Endoreduplicação por citometria de fluxo de protoplastas de tubérculos isolados de medição

O objetivo geral deste experimento é avaliar os níveis de endoreduplicação em tubérculos de batata. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a morfologia do tubérculo da batata, como o estágio de desenvolvimento em que os tecidos dos tubérculos sofrem endoreduplicação. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece resultados muito mais claros em comparação com as preparações típicas de citometria de fluxo.

Demonstrando o procedimento estará Parker Laimbeer. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Depois de preparar as soluções e tampões de acordo com o protocolo de texto, esterilize os tubérculos de batata por imersão em etanol a 71% por pelo menos cinco minutos.

Remova os materiais vegetais do etanol e deixe-os secar ao ar. Prepare e rotule tubos cônicos estéreis de 50 mililitros para cada amostra e alíquota de 15 mililitros de solução de incubação de plasmólise esterilizada por filtro ou PIS, em cada um. Usando um bisturi esterilizado ou uma cortiça, obteve uma amostra de aproximadamente um centímetro cúbico do desejo de esterilizar o tecido.

Use o bisturi esterilizado para cortar grosseiramente o tecido em pedaços de aproximadamente três milímetros cúbicos. E transfira o tecido para um tubo cônico contendo PIS. Em seguida, incube o tecido a quatro graus Celsius durante a noite.

Para gerar protoplastos de batata, comece preparando e filtrando uma quantidade adequada de solução enzimática ou ES com manitol 0,71 molar, cloreto de cálcio três milimolares, fosfato monopotássico milimolar. Um cloreto de magnésio milimolar, 4% de celulase Onozuka R-10, 0,8% de macerozima R-10, 1% de hemicelulase e tampão MES de 10 milimolares, pH 5,8. Usando uma pipeta sorológica, aspire o PIS das amostras nos tubos.

Adicione 10 mililitros do ES a cada amostra e inverta os tubos duas a três vezes. Em seguida, incube as amostras a 29% Celsius e 180 RPM durante a noite. No terceiro dia, para colher e lavar os protoplastos, remova as amostras do agitador e deixe-as repousar por aproximadamente 10 minutos.

Com uma pipeta sorológica, aspirar o máximo possível da solução de ES, tomando cuidado para evitar o tecido digerido. Em seguida, usando uma micropipeta e segurando o tubo em ângulo, remova qualquer solução ES restante novamente, evitando o tecido digerido. É fundamental remover o máximo possível da solução de lavagem de protoplastos para evitar danos aos núcleos.

Segurar o tubo em um ângulo pode ajudar na remoção da solução, deixando os protoplastos. Adicione 15 mililitros de PWS a cada amostra. E inverta o tubo suavemente duas a três vezes.

Deixe os protoplastos assentarem por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta sorológica para remover o PWS. E uma micro pipeta para remover qualquer líquido restante.

Enquanto mantém as amostras no gelo, adicione 1,5 mililitros de FCB gelado a cada tubo. Agite brevemente ou vortex cada amostra para quebrar o tecido agregado. É importante quebrar os aglomerados de tecido do tubérculo para que o FCB possa permear totalmente as células e liberar os núcleos.

Se um controle for adicionado a partir desta etapa, use uma lâmina de barbear para picar finamente uma folha pequena em 1,5 mililitros de FCB gelado. As amostras de controle devem ter a mesma plloidade que as amostras experimentais, de preferência o mesmo genótipo. Insira um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com a ponta cortada e uma malha de metal de 106 micrômetros derretida até o fundo em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Em seguida, passe um mililitro da suspensão de tecido FCB pelo filtro. Adicione 250 microlitros da solução de RNA a cada amostra. Em seguida, inverta os tubos e incube-os por 30 minutos em temperatura ambiente.

Adicione 125 microlitros de iodeto de propídio previamente preparado ou solução PI a cada amostra. Inverta e incube os tubos no gelo por 30 minutos. Use amostras o mais rápido possível e dentro de duas horas evite a degradação.

Crie dois gráficos de pontos usando a escala logarítmica de dispersão direta versus dispersão lateral e PI versus dispersão lateral. Crie também um histograma com PI no eixo x. A escala logarítmica é necessária para garantir que todos os eventos estejam dentro da escala, pois os núcleos podem diferir muito na fluorescência.

Carregue um tubo de uma amostra de controle conhecida, como um tecido foliar in vitro de um genótipo de amostra. E ajuste a tensão para que todos os eventos estejam em escala. Anote o canal do pico 2C na amostra de controle.

Os picos de 2C das amostras experimentais devem cair no mesmo local. Carregue uma amostra experimental de tubérculo e verifique novamente se todos os eventos estão em escala. Se forem necessários ajustes, repita o ajuste de tensão da amostra de controle para identificar o canal de picos de 2C.

Bloqueie manualmente os núcleos do protoplasto usando o gráfico de dispersão lateral versus PI. Em seguida, defina o histograma PI para mostrar apenas a região dos núcleos de protoplastos fechados. Colete o número desejado de eventos de cada amostra.

Freqüentemente, os pesquisadores usam 10.000 eventos fechados para citometria de fluxo. No entanto, 2000 eventos são usados aqui para amostras de protoplastos de tubérculos para acomodar mais amostras e amostras com baixas concentrações. A geração de protoplastos é necessária para obter resultados de citometria de fluxo repetíveis a partir de tubérculos de batata.

A morfologia geral é exibida aqui. A separação entre medula e parênquima perimedular é ilustrada com linhas pretas. O anel vascular, que separa o parênquima do córtex, é denotado com uma seta preta.

Os protoplastos isolados devem ser esféricos e simétricos com a membrana plasmática intacta. Observe a diferença de tamanho entre os protoplastos da folha e do tubérculo, bem como as diferenças de tamanho dentro de um tecido, o que pode indicar diferentes níveis de endorreduplicação. Esta figura mostra a variação nos resultados que podem ser encontrados nos gráficos de dispersão de citometria de fluxo e nos histogramas.

Os núcleos intactos mostram uma separação limpa entre os picos para quantificar a abundância relativa de células, enquanto as amostras integradas de picos mostram bases largas e sobrepostas. Nos gráficos de dispersão correspondentes, as caixas pretas indicam o bloqueio de eventos nucleares para histogramas e o agrupamento de eventos é refletido na largura dos picos do histograma. Este experimento que analisa os níveis de endorreduplicação ou IE confirma resultados anteriores de que o tecido medular exibe maior IE do que o tecido do córtex.

Surpreendentemente, o perfil do tecido do parênquima era semelhante ao córtex e também era significativamente diferente do tecido medular. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a esterilidade da amostra nas duas primeiras incubações, bem como manter as amostras no gelo o máximo possível após a lisada dos protoplastos. Após este procedimento, outros métodos, como a manipulação genética, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais genes influenciam os níveis de endorretroduplicação de tubérculos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair protoplastos de tubérculos de batata e prepará-los para citometria de fluxo para investigar seus níveis de endoreduplicação. Não se esqueça de que trabalhar com iodeto de propídio pode ser extremamente perigoso e precauções como EPI adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.