solvente. Este método de fabricação é comparativamente simples e barato. Após a aquisição de um wafer de mestre SU-8, todos de fabricação pode ser concluída fora de uma sala limpa em uma configuração de laboratório de pesquisa típico.
Um exemplo de aplicativo, descrevemos fichas para goniômetro baseado cristalografia serial alvo fixo. Em primeiro lugar, as considerações de design e fabricação para usando válvulas capilar para microfluidically dividir uma reação aquosa em um número selecionado de nanolitros tamanho gotículas são discutidas. Este mecanismo de carregamento evita a perda de amostra de mortos-volume do canal e divisão pode facilmente ser executada manualmente sem o uso de bombas ou outros equipamentos para atuação de fluido. Tais nanolitros isolado tamanho gotas de solução de proteína são monitorados em situ usando Difusão dinâmica da luz (DLS) para controle da proteína cristal nucleação e crescimento. Anteriormente foi demonstrado que as medições de DLS podem ser executadas em dispositivos microfluídicos, consistindo de uma estrutura de polidimetilsiloxano (PDMS) ligada a um slide de vidro25,26. Porque a camada de poliimida tem uma transmissão elevada para comprimentos de onda mais de 550 nm, a abordagem pode ser estendida para medições em fichas transparentes de raio-x, bem como, quando usando um comprimento de onda de laser apropriado27,28. Baseado nos resultados DLS, nucleação inicial pode ser observada, e mais evaporação de gotículas pode ser interrompida para obter cristais de proteína menos, mas maior.
Depois de suficientes cristais são cultivadas, conjuntos de dados de difração de raio-x completo então podem ser coletados utilizando goniômetro baseado em situ fixada alvo serial cristalografia de raios x em temperatura ambiente. Conjuntos de dados de difração são processados usando um conjunto de ferramentas de software e scripts personalizados para resolver a estrutura de cristal da proteína. Esta técnica evita artefatos frequentemente induzidos durante a crio-preservação usado em experimentos de cristalografia convencional.
Comparamos três estruturas de destino de proteína que foram resolvidas usando aproximadamente 10-20 µm pequenos cristais crescidos no chip para melhor então 2 resolução Å. Por cristalização e diffracting em situ, manuseio e, portanto, mecânica distúrbios de cristais frágil é minimizado. Este protocolo pode ser aplicado para cristais de proteína que difração de alta resolução, bem como de baixa resolução (1,7 Å de 3.0 Å). Como quase todos os cristais podem ser usados para difração, pequena amostra é desperdiçada, tornando este um método de entrega de cristal muito eficiente.
Este protocolo fornece um guia detalhado sobre como preparar chips microfluídicos transparente de raio-x em situ proteína cristalização e difração de recolha de dados. O procedimento foi cuidadosamente projetado para beneficiar microfluidic precisão sem a necessidade de equipamentos sofisticados no laboratório. Também, coleta de dados para a trajetória de síncrotron pode ser realizada sem a necessidade de um goniômetro especializado ou umidificador para facilitar a reprodução dos resultados por não-especialistas. A técnica apresentada pode ser aplicada para serial milissegundo cristalografia coleção de dados em temperatura mantendo os danos de radiação mínima e sem a introdução de estresse para os cristais após crescimento por manipulação de cryo-proteção ou cristal. Portanto, o método descrito é adequado para qualquer projeto de cristalização de proteínas.

<table><tbody><tr><td>SU-8 Série 3000</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Fotorresistente</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Revelador</td></tr><tr>Álcool <td></td><td></td><td>isopropílico</td><td>Solvente Etanol</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Cola epóxi</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Cola epóxi</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Folha de silicone</td></tr><tr><td>Kapton</td><td>Dupont / Grau American Durafilm</td><td>HN, calibre 30 (7.5 &mu; m)</td> <td>folha de poliimida</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Químico</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Revestimento de fluoropolímero Cytop</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvente</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Óleo fluorado</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td></td><td>AutoCAD CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Máscara fotográfica</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 polegadas wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Máscara de wafer de silício</td></tr><tr><td>alinhador</td><td>S&Uuml; SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Máscara alinhador</td></tr><tr><td>PDMS misturador</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de plasma</td><td>Diener eletrônico</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma</td><td>Aldrich T7638</td><td>Proteína</td></tr><tr><td>Glicose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Proteína</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Química</td></tr><tr><td>Tartarato de sódio</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Químico</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td> Químico <td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Amônio</td><td>Químico Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Químico Sigma Aldrich</td><td></td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td> químico <td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td></td></tr><tr><td>Dimensões moleculares</td><td>PEG1500</td> químicas <td>MD2-100-6</td><td>Tampão SPG químico</td></tr><tr><td></td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Espectroluz</td></tr><tr><td>química600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrumento</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrofotômetro</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Impressora 3D Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>Impressora 3D</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &micro; Filtro m</td></tr><tr><td>Tubulação</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>Tubulação PTFE 0.3 mm Diâmetro Interno x 0.76 mm Diâmetro Externo</td></tr><tr><td>Seringas&nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Agulha de Ponta</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agulha Terumo Agani</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8"</td></tr></tbody></table>

chips microfluídicos por difração de raio x de cristal in situ e in situ difusão dinâmica da luz de cristalografia de serial

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Este protocolo descreve a fabricação dispositivos microfluídicos com baixo fundo de raio-x, otimizado para goniômetro baseado cristalografia serial alvo fixo. Os dispositivos são padronizados de cola epóxi usando litografia macia e são adequados para em situ experimentos de difração de raios x em temperatura ambiente. Os poços da amostra são pálpebras de ambos os lados com janelas de folha de poliimida poliméricos que permitem a coleta de dados de difração com baixo fundo de raio-x. Este método de fabricação é pouco exigente e barato. Após a aquisição de um wafer de mestre SU-8, todos de fabricação pode ser concluída fora de uma sala limpa em um ambiente de laboratório de pesquisa típico. O protocolo de projeto e fabricação de chip utilizam válvulas capilar para dividir uma reação aquosa em gotículas de nanolitros definido tamanho de microfluidically. Este mecanismo de carregamento evita a perda de amostra de mortos-volume do canal e pode facilmente ser executado manualmente sem o uso de bombas ou outros equipamentos para atuação de fluido. Descrevemos como isolado de nanolitros de tamanho de gotas de solução de proteína pode ser monitorado em situ pela luz dinâmica dispersando a nucleação de cristais de proteína de controle e crescimento. Depois de cristais apropriados são cultivadas, conjuntos de dados de difração de raio-x completo podem ser coletados usando goniômetro baseado em situ fixada alvo serial cristalografia de raios x em temperatura ambiente. O protocolo fornece scripts personalizados para processar difração de conjuntos de dados utilizando um conjunto de ferramentas de software para resolver e refinar a estrutura de cristal da proteína. Essa abordagem evita os artefatos possivelmente induzidos durante a crio-preservação ou cristal manual em experimentos de cristalografia convencional de manipulação. Apresentar e comparar três estruturas de proteína que foram resolvidas usando pequenos cristais com dimensões de aproximadamente 10-20 µm crescido no chip. Por cristalização e diffracting em situ, manuseio e, portanto, mecânica distúrbios de cristais frágil é minimizado. O protocolo detalha como fabricar um chip personalizado radiografia microfluidic transparente adequado para em situ serial cristalografia. Como quase todos os cristais podem ser usados para coleta de dados de difração, esses chips microfluídicos são um método de entrega de cristal muito eficiente.

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar e operar um dispositivo microfluídico para coleta de dados de difração de raios-X de cristalização de proteínas à temperatura ambiente. A principal vantagem dessa técnica é que a cristalização dentro do chip minimiza a perturbação mecânica dos cristais de proteína. Esses chips transparentes de raios X são fáceis de produzir, podem ser montados diretamente em goniômetros da maioria das linhas de luz síncrotron e fazem uso eficiente dos cristais disponíveis ao coletar dados de difração de raios X.Primeiro, coloque um molde mestre do design do chip de raios-X em uma placa de Petri de 10 centímetros forrada com papel alumínio. Misture cerca de 30 gramas no total de base PDMS e agente de cura em uma proporção de 10 para um e despeje o PDMS no mestre a uma altura de quatro milímetros. Desgaseifique o PDMS em um dessecador a vácuo por cinco minutos e sopre ar para remover as bolhas de ar restantes na superfície do PDMS.Cure o PDMS em um forno a 70 graus Celsius por uma hora. Em seguida, descasque suavemente o molde PDMS curado do mestre. Use um bisturi para cortar o excesso de PDMS.Antes da fabricação do chip de raios-X, certifique-se de que o espaço de trabalho esteja organizado para permitir fácil acesso a todos os equipamentos e componentes necessários durante a fundição do molde epóxi. Para iniciar a fabricação do chip, dilua os precursores de uma resina epóxi de dois componentes com etanol até uma concentração final de massa de etanol de 40% em peso. Usando um misturador de vórtice, misture resina epóxi e etanol.Desgaseifique o molde PDMS em um dessecador a vácuo por 30 minutos para garantir que o PDMS possa posteriormente absorver pequenas bolhas de ar da resina epóxi. Corte um pedaço de 70 milímetros por 70 milímetros de folha de poliimida de 7,5 mícrons de espessura e enrole a folha em torno de uma lâmina de vidro de 75 milímetros por 50 milímetros. Cole as bordas da folha na parte de trás da lâmina para formar uma superfície plana e rígida de poliimida.Trate a folha de poliimida com plasma de oxigênio por 20 segundos. Em seguida, incube a folha em uma solução aquosa a 1% por volume de APTS ou GPTS por cinco minutos a 20 graus Celsius. Durante a silanização, misture bem as soluções precursoras de resina epóxi com uma pequena espátula.Transfira o molde PDMS desgaseificado do dessecador a vácuo para uma superfície plana. Seque a folha de poliimida silanizada com ar pressurizado ou gás nitrogênio. Aplique rapidamente uma gota da mistura de resina em cada microestrutura do molde.Coloque a folha de poliimida com a face para baixo na resina epóxi e pressione firmemente a lâmina. Cubra o conjunto com uma folha de plástico e uma folha de metal. Coloque pesos na chapa de metal para aplicar uma pressão de até 1,4 newtons por centímetro quadrado ao conjunto.Após 15 minutos, separe suavemente a lâmina de vidro da folha de poliimida com padrão epóxi e limpe a folha de poliimida até secar. Coloque papel alumínio, folha de metal e pesos de volta por cima. Deixe o epóxi curar em temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, remova os pesos, a folha de metal e a folha de plástico. Descasque suavemente a folha de poliimida padronizada do molde PDMS. Trate a folha padronizada por 20 segundos e silanize a folha padronizada com APTS ou GPTS, conforme descrito anteriormente.Silanize uma folha de poliimida imaculada com a outra solução de silano nas mesmas condições. Seque ambas as folhas com ar pressurizado. Em seguida, aplique uma gota de água deionizada em uma superfície limpa, seca e plana.Corte estruturas de cavacos individuais em folha de poliimida e coloque a folha de poliimida padronizada com o lado epóxi voltado para cima na gota de água e alise cuidadosamente a folha até ficar completamente plana. Coloque a segunda folha de poliimida na folha padronizada com a face silanizada voltada para baixo. Alise suavemente a segunda folha de canto a canto oposto para expelir as bolhas de ar e unir as folhas de poliimida.Para começar a fabricar as portas de acesso, corte de uma placa PDMS curada de quatro milímetros um bloco de tamanho suficiente para cobrir todas as portas do chip de raios-X de poliimida sem cobrir o compartimento de cristalização. Trate o plasma, silanize e seque o chip de poliimida e o bloco PDMS. Pressione o bloco tratado no chip sobre as portas.Cubra o chip com uma folha de plástico, uma lâmina de vidro limpa e uma folha de metal. Aplique 1,4 newtons por centímetro quadrado de pressão por uma hora. Em seguida, use um punção de biópsia de 0,75 milímetro para perfurar os orifícios de entrada e saída onde marcados no design do chip.Sele a parte de trás do chip com fita isolante elétrica de filme de poliimida. Em seguida, dilua uma solução estoque de 9% em peso de material de revestimento de fluoropolímero transparente para 0,45% em peso com um solvente fluorado. Conecte uma agulha de calibre 27 e 5/8 de polegada à seringa.Encaixe o tubo de politetrafluoretileno sobre a extremidade da agulha. Carregue a solução de fluoropolímero em uma seringa Luer lock de um mililitro. Conecte a outra extremidade da tubulação à saída do chip de raios-X.Injete a solução de fluoropolímero no chip até que todos os canais estejam cheios e remova o excesso de solução de fluoropolímero usando uma seringa cheia de ar. Coloque o chip cheio com o lado plano voltado para baixo em uma placa de aquecimento a 190 graus Celsius. Aqueça o chip por cinco minutos para evaporar o solvente, revestindo assim os canais com o fluoropolímero.Antes do procedimento de cristalização, filtre a solução proteica escolhida com um filtro de 0,2 mícron. Centrifugar a solução durante 15 minutos a 16, 100 vezes g e 20 graus Celsius e recuperar o sobrenadante para as experiências de cristalização. Para iniciar o procedimento de cristalização, combine volumes iguais de uma solução de proteína e seu precipitante.Puxe cerca de 20 microlitros dessa mistura para uma seringa. Use uma agulha de calibre 27 e 5/8 de polegada e um tubo de PTFE para conectar a seringa à entrada do chip de raios-X. Conecte uma seringa de óleo fluorado à saída da mesma maneira.Enquanto monitora o chip sob um microscópio, encha a solução de cristalização através da entrada no chip com o layout paralelo. Injete óleo fluorado suficiente para separar os compartimentos de cristalização no chip. Em seguida, bloqueie as portas de entrada e saída com clipes de papel ou outros plugues estreitos.Armazene o chip sob as condições de cristalização apropriadas. A formação de cristais agora pode ser observada sob um microscópio ou por medições dinâmicas de espalhamento de luz. Quando estiver pronto para a coleta de dados, use fita dupla-face para fixar o chip de raio-X a um adaptador impresso em 3D para o goniômetro de placa.Monte o adaptador de chip no goniômetro de placas na linha de luz síncrotron. Colete e analise os dados de difração. A microscopia de campo claro foi usada para quantificar a taxa de evaporação da água das câmaras de cristalização do chip de folha de poliimida.O espalhamento dinâmico de luz pode detectar a nucleação inicial de cristais de taumatina em um chip PDMS em uma lâmina de vidro com geometria equivalente, permitindo que as condições de cristalização sejam otimizadas. 10 padrões de difração foram coletados de cada um dos 83 cristais de taumatina cultivados em um chip de poliimida com uma rotação de um grau durante cada quadro. O conjunto de dados foi dividido em cinco subconjuntos de dados por quadro, e o decaimento da intensidade do poder de difração normalizado ao longo do tempo foi então avaliado.No quarto conjunto de dados, o poder de difração diminuiu para menos de 50% Os valores do fator R de medição dos subconjuntos de dados aumentaram ao longo do tempo, indicando que os cristais sofreram danos por radiação durante a coleta de dados. Isso foi atribuído aos radicais livres gerados durante a exposição aos raios-X, degradando os cristais vizinhos no mesmo compartimento. Os cristais de taumatina bipiramidal apresentaram ampla distribuição de orientações no chip de raios-X.Os cristais de glicose isomerase ortorrômbica também mostraram uma ampla distribuição de orientações quando cultivados em um chip de poliimida. No entanto, os cristais de tiorredoxina tinham predominantemente orientações nos planos xy, xz e yz, potencialmente devido à sua forma alongada. Em geral, esses chips são muito robustos e têm um fundo de raios-X baixo.Isso torna este método de fabricação adequado para outras técnicas de imagem de raios-X, como espalhamento de raios-X de pequeno ângulo. Este procedimento pode ser facilmente adaptado para atender às suas necessidades experimentais. Por exemplo, o design do chip pode ser modificado ajustando as dimensões dos compartimentos individuais ou o número total de compartimentos por chip.Um foco particular para nós foi projetar um fluxo de trabalho que não exigisse equipamentos caros, como ferramentas especializadas ou bombas microfluídicas. Depois de assistir a este vídeo e ler o manuscrito, você deve ter um bom entendimento de como cristalizar em chip, monitorar o processo de cristalização e registrar e analisar dados de difração usando a abordagem de chip. Uma vez dominada, essa técnica permite a fabricação em lote de chips microfluídicos de um mestre PDMS em cerca de três horas, sem a necessidade de uma sala limpa dedicada.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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