Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em nossa compreensão da regulação do genoma, como como as variantes de sequência associadas a doenças em regiões não codificantes afetam a expressão e regulação gênica alterando a ligação às proteínas, e pode ajudar a identificar essas proteínas. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer nenhum tipo de manipulação genética de células ou tecidos, nem anticorpos, e nenhum conhecimento prévio de proteínas de ligação ao DNA que possam interagir com o DNA naquele locus. Demonstrando este procedimento estará Danu Perumalla, um técnico do meu laboratório.

Após o desenho dos oligonucleotídeos de acordo com o protocolo de texto, colocar 2 a 5 vezes 10 nas 5ª células linfoblastóides, ou outras linhagens celulares, em um frasco T25 com 6 mililitros de meio RPMI 1640, suplementado com 1% de Pen Strep, 2 mil ou mais de L-glutamina e 5% de FBS. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Use um hemocitômetro ou um contador de células automatizado para medir a densidade celular.

Antes que as células atinjam 1 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro, gire-as a 100 vezes G por cinco minutos e transfira-as para um frasco T75 com 25 mililitros do meio RPMI 1640 preparado anteriormente neste vídeo. Cultive as células até atingir uma densidade celular de 1 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro, depois transfira as células para um frasco T150 em 38 mililitros do mesmo meio e cultive-as por mais dois dias. Em seguida, gire as células a 100 vezes G por cinco minutos e ressuspenda-as em 10 mililitros de meio RPMI 1640.

Em seguida, despeje a suspensão em um frasco de rolo de 1850 centímetros quadrados contendo 500 mililitros de meio e incube as células nas mesmas condições de antes, exceto com rotação constante. Assim que a contagem de células desejada for atingida, gire a cultura a 100 vezes G por cinco minutos e ressuspenda as células em 36 mililitros de meio RPMI 1640. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e remova pequenas alíquotas para contagem de células e extração de DNA.

Para reticular as células, adicione 1 mililitro de formaldeído a 37% para atingir uma concentração final de 1% Em seguida, incube as células a 10 a 30 RPM em temperatura ambiente por 10 minutos. Extinguir a reação de reticulação adicionando 2 mililitros de uma solução de glicina 2,5 molar para uma concentração final de 125 milimolar. Em seguida, incube as células com rotação por cinco minutos.

Depois de peletizar as células por centrifugação, use PBS 1X gelado para lavar as células duas vezes. Continue com a lise e o corte das células, ou ressuspenda o pellet em 5 mililitros de tampão de lise celular e congele a suspensão gota a gota em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.

Para realizar a lise e o corte, ressuspenda o pellet em 20 mililitros de tampão de lise celular. A centrífuga das células a 400 vezes G, a 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 6 mililitros de tampão de lise de núcleos com inibidores de protease.

Na preparação para a sonicação, divida a amostra uniformemente em seis a oito tubos de microfuga. Coloque as amostras no gelo ou em uma grade fria e use um sonicador com uma microponta para sonicá-las a 65% de amplitude com cinco rajadas constantes de 20 segundos, permitindo que a suspensão esfrie por pelo menos 40 segundos entre os pulsos. Centrifugar as células a 12 000 vezes G e a 4 graus Celsius durante 10 minutos, depois transferir o sobrenadante para um novo tubo e rejeitar os sedimentos.

Depois de estimar a recuperação total usando fluorometria, congele as amostras. Após a preparação dos tampões de hibridização e lavagem de acordo com o protocolo de texto, use 1.200 microlitros de tampão de hibridização 1X para lavar 600 microlitros de grânulos três vezes. Em seguida, use 1.200 microlitros de tampão de hibridização 2X para ressuspender os grânulos.

Em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, adicione 600 microlitros de amostra, 120 microlitros de grânulos lavados suspensos em tampão de hibridização 2X e 480 microlitros de tampão de hibridização 2X. Incube os tubos a 31 graus Celsius e 30 a 60 RPM por 10 minutos. Em seguida, coloque os tubos em um ímã, até que as contas estejam imobilizadas, e transfira as amostras para novos tubos antes de descartar as contas.

Ressuspenda os oligonucleotídeos de captura em uma solução de trabalho de 10 picomoles por microlitro e adicione 4 microlitros dessa solução a cada tubo. Incube os tubos a 42 graus Celsius em 30 a 60 RPM por 40 minutos. Durante a incubação, reserve os grânulos necessários, lave os grânulos três vezes como antes, mas desta vez use o tampão de hibridização 1X para ressuspendê-los.

Adicione as esferas lavadas aos tubos e incube as amostras a 30 a 60 RPM em temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque os tubos no ímã e remova o sobrenadante assim que as contas forem imobilizadas. Depois de lavar as contas, eluir a amostra adicionando 40 microlitros de água de grau molecular e incubar os tubos a 94 graus Celsius por cinco minutos.

Coloque os tubos no ímã e espere alguns minutos até que a solução desapareça, depois transfira o sobrenadante para um novo tubo e descarte as contas. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius ou prossiga para a análise proteômica de acordo com o protocolo de texto. Para avaliar o rendimento de captura, use água de grau molecular para diluir uma alíquota do eluato, de um a dez.

Depois de extrair o DNA de uma alíquota tirada anteriormente no vídeo, use a amostra de DNA e a água de grau molecular para preparar uma curva padrão, com cinco diluições seriais de um a dez. Prepare uma mistura mestre de qPCR adicionando primers e sondas e dispense a quantidade apropriada em cada poço da reação. Para cada poço, adicione 5 microlitros da amostra diluída, da curva padrão ou de água de grau molecular para servir como controle sem modelo.

Feche a placa e gire-a a 100 vezes G por um minuto. Em seguida, execute as amostras em um sistema qPCR usando os parâmetros encontrados no protocolo de texto. Por fim, use a curva padrão para avaliar os rendimentos e a captura embaralhada para avaliar a especificidade da captura.

Aqui são mostradas as capturas de hibridização usando uma titulação de oligonucleotídeos. O número de oligonucleotídeos é aumentado gradualmente, enquanto a concentração total é mantida constante. Este experimento ajuda a determinar quantos oligonucleotídeos diferentes são necessários para atingir eficiências de hibridização ideais.

Ele também revela quaisquer interações óbvias de hibridização prejudicial entre um conjunto específico de oligonucleotídeos e se há oligos com baixa especificidade, resultando em alto fundo. Uma grande proporção de fragmentos na cromatina reticulada não será passível de captura de hibridização. Se a captura de hibridização for executada com sucesso, um experimento de captura subsequente do mesmo material de cromatina, usando um conjunto diferente de oligonucleotídeos de captura, resultará em rendimentos comparáveis aos do uso de cromatina fresca.

No entanto, em um segundo experimento de captura usando os oligos originais e a cromatina restante do primeiro experimento, o rendimento diminuirá aproximadamente 90% se a maior parte do material passível de hibridização tiver sido capturada no primeiro experimento. Esta figura mostra a captura de hibridização de diferentes regiões-alvo cromossômicas, com cada região servindo como um controle negativo para a outra. Uma sequência embaralhada também serve como um verdadeiro controle negativo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar os oligonucleotídeos de captura primeiro, para garantir que a região desejada seja passível de captura de hibridização. Após esse procedimento, outros métodos, como a imunoprecipitação da cromatina, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como onde mais no genoma as proteínas de interação de DNA identificadas se ligam.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o HyCCAPP para enriquecer as regiões genômicas de interesse com o objetivo de identificação de novo das interações proteicas locais.