Name: Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a identificar proteínas de ligação ao DNA em loci específicos usando hibridação capturar de cromatina em células de mamíferos. Este método não requer manipulação genética nem anticorpos.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas P50HG004952 e R01GM109099 de MO.

1. capturar o Design do Oligonucleotide
<ol><li>
Desenha um painel de oligonucleotídeos para ser usado durante a captura de hibridação do alvo região/s.
	<ol>
<li>Objetivo 4 – 8 oligonucleotides por região de destino, mas como um mínimo de design, design do oligonucleotide pelo menos um direcionamento de cada extremidade da região de destino.</li>
		<li>Se a sequência de destino é longa (> 500 pares de bases), projetar os oligonucleotides como propagação para fora quanto possível para garantir o enriquecimento efetivo da cromatina em toda a região de destino inteiro. Nota: Observamos que captura ideal com oligonucleotídeos de 4 – 8. Mesmo que este processo pode funcionar bem com oligonucleotídeos mais, não é incomum observar uma diminuição do rendimento de enriquecimento quando muitos oligonucleotides são usados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design oligonucleotides com temperaturas de derretimento semelhantes e certifique-se de que eles não formam ganchos fortes nem ter interações fortes (tendo em conta que a hibridação será realizada no ᵒC 42). Nota: Se uma eluição de ponto de apoio é escolhida (4.12.3), uma sequência de base 8 externo adicional deve ser adicionado para do oligonucleotide e exigirá oligonucleotídeos complementares 'liberação' no momento da eluição17. Várias ferramentas de software comercial podem ser usadas para selecionar e analisar os oligonucleotides. 25 mers tem mostrado bons resultados, mas dependendo do tamanho do genoma e sequência, captura oligonucleotides podem conter em algum lugar entre 20 e 80 bases. Normalmente, captura oligonucleotides tem uma temperatura de fusão perto ᵒC 62, mas isso pode mudar dependendo de seu comprimento. Temperaturas de fusão consistentes e/ou comprimento do oligonucleotide em todo o mix de captura pode ajudar a evitar enviesamentos indesejados no enriquecimento.</li>
	<li>Desenha os oligonucleotides captura com um agrupamento de biotina (de preferência separado por um espaçador da sequência de captura) na extremidade 3'.</li>
</ol>2. cultura de pilha
<ol><li>
Cresce células lymphoblastoid humana (tais como GM12878 mostrado aqui) ou outras linhas de células em RPMI 1640 meios suplementados com 1% penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 5% de soro fetal bovino (FBS), a ᵒC 37 e 5% de CO2.
	<ol>
<li>Semente inicial congelado alíquotas (2 – 5 x 105 células) em um balão de T-25 com 6 mL de RPMI 1640 mídia preparada no ponto 2.1.</li>
		<li>Monitorar a densidade celular e viabilidade.<ol>
<li>Tome um representante alíquota de células e manchá-las com um corante apropriado como trypan azul.</li>
			<li>Medir a densidade de células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antes que a célula atinge a densidade de 1 x 106 células/mL, girar as células para baixo a 100 x g por 5 min e transferir as células para um balão de T-75 com 25 mL de RPMI 1640 mídia preparada no ponto 2.1. Cresce as células até a densidade celular se aproxima de 1 x 106 células/mL.</li>
		<li>As células de transferência para um balão de T-150 em 38 mL de RPMI 1640 mídia (2.1) e crescer as células por mais dois dias. Nota: Lymphoblastoid células crescem em suspensão. Orientações gerais para o cultivo de células lymphoblastoid recomendam densidades de célula a ser mantida entre 0,2 a 1 x 106 células/mL. Devido à grande quantidade de material necessário nesta tecnologia, o presente protocolo escrito propositadamente crescer células para uma densidade de celular, além do que é comumente usado. Protocolos de crescimento celular podem ser revistos e adaptados pelo leitor dependendo dos tipos de célula a ser usado.</li>
		<li>Girar as células para baixo a 100 x g por 5 min, Ressuspender as células em 10 mL de RPMI 1640 mídia (2.1) e despeje uma garrafa de rolo de2 850 cm contendo 500 mL de mídia a suspensão. Incubar as células sob as mesmas condições que antes, mas neste ponto iniciar usando a rotação constante (~0.5 rpm).</li>
		<li>Monitorar o crescimento de células e alterar a mídia quando necessário (normalmente a cada 3 – 4 dias). Deixe que as células crescem a uma densidade tão perto quanto possível a 2 x 106 células/mL (1 x 109 células no total).</li>
		<li>Uma vez que a contagem de célula desejada é atingida, colher as células girando as células para baixo a 100 x g por 5 min e ressuspender as células em 36 mL de RPMI 1640 mídia (2.1). Transferi a suspensão de células para um tubo cónico de 50 mL. Tome pequenas alíquotas para contagem de células e extração de DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crosslink, adicionando 1 mL de formol 37% para atingir uma concentração final de 1%. Cuidado: O formaldeído é uma substância cancerígena e deve ser tratado em uma coifa.<ol>
<li>Incube as celulas com rotação (~ 30 – 60 rpm) durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Saciar a reação de ligação cruzada adicionando 2 mL de uma solução de glicina de 2,5 M, para uma concentração final de 125 mM.</li>
		<li>Incube as celulas com rotação (~ 30 – 60 rpm) durante 5 min à RT. Pellet as células por centrifugação a 100 x g por 5 min e lavar as células duas vezes com gelo frio 1X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continue para o próximo passo ou resuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise celular (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inibidores de protease (PI)) e snap-congelar a suspensão gota a gota em nitrogênio líquido. Armazene as amostras em ᵒC-80. Nota: Preparar > 25 mL de tampão de lise celular sem Igepal e PI e adicionar os reagentes frescos quando estiver pronto para usar. Evite o armazenamento a longo prazo de lise celular uma vez Igepal e PI foram adicionados. Loja lise celular em 4 ᵒC por até 3 meses. Igepal é um detergente não iônico, não-desnaturação. NP-40 potencialmente pode ser usado como uma alternativa ao Igepal, mas nós não usamos isso neste contexto como NP-40 não é recomendado quando, eventualmente, amostras são analisadas por espectrometria de massa para caracterizar as proteínas de ligação do DNA.</li>
</ol>3. Lise e distorção
<ol><li>Preparar > 15 mL de tampão de lise de núcleos (10mm EDTA, pH 8.0, do Tris de 50mm 1% SDS, PI). Nota: Adicionar PI fresco, só para os montantes a ser usado. Evite o armazenamento a longo prazo de núcleos lise uma vez PI foi adicionado. Tampão de Lise núcleos pode ser armazenado no RT até 1 mês.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão de lise celular (contendo Igepal e PI). Deixe as pelotas descongelar no gelo e misture bem uma vez descongelados. Deixe amostras para um adicional 10 min no gelo. Centrifugar as células a 400 x g a 4 ᵒC por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 6 mL de tampão de Lise núcleos com PI (volume pode ser aumentado se as células não formam uma suspensão).</li>
	<li>
Em preparação para sonication, dividir a amostra uniformemente em ~ 6 – 8 tubos de microcentrífuga (600 a 1.000 µ l para cada tubo).
	<ol>
<li>Colocar as amostras no gelo ou um rack frio e proceda à sonicação a amostra usando um sonicador com um microtip. Usar a amplitude de 65% com 5 x 20 rajadas s constante, permitindo a suspensão esfriar pelo menos 40 s entre pulsos. Nota: Se aumentam volumes > 10 mL por exemplo, um copo de refrigeração célula pode ser usado em vez disso. Mais e mais explosões seria necessários então. Sonicators diferem grandemente. Condições podem ter que ser otimizado pelo leitor. Outras alternativas de sonication podem ser usadas também.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar as células a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ᵒC, transferir o sobrenadante para um tubo novo e descartar as pelotas.</li>
	<li>Estimativa total recuperação usando um método fluorométrica.</li>
	<li>Continue para o próximo passo ou snap-congelar e armazenar a amostra no ᵒC-80.</li>
	<li>Opcional: Tome uma alíquota, retrocesso ligações cruzadas incubando durante a noite no ᵒC 67 em 0,3 M de NaCl. Limpe o DNA e executá-lo no Bioanalyzer para determinar os comprimentos de fragmento. A maior parte dos fragmentos deve ser entre 500 e 1.000 bp. Nota: É Okey parar neste ponto e armazenar as amostras em ᵒC-80.</li>
</ol>4. hibridação captura
<ol><li>Preparar 500 mL de tampão de hibridização (Hyb) de 2x (200mm MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) e 500 mL de tampão de lavagem (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Armazene o Hyb e Buffers de lavagem em 4 ᵒC e temperatura, respectivamente, por até 3 meses. Use metade do buffer x Hyb 2 para preparar um 1x tampão de hibridização. Também armazená-lo em 4 ᵒC por até 3 meses. Nota: O volume total de captura a hibridação será duas vezes o volume da amostra resultante na etapa anterior (conforme descrito até agora, o volume da amostra seria de cerca de 6 mL e, portanto, o volume total de hibridação seria 12ml).</li>
	<li>Reserve grânulos igual a 5% do volume total de hibridização captura (600 µ l neste caso). Um ímã apropriado e adequado é necessário para trabalhar com os grânulos nas etapas a seguir.</li>
	<li>Lave os grânulos três vezes com 1 x Hyb Buffer usando duas vezes o volume de grânulos (1200 µ l). Resuspenda as contas em 1.200 µ l de 2 x Hyb Buffer. Coloque os tubos no ímã, até que a solução limpa e remover o tampão.</li>
	<li>Realize reações de Pre-esclarecimento em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com um máximo de 700 µ l de amostra por tubo. Adicione suficiente grânulos (5%) e 2 x Hyb Buffer para diluir o buffer Hyb 1 x (10 tubos com 600 µ l de amostra, 120 µ l de grânulos lavados resuspended em 2 x Hyb Buffer e 480 µ l de 2 x Hyb Buffer). Incube-os durante 10 minutos a 31 ᵒC com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm).</li>
	<li>Coloque os tubos em um ímã até grânulos são imobilizados e transferir as amostras para tubos novos. Descarte os grânulos. Nota: A partir daí, os tubos de ligação de baixo são recomendados.</li>
	<li>Resuspenda os oligonucleotides de captura para uma solução de trabalho de 10 pmol / µ l e adicionar 4 µ l desta solução para cada tubo. Nota: Diferentes regiões podem atuar como controle para o outro, mas é recomendável incluir do oligonucleotide captura com sua sequência que se esforçavam para servir como um controle negativo.</li>
	<li>Incubar os tubos por 40 min em 42 ᵒC com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm).</li>
	<li>Durante a incubação, separe as contas necessárias (0,3 µ l/pmol de captura do oligonucleotide). Lave os grânulos três vezes, conforme descrito na etapa 4.3, mas Ressuspender as células em 1 x Hyb Buffer.</li>
	<li>Adicione as contas lavadas à amostra e incubar as amostras por 30 min em RT com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm). Coloque os tubos sobre o ímã e remover o sobrenadante, uma vez que as contas têm sido imobilizadas.</li>
	<li>
Os grânulos de lavagem
	<ol>
<li>Adicionar 1,2 mL de tampão de lavagem e incubar a amostra por 5 min com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm) em tubos de RT. lugar sobre o ímã e esperar um par de min até solução limpa. Retire o tampão e repita este passo.</li>
		<li>Adicionar 1,2 mL de tampão de lavagem e incube-lo para 1 h com final mais rotação final (~ 30-60 rpm) em RT. Coloque os tubos sobre o ímã e esperar uns minutos até solução limpa. Retire o tampão e repita esta etapa, reduzindo o tempo de incubação a 30 min do segundo tempo.</li>
		<li>Adicionar 200 µ l de tampão de lavagem e incube por 15 min com final mais rotação final (~ 30 – 60 rpm) em 31 de ᵒC. Coloque os tubos sobre o ímã e esperar uns minutos até solução limpa. Retire o tampão.</li>
		<li>Adicionar 200 µ l de PBS e incubá-lo por 5 min com final sobre rotação final (~ 30 – 60 rpm) em RT. Coloque os tubos sobre o ímã e esperar uns minutos até solução limpa. Retire o tampão e repita este passo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eluição simples
	<ol>
<li>Adicionar 40 µ l de água molecular grau aos talões e incuba-lo em 94 ᵒC por 5 min.</li>
		<li>Coloque os tubos sobre o ímã e aguarde alguns minutos até que a solução limpa.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante para um tubo novo. Descarte os grânulos.</li>
		<li>Proceder à análise proteômica ou armazenar a amostra no ᵒC-80. Nota: Este tipo de eluição funciona bem para análise posterior da qPCR e algumas medidas de proteômica, mas em outras instâncias duas abordagens alternativas descritas abaixo rendimento eluídos "limpador".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eluição de DNase.
	<ol>
<li>Adicione 40 µ l de tampão de DNase 1x e 2 U de DNase para cada tubo.</li>
		<li>Incube os tubos por 15 min a 37 ᵒC.</li>
		<li>Coloque os tubos em um ímã e esperar uns minutos até que a solução limpa.</li>
		<li>Retire as amostras eluted as contas e colocar as amostras em um novo tubo de ligação de baixa.</li>
		<li>Incube o tubo em 94 ᵒC por 7 min inativar a enzima e proceder à análise proteômica. Nota: Concentrações de DNase podem ser usadas se for observada interferência com análises proteômica. Não será possível calcular os avanços de captura por qPCR se este método de eluição é usado desde o tratamento de DNase destrói completamente o material de DNA na amostra.</li>
		<li>Proceder à análise proteômica ou armazenar a amostra no ᵒC-80.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ponto de apoio da eluição17. Nota: Este método não é recomendado para oligonucleotides mais longos (> 40 bases). Este método requer para os oligonucleotides captura conter uma bases 8 adicionais que não se sobrepõem com a sequência genômica e oligonucleotides lançamento complementar para deslocar o alvo dos oligonucleotides de captura.<ol>
<li>Dilua 2 nanomoles de oligonucleotídeos de lançamento em 40 µ l de tampão SSC.</li>
		<li>-Incubar por 20 min no RT</li>
		<li>Coloque os tubos em um ímã e aguarde alguns minutos até que a solução limpa.</li>
		<li>Remova a solução de grânulos.</li>
		<li>Proceder à análise proteômica ou armazenar a amostra no ᵒC-80.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. avaliação de capturar rendimento por qPCR com Primers para a região de capturar alvo de interesse
<ol><li>Use um software adequado ou ferramenta on-line para projetar primers e sondas para a região de destino. Nota: Neste experimento, foram alvejados na região promotora do DUSP3 e DUSP5 . Os primers e sondas utilizadas são os seguintes. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, cartilha 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-rotulado sonda - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, cartilha 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-rotulado sonda TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.</li>
	<li>Tomar uma alíquota do eluato (não mais de 10 µ l) e diluir 01:10 com molecular da classe H2O.</li>
	<li>Extrair o DNA de uma das alíquotas tomadas na etapa 2.1.7 e usar aquela amostra de DNA para fazer uma curva padrão fazendo cinco serial 01:10 diluições em molecular grau H2O.</li>
	<li>Preparar uma mistura de mestre qPCR (grande variedade de alternativas comerciais), adicionar primers e sondas e dosear a quantidade adequada (15 µ l se executando uma reação de 20 µ l) em cada poço.</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de qualquer: a) diluído a amostra, b) a curva padrão ou classe c) molecular H2O (para servir como nenhum modelo de controle) para cada poço.</li>
	<li>Selar a placa e centrifuga-lo a 100 x g por 1 min.</li>
	<li>Executar em um sistema de qPCR com os seguintes parâmetros: 5 min à 95 ᵒC seguido de 40 ciclos de ᵒC 95 por 20 s, 59 ᵒC por 20 s e 72 ᵒC para 25 s.</li>
	<li>Use a curva padrão para rendimentos de bundas e captura ovos mexida para avaliar a especificidade de captura.</li>
</ol>

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</ol>

Há não há conflitos de interesse a divulgar.

O método de HyCCAPP descrito aqui tem muitas características únicas que a tornam uma poderosa abordagem para desvendar o DNA-interações que caso contrário permaneceria indescritíveis. A natureza do processo dá HyCCAPP a flexibilidade para trabalhar em diferentes organismos e regiões do genoma. É um método, no entanto, que tem várias limitações para ser considerada.
HyCCAPP é um método que evita quaisquer modificações de célula para que potencialmente pode ser aplicada em células primárias, sis...

Durante a última década, tem visto uma melhora dramática em tecnologias de sequenciamento, permitindo o estudo de uma ampla gama de genomas em grande número de amostras e com resolução surpreendente. O consórcio livre de elementos de DNA (ENCODE), um esforço multi-institucional em grande escala, liderado pelo National Human Genome Research Institute dos National Institutes of Health, forneceu insights individuais como fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras ligam e interagirem com o genoma. O esforço inicial caracteriza-se interações específicas do ADN-proteína, avaliada por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para ligação a DNA conhecido mais de 100 proteínas1. Métodos alternativos como DNase footprinting2 e formaldeído assistido isolamento de elementos reguladores (FAIRE)3 também têm sido usados para localizar regiões específicas do genoma, interagindo com as proteínas, mas com a limitação óbvia que essas abordagens experimentais não identificar as proteínas interagindo. Apesar dos esforços de extensivos nos últimos anos, nenhuma tecnologia emergiu que eficientemente permite a caracterização abrangente das interações proteína-ADN da cromatina e a identificação e quantificação de proteínas da cromatina associada.
Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma nova abordagem que nós denominado como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas para proteômica (HyCCAPP). Inicialmente desenvolvido na levedura4,5,6, a abordagem isola quitosana cromatina as regiões de interesse (com proteínas acopladas) usando captura de hibridação de sequência específica. Após o isolamento dos complexos proteína-ADN, abordagens como a espectrometria de massa podem ser usadas para caracterizar o conjunto de proteínas vinculada à sequência de interesse. Assim, HyCCAPP pode ser considerado como uma abordagem não-tendencioso para descobrir romance interações DNA-proteína, no sentido de que ele não depende de anticorpos e isso é completamente agnóstica sobre as proteínas que podem ser encontradas. Existem outras abordagens capazes de descobrir o romance de proteínas DNA-interagindo7, mas dependem mais de ChIP-como métodos8,9,10, plasmídeo inserções11,12, 13,14, ou regiões com alta copiar números15. Em contraste, HyCCAPP pode ser aplicado às regiões de multi e single-cópia, e não exige qualquer informação prévia sobre as proteínas na região. Além disso, enquanto alguns dos métodos mencionados acima têm recursos valiosos, nomeadamente, evitando a necessidade para reações de reticulação do ADN-proteína, a característica única de HyCCAPP é que pode ser aplicado às regiões de cópia única no não modificado células e sem qualquer conhecimento prévio sobre proteínas putativo, ou anticorpos disponíveis.
Neste ponto, HyCCAPP predominantemente foi aplicada à análise de diversas regiões genômicas em levedura4,5,6e recentemente foi usado para analisar as interações proteína-ADN no DNA alfa-satélite, uma região de repetição no genoma humano16. Como parte do nosso trabalho em curso, adaptámos a abordagem de captura de hibridização inicialmente desenvolvida por cromatina de fermento a ser aplicável para a análise de células humanas e apresento aqui um protocolo modificado que permite a captura seletiva de destino de cópia única regiões no genoma humano com eficiência semelhante ao nossos estudos iniciais no fermento. Agora, este novo protocolo otimizado permite a adaptação e utilização da tecnologia para interrogar interações proteína-ADN através do genoma humano, utilizando espectrometria de massa ou outras abordagens analíticas.
É importante ressaltar que o método de HyCCAPP destina-se a análise de regiões-alvo específicos e ainda não é apropriado para análises de todo o genoma. A tecnologia é especialmente útil quando se lida com as regiões para as quais existe escassa informação sobre proteínas interagindo, ou quando uma mais abrangente análise aprofundada das proteínas interagindo em um locus específico do genoma é desejada. HyCCAPP destina-se a descobrir proteínas DNA-ligando mas não caracterizar com precisão os sites de ligação de proteínas específicas no DNA genômico. Em sua implementação atual, a metodologia não fornece informações sobre as sequências de ADN obrigatória ou motivos para proteínas individuais. Portanto, bem complementa tecnologias existentes, como FAIRE e pode permitir a identificação de novas proteínas nas regiões genômicas identificado por uma análise inicial de FAIRE.

<table><tbody><tr><td>Ferramenta PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td>Analyze captura oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>PairFold</td><td>UBC</td><td></td><td>Analisa interações</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>850 cm2 garrafa de rolo&nbsp;</td>Sistema <td>de Rolo 680058</td><td></td> <td>Greiner Bio-one</td></tr><tr><td></td><td>Wheaton</td><td>22-288-525</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeído&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier digital Branson SFX 150</td><td>Emerson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 fluorômetro</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR kit de ensaio</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>MES sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>5M Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ímã Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ímã DynaMag-15</td><td>Thermo Fisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 atreptavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baixa ligação</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>SciGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de tubos e rotador</td><td>Thermo Fisher</td><td>415110Q</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (livre de RNase)</td> <td>New England BioLabs</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>SSC buffer 20&vezes; concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

A captura de hibridação de proteínas da cromatina associada para tecnologia de proteômica (HyCCAPP) foi desenvolvida inicialmente para descobrir romance interações DNA-proteína no fermento. Ele permite a análise de uma região alvo de interesse sem a necessidade de conhecimento prévio sobre proteínas provavelmente vinculados à região de destino. Isso, em teoria, permite que HyCCAPP a ser usado para analisar qualquer região genômica de interesse, e fornece flexibilidade suficiente para trabalhar em sistemas de células diferentes. Este método não pretende estudar locais obrigatórios conhecidos de factores de transcrição, uma tarefa que valorizaria imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e ChIP-como métodos. A força do HyCCAPP reside em sua capacidade de explorar as regiões de ADN para o qual é limitado ou nenhum conhecimento sobre as proteínas associados a ele. Também pode ser um método conveniente para evitar enviesamentos (presente no ChIP, como métodos) introduzidos pelo enriquecimento à base de proteínas da cromatina usando anticorpos. Potencialmente, HyCCAPP pode ser uma ferramenta poderosa para descobrir verdadeiramente novas interações DNA-proteína. Até à data, a tecnologia foi predominantemente aplicada para células de levedura ou sequências de repetição de cópia elevada em células de mamíferos. Para se tornar a ferramenta poderosa que montamos, abordagens HyCCAPP precisam ser otimizado para capturar eficientemente cópia única loci em células de mamíferos. Aqui, apresentamos a nossa adaptação do fermento inicial HyCCAPP capturar protocolo para linhas de células humanas e mostrar que as regiões de cromatina de cópia única podem ser eficientemente isoladas com este protocolo modificado.

Devido a necessidade de grandes quantidades de entrada de cromatina para HyCCAPP ter sucesso, as células são cultivadas a níveis relativamente elevados de confluência. Trypan coloração azul é usada para confirmar que as taxas de morte celular são moderadas (&lt; % 10). Em experimentos de cópia única, conteúdo de cromatina antes da captura da hibridização precisa ser na faixa de femtomolar, que geralmente exige pelo menos 109 células, como material de partida. Antes de experiênc...

Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em nossa compreensão da regulação do genoma, como como as variantes de sequência associadas a doenças em regiões não codificantes afetam a expressão e regulação gênica alterando a ligação às proteínas, e pode ajudar a identificar essas proteínas. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer nenhum tipo de manipulação genética de células ou tecidos, nem anticorpos, e nenhum conhecimento prévio de proteínas de ligação ao DNA que possam interagir com o DNA naquele locus. Demonstrando este procedimento estará Danu Perumalla, um técnico do meu laboratório.Após o desenho dos oligonucleotídeos de acordo com o protocolo de texto, colocar 2 a 5 vezes 10 nas 5ª células linfoblastóides, ou outras linhagens celulares, em um frasco T25 com 6 mililitros de meio RPMI 1640, suplementado com 1% de Pen Strep, 2 mil ou mais de L-glutamina e 5% de FBS. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Use um hemocitômetro ou um contador de células automatizado para medir a densidade celular.Antes que as células atinjam 1 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro, gire-as a 100 vezes G por cinco minutos e transfira-as para

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a...

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Aqui, apresentamos um protocolo para automatizar a análise de modificação pós-translacional de histonas de célula única usando uma estratégia de rotulagem isotópica de dois plexos e digestão com ArgC. Esse fluxo de trabalho permite um perfil quantitativo, reproduzível e de alta sensibilidade da heterogeneidade da cromatina e respostas epigenéticas em resolução de célula única.

Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2)

Aprenda a identificar proteínas de ligação ao DNA em loci específicos usando hibridação capturar de cromatina em células de mamíferos. Este método não requer manipulação genética nem anticorpos.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

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