Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição

O objetivo geral deste experimento é digerir moléculas de DNA marcadas com fluorescência com enzimas de restrição sensíveis à metilação e não metilação e determinar a taxa de digestão do experimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da química ou da biologia, como a genômica. A vantagem desse método é que um cientista pode digerir o DNA pré-corado com uma enzima para determinar se o DNA está completo após a conclusão de um experimento diferente.

Demonstrando o procedimento estará Drew Thompson, um estudante de graduação do meu laboratório. Para fazer um gel de agarose a 0,7%, pese 1,4 gramas de agarose de alta temperatura gelificante em um frasco Erlenmeyer. Em seguida, adicione 200 mililitros de 1x tampão TAE e coloque um copo invertido em cima do frasco.

Aquecer a solução numa placa quente até que se comecem a formar bolhas no fundo do balão e flutuar para cima. Retirar a solução da placa de aquecimento e deixar arrefecer até que o balão possa ser tocado com a mão desprotegida. Em seguida, despeje o gel em um molde de gel de 24,5 centímetros por 21,8 centímetros com um pente de gel para criar poços.

Use uma ponta de pipeta para estourar as bolhas perto do pente ou na superfície do gel e deixe o gel solidificar por pelo menos 15 minutos. Para corar o DNA lambda em seis concentrações diferentes de corantes, comece usando 1x TE para preparar 300 microlitros de 100 nanogramas por microlitro de DNA lambda. Armazene a solução a quatro graus Celsius.

Ao preparar uma amostra para cada uma das seguintes concentrações de corante para cada banda esperada em um resumo de restrição, corar 75 a 100 nanogramas de DNA lambda não metilado. Incube as amostras a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, para determinar se uma enzima de restrição pode digerir o DNA corado, adicione 20 unidades de enzima de restrição, três microlitros do tampão apropriado com a maior eficiência de corte e água destilada autoclavada e filtrada para uma reação de 30 microlitros.

Coloque as reações em banho-maria na atividade enzimática ideal e incube-as por duas a quatro horas. Em seguida, pare as reações adicionando dois microlitros de EDTA 0,5 molar pH 8,0. Remova as laterais do molde de gel previamente preparado e coloque o gel na caixa de eletroforese de gel.

Despeje 2,5 litros de 1x tampão TAE na caixa. Em seguida, remova cuidadosamente o pente de gel do gel para que os poços fiquem acessíveis. Pipete as reações da enzima de restrição em um filme plástico e, para cada solução de reação, adicione um microlitro de corante de carga 6x por cinco a seis microlitros de solução de DNA.

Em seguida, pipete as reações nos poços. Misture um microlitro de uma escada kilobase, nove microlitros de 1x TE e dois microlitros de corante de carga 6x. Em seguida, carregue a solução nos poços que flanqueiam as outras soluções.

Cubra a caixa de gel com um papel ou tecido azul escuro ou preto e, em seguida, conecte a caixa de gel a uma fonte de alimentação. Defina a fonte de alimentação para 30 volts e execute-a durante a noite. Apague as luzes enquanto o gel estiver funcionando para evitar a fotoclivagem do DNA marcado.

Na manhã seguinte, transfira o gel da bandeja para um recipiente com 45 microlitros de brometo de etídio e um litro de 1x tampão TAE. Armazene o recipiente em temperatura ambiente no escuro ou cubra-o com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Deixe o gel agir por pelo menos 45 minutos em temperatura ambiente.

Para obter imagens do gel, coloque-o em cima de um transiluminador de luz azul, que emite uma saída de luz máxima entre 400 a 500 nanômetros. Tire fotos com uma câmera acoplada à estação. Determine a taxa de digestão para o experimento de acordo com o protocolo de texto.

A eficiência enzimática é determinada dividindo o número total de bandas esperadas pelo número de bandas visíveis. Além disso, para determinar o tamanho aproximado das bandas, é necessário um controle para saber onde as moléculas de DNA nativas são esperadas em comparação com o DNA corado. A mobilidade das bandas nas pistas três e quatro diminuiu, fazendo com que as bandas se aproximem dos poços.

Nessas pistas, a quantidade de corante não afeta visivelmente a mobilidade, então as faixas correspondem ao controle. As pistas cinco e seis mostram mais bandas do que o controle, o que indica digestão parcial, sugerindo que os corantes afetaram a clivagem nos locais de reconhecimento. Neste experimento, todas as bandas esperadas são vistas para todas as concentrações de corante, de modo que os dados não interferiram na digestão do DNA.

Para ver como a mobilidade mudou à medida que a concentração do corante YOYO-1 aumentou, asteriscos coloridos foram inseridos ao lado de cada banda. Por exemplo, as bandas de 3,5 kilobase têm asteriscos vermelhos ao lado delas em cada concentração de YOYO-1. As faixas inesperadas nas pistas cinco e seis não têm um asterisco ao lado das faixas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de cobrir o gel com um pedaço de papel escuro e completar a execução do gel em uma sala escura. Além disso, certifique-se de usar tubos escuros para suas reações. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como digerir moléculas de DNA coradas com fluorescência com enzimas de restrição e determinar a taxa de digestão da reação.

Não se esqueça de que trabalhar com brometo de etídio pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções como usar luvas e óculos de segurança devem ser tomadas durante a execução do procedimento. Além disso, certifique-se de usar óculos de segurança apropriados ao usar um transiluminador.