Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

O objetivo geral deste procedimento é fabricar e operar um dispositivo microfluídico para coleta de dados de difração de raios-X de cristalização de proteínas à temperatura ambiente. A principal vantagem dessa técnica é que a cristalização dentro do chip minimiza a perturbação mecânica dos cristais de proteína. Esses chips transparentes de raios X são fáceis de produzir, podem ser montados diretamente em goniômetros da maioria das linhas de luz síncrotron e fazem uso eficiente dos cristais disponíveis ao coletar dados de difração de raios X.

Primeiro, coloque um molde mestre do design do chip de raios-X em uma placa de Petri de 10 centímetros forrada com papel alumínio. Misture cerca de 30 gramas no total de base PDMS e agente de cura em uma proporção de 10 para um e despeje o PDMS no mestre a uma altura de quatro milímetros. Desgaseifique o PDMS em um dessecador a vácuo por cinco minutos e sopre ar para remover as bolhas de ar restantes na superfície do PDMS.

Cure o PDMS em um forno a 70 graus Celsius por uma hora. Em seguida, descasque suavemente o molde PDMS curado do mestre. Use um bisturi para cortar o excesso de PDMS.

Antes da fabricação do chip de raios-X, certifique-se de que o espaço de trabalho esteja organizado para permitir fácil acesso a todos os equipamentos e componentes necessários durante a fundição do molde epóxi. Para iniciar a fabricação do chip, dilua os precursores de uma resina epóxi de dois componentes com etanol até uma concentração final de massa de etanol de 40% em peso. Usando um misturador de vórtice, misture resina epóxi e etanol

Desgaseifique o molde PDMS em um dessecador a vácuo por 30 minutos para garantir que o PDMS possa posteriormente absorver pequenas bolhas de ar da resina epóxi. Corte um pedaço de 70 milímetros por 70 milímetros de folha de poliimida de 7,5 mícrons de espessura e enrole a folha em torno de uma lâmina de vidro de 75 milímetros por 50 milímetros. Cole as bordas da folha na parte de trás da lâmina para formar uma superfície plana e rígida de poliimida.

Trate a folha de poliimida com plasma de oxigênio por 20 segundos. Em seguida, incube a folha em uma solução aquosa a 1% por volume de APTS ou GPTS por cinco minutos a 20 graus Celsius. Durante a silanização, misture bem as soluções precursoras de resina epóxi com uma pequena espátula.

Transfira o molde PDMS desgaseificado do dessecador a vácuo para uma superfície plana. Seque a folha de poliimida silanizada com ar pressurizado ou gás nitrogênio. Aplique rapidamente uma gota da mistura de resina em cada microestrutura do molde.

Coloque a folha de poliimida com a face para baixo na resina epóxi e pressione firmemente a lâmina. Cubra o conjunto com uma folha de plástico e uma folha de metal. Coloque pesos na chapa de metal para aplicar uma pressão de até 1,4 newtons por centímetro quadrado ao conjunto.

Após 15 minutos, separe suavemente a lâmina de vidro da folha de poliimida com padrão epóxi e limpe a folha de poliimida até secar. Coloque papel alumínio, folha de metal e pesos de volta por cima. Deixe o epóxi curar em temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, remova os pesos, a folha de metal e a folha de plástico. Descasque suavemente a folha de poliimida padronizada do molde PDMS. Trate a folha padronizada por 20 segundos e silanize a folha padronizada com APTS ou GPTS, conforme descrito anteriormente.

Silanize uma folha de poliimida imaculada com a outra solução de silano nas mesmas condições. Seque ambas as folhas com ar pressurizado. Em seguida, aplique uma gota de água deionizada em uma superfície limpa, seca e plana.

Corte estruturas de cavacos individuais em folha de poliimida e coloque a folha de poliimida padronizada com o lado epóxi voltado para cima na gota de água e alise cuidadosamente a folha até ficar completamente plana. Coloque a segunda folha de poliimida na folha padronizada com a face silanizada voltada para baixo. Alise suavemente a segunda folha de canto a canto oposto para expelir as bolhas de ar e unir as folhas de poliimida.

Para começar a fabricar as portas de acesso, corte de uma placa PDMS curada de quatro milímetros um bloco de tamanho suficiente para cobrir todas as portas do chip de raios-X de poliimida sem cobrir o compartimento de cristalização. Trate o plasma, silanize e seque o chip de poliimida e o bloco PDMS. Pressione o bloco tratado no chip sobre as portas.

Cubra o chip com uma folha de plástico, uma lâmina de vidro limpa e uma folha de metal. Aplique 1,4 newtons por centímetro quadrado de pressão por uma hora. Em seguida, use um punção de biópsia de 0,75 milímetro para perfurar os orifícios de entrada e saída onde marcados no design do chip.

Sele a parte de trás do chip com fita isolante elétrica de filme de poliimida. Em seguida, dilua uma solução estoque de 9% em peso de material de revestimento de fluoropolímero transparente para 0,45% em peso com um solvente fluorado. Conecte uma agulha de calibre 27 e 5/8 de polegada à seringa.

Encaixe o tubo de politetrafluoretileno sobre a extremidade da agulha. Carregue a solução de fluoropolímero em uma seringa Luer lock de um mililitro. Conecte a outra extremidade da tubulação à saída do chip de raios-X.

Injete a solução de fluoropolímero no chip até que todos os canais estejam cheios e remova o excesso de solução de fluoropolímero usando uma seringa cheia de ar. Coloque o chip cheio com o lado plano voltado para baixo em uma placa de aquecimento a 190 graus Celsius. Aqueça o chip por cinco minutos para evaporar o solvente, revestindo assim os canais com o fluoropolímero.

Antes do procedimento de cristalização, filtre a solução proteica escolhida com um filtro de 0,2 mícron. Centrifugar a solução durante 15 minutos a 16, 100 vezes g e 20 graus Celsius e recuperar o sobrenadante para as experiências de cristalização. Para iniciar o procedimento de cristalização, combine volumes iguais de uma solução de proteína e seu precipitante.

Puxe cerca de 20 microlitros dessa mistura para uma seringa. Use uma agulha de calibre 27 e 5/8 de polegada e um tubo de PTFE para conectar a seringa à entrada do chip de raios-X. Conecte uma seringa de óleo fluorado à saída da mesma maneira.

Enquanto monitora o chip sob um microscópio, encha a solução de cristalização através da entrada no chip com o layout paralelo. Injete óleo fluorado suficiente para separar os compartimentos de cristalização no chip. Em seguida, bloqueie as portas de entrada e saída com clipes de papel ou outros plugues estreitos.

Armazene o chip sob as condições de cristalização apropriadas. A formação de cristais agora pode ser observada sob um microscópio ou por medições dinâmicas de espalhamento de luz. Quando estiver pronto para a coleta de dados, use fita dupla-face para fixar o chip de raio-X a um adaptador impresso em 3D para o goniômetro de placa.

Monte o adaptador de chip no goniômetro de placas na linha de luz síncrotron. Colete e analise os dados de difração. A microscopia de campo claro foi usada para quantificar a taxa de evaporação da água das câmaras de cristalização do chip de folha de poliimida.

O espalhamento dinâmico de luz pode detectar a nucleação inicial de cristais de taumatina em um chip PDMS em uma lâmina de vidro com geometria equivalente, permitindo que as condições de cristalização sejam otimizadas. 10 padrões de difração foram coletados de cada um dos 83 cristais de taumatina cultivados em um chip de poliimida com uma rotação de um grau durante cada quadro. O conjunto de dados foi dividido em cinco subconjuntos de dados por quadro, e o decaimento da intensidade do poder de difração normalizado ao longo do tempo foi então avaliado.

No quarto conjunto de dados, o poder de difração diminuiu para menos de 50% Os valores do fator R de medição dos subconjuntos de dados aumentaram ao longo do tempo, indicando que os cristais sofreram danos por radiação durante a coleta de dados. Isso foi atribuído aos radicais livres gerados durante a exposição aos raios-X, degradando os cristais vizinhos no mesmo compartimento. Os cristais de taumatina bipiramidal apresentaram ampla distribuição de orientações no chip de raios-X.

Os cristais de glicose isomerase ortorrômbica também mostraram uma ampla distribuição de orientações quando cultivados em um chip de poliimida. No entanto, os cristais de tiorredoxina tinham predominantemente orientações nos planos xy, xz e yz, potencialmente devido à sua forma alongada. Em geral, esses chips são muito robustos e têm um fundo de raios-X baixo.

Isso torna este método de fabricação adequado para outras técnicas de imagem de raios-X, como espalhamento de raios-X de pequeno ângulo. Este procedimento pode ser facilmente adaptado para atender às suas necessidades experimentais. Por exemplo, o design do chip pode ser modificado ajustando as dimensões dos compartimentos individuais ou o número total de compartimentos por chip.

Um foco particular para nós foi projetar um fluxo de trabalho que não exigisse equipamentos caros, como ferramentas especializadas ou bombas microfluídicas. Depois de assistir a este vídeo e ler o manuscrito, você deve ter um bom entendimento de como cristalizar em chip, monitorar o processo de cristalização e registrar e analisar dados de difração usando a abordagem de chip. Uma vez dominada, essa técnica permite a fabricação em lote de chips microfluídicos de um mestre PDMS em cerca de três horas, sem a necessidade de uma sala limpa dedicada.