Name: Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda a gerar mapas de sincronismo de replicação de DNA em embriões de zebrafish em diferentes estágios de desenvolvimento. Este método in vivo permite estudar mudanças na cromatina e sua influência na iniciação da replicação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências do National Institutes of Health, através de concede 5P20GM103636-02 (incluindo suporte de núcleo de citometria de fluxo) e 1R01GM121703, bem como prêmios do centro de Oklahoma para células-tronco adultas Pesquisa.

Todos os animais foram tratados em estrita conformidade com protocolos aprovados pelo Comitê de uso e Oklahoma Medical Research Foundation institucional Animal Care.
1. criação de zebrafish adulto para reprodução
<ol><li>Use uma grande coorte de adultos do zebrafish masculino e feminino de uma cepa única para reprodução. Existem pequenas diferenças na composição genética de zebrafish de sequer uma única tensão, use uma grande coorte para garantir resultados representativos da variabilidade genética da população e não restrito a um pequeno subconjunto da população.</li>
	<li>Na noite antes de embriões serão coletados, lugar dezenas de adultos reprodutores em tanques de reprodução, use aproximadamente igual número de machos e fêmeas. Dependendo do experimento, use uma das seguintes estratégias de reprodução.<ol>
<li>Criação de estratégia 1: Coloque alguns zebrafish masculino e feminino em tanques de criação individual, separar os machos das fêmeas com um divisor. Se esta perspectiva é usada, configurar muitos tanques de reprodução diferentes e juntar os embriões de cada um para assegurar que a variabilidade biológica é representativa da população.</li>
		<li>Criação de estratégia 2: combinar dezenas de zebrafish masculino e feminino em um aquário grande. Use esta estratégia, enquanto há um número suficientemente grande de embriões, é razoável supor que eles vieram de uma variedade de fundadores e são, portanto, geneticamente representativa da população.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. timed acasalamentos - coleta, classificação e embriões de zebrafish para experiências de habitação
<ol><li>Realize acasalamentos cronometrados, começando assim a luz ciclos sendo pela manhã. Descarte qualquer embriões gerados durante a noite.</li>
	<li>Permitir que peixes procriem em águas rasas (3-5 cm) por um período de 10 min, com um fundo falso para embriões escapar.</li>
	<li>Depois de 10 min, colete embriões derramando através de um filtro e enxaguar em uma placa de 10 cm com uma garrafa de lavagem. Piscina, todos os embriões coletados no mesmo ponto do tempo, marcá-los com o tempo de coleta e o lugar imediatamente em uma incubadora a 28,5 ° C.</li>
	<li>Centenas de embriões podem ser esperadas de um único par de acasalamento em um dia. Permitir que adultos procriarem min 10 ciclos até que o número de embriões obtidos tem menos de vinte anos.</li>
	<li>Aproximadamente 1-1,5 h após a coleta, tipo de embriões para remover embriões mortos e não fertilizados. Para classificar os embriões, retirar da incubadora e observar ao microscópio dissecação.<ol>
<li>Embriões de contagem e o lugar em uma densidade de 100 embriões por placa de 10 cm.</li>
		<li>Adicionar o meio fresco de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4) e retorno de embriões para a incubadora de 28,5 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dechorionate, deyolk e fixar os embriões de zebrafish
Nota: Esta seção do protocolo destina-se aos embriões antes da fertilização post de 48 h (hpf). Não há nenhuma necessidade de remover os chorions de embriões em fases posteriores do desenvolvimento (após 48 hpf), como muitas vezes naturalmente caem. Não há nenhuma necessidade de deyolk ou remover os chorions de peixe mais velho os 5 dias pós fertilização (dpf).
<ol><li>Quando embriões atingem a idade do desenvolvimento desejada, verifique se a fase do desenvolvimento morfologicamente sob um microscópio de luz de acordo com "Estágios de embrionário desenvolvimento de Zebrafish"17.</li>
	<li>Transferência de até 1500 embriões encenados para um tubo cônico de 15 mL e lave várias vezes com a E3.<ol>
<li>Adicionar 1 mL de E3 e 20 µ l de solução Pronase (30 mg/mL) para cada 100 embriões e agite suavemente. Até 1500 embriões podem ser dechorionated em um único tubo com 15 mL de E3.</li>
		<li>Colocar o tubo de lado e organizar os embriões em uma camada uniforme para garantir a máxima superfície à relação do volume. Suavemente agite o tubo a cada 2-3 min até todos os chorions caíram fora os embriões. O tempo total de dechorionation irá variar dependendo da atividade Pronase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover o sobrenadante e lavar delicadamente embriões 3 vezes com 10ml de E3. Coloque os embriões no gelo para o restante desta seção do protocolo.</li>
	<li>Retire E3 e lave os embriões com buffer deyolking gelada preparada na hora (0,5 x solução de Ringer peixe de Ginzburg, sem cálcio: 55 mM NaCl, 1.8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO3).<ol>
<li>Adicione 1 mL de tampão de deyolking gelada para até 500 embriões.</li>
		<li>Usando um P1000, delicadamente Pipetar embriões acima e para baixo 5 - 10 vezes para interromper o saco vitelino.</li>
		<li>Transferi 1 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugar a 4 ° C e 500 x g por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova o sobrenadante e lavar o sedimento com 1 mL de PBS gelado 1x (solução salina tamponada fosfato, pH 7.0) para remover a solução de Ringer. Centrifugar a 4 ° C e 500 x g durante 5 min.</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de 1X PBS. Colocar o tubo no gelo.</li>
	<li>Adicione 3 mL de etanol gelado (EtOH) para um tubo cônico de 15 mL. Tubo de vórtice de EtOH suavemente na regulação baixa.<ol>
<li>Usando um P1000, lentamente (1 gota por segundo) gotejamento zebrafish embrião suspensão de células em EtOH enquanto num Vortex suavemente.</li>
		<li>Adicionar um total de 1 mL de suspensão de células do embrião, para uma solução de fixação final de 75% EtOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de 1 mL de célula suspensão foi adicionado, suavemente redemoinho tubo para misturar e colocar a-20 ° C durante pelo menos 1 h. Recomenda-se colocar os tubos no lado para garantir a máxima superfície à relação do volume e reduzir o número de embriões e células que ficam juntos. Armazenar as células do embrião a-20 ° C durante 2-3 semanas.</li>
</ol>4. coloração de DNA e FACS triagem de embriões
Nota: Esta seção do protocolo destina-se aos embriões em 1 dpf.
<ol><li>Remova células de embrião de EtOH-fixo de-20 ° C e centrifugar a 4 ° C 1500 x g por 5 min.<ol>
<li>Colocar o tubo no gelo e cuidadosamente remover sobrenadante. Usando um P1000, delicadamente Ressuspender as células em 1 mL de acabadas frio PBS-BSA (1X PBS, 1% de albumina de soro bovino).</li>
		<li>Centrifugar as células a 4 ° C e 1500 x g durante 5 min e colocar no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover sobrenadante e ressuspender as células em iodeto de propidium (PI) solução (50 µ g/mL PI, 100 µ g/mL RNase A, PBS, pH 7,0), de coloração usando 200 µ l para cada 1000 embriões.<ol>
<li>Permitir que as células incubar em solução de PI por 30 min no gelo, misturando suavemente a cada 5 min.</li>
		<li>Coloque um filtro de célula de nylon de 40 µm em um tubo cónico de 50 mL no gelo. Delicadamente, pipete células para misturar e filtrar através da malha. Nota: Se vários tubos de embriões de commit a mesmas foram coletados na secção 3 do protocolo, combine estes embriões neste momento para que eles são todos classificados juntos.</li>
		<li>Usando o plano dentro do final de um êmbolo da seringa, delicadamente perturbar qualquer restantes aglomerados de células na malha.</li>
		<li>Enxague as células através do filtro com 500 µ l de PBS-BSA frio para cada 1000 embriões.</li>
		<li>Coloque uma malha 40 µm sobre um tubo cônico de 15 mL no gelo e filtrar a suspensão de células do tubo cónico de 50 mL uma segunda vez para o tubo de 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando um celular adequado instrumento de classificação, defina a excitação do laser para detecção de 561-nm e emissão a 610/20 para detectar iodeto de propidium.<ol>
<li>Tubo de mistura 15 mL de células coradas brevemente pela utilização do Vortex e lugar no instrumento a 4 ° C.</li>
		<li>Taxa de execução de células em um fluxo lento, idealmente de 1,0 mL/min, a fim de obter um perfil limpo ciclo celular e evite misturar G1 ou G2/M células com o S população de fase.</li>
		<li>Primeiro, portão para FSC-A x SSC-A (área de dispersão para a frente pela área de dispersão lateral) para remover os resíduos (figura 1A). Nota: Células de embriões podem ser diferentes tamanhos dependendo do tipo de palco e celular. O filtro de densidade neutra (ND) talvez precise ser alternado entre 1,0 e 1,5 dependendo do tamanho das células presentes. Portão de uma grande área para recolher a maioria das células e remover os resíduos.</li>
		<li>Segundo, portal para SSC-área (SSC-A) pela área de PI (PI-A), para remover detritos e célula parelhas (figura 1B).</li>
		<li>Em terceiro lugar, portão para SSC-A por SSC-W (largura) para remover qualquer restantes parelhas de célula (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exibir as populações fechadas em um histograma com o número do celular (contagem) na área de iodeto do eixo y e propidium (PI-A) sobre o eixo x. Para 24 embriões hpf, isso deve dar um perfil estereotipado de ciclo celular, como na Figura 1.<ol>
<li>Para classificar a população de fase S, defina o portão do lado direito do pico do G1 para o lado esquerdo do pico do G2, incluindo apenas uma quantidade mínima de população G1 e G2. Para 24 embriões hpf, isso normalmente será constituído por cerca de 10-15% da população fechada (ver Figura 1).</li>
		<li>Para classificar a população de G1, defina o portão no lado esquerdo do pico do G1, para não passar o topo do pico. Ajustar a largura do portal G1 tão estreita quanto possível (ver Figura 1).</li>
		<li>Volte portal G1 e populações de fase S para garantir a adequada inicial associada (Figura 1E).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Classificar as G1 e S populações de fase para tubos cônico de 15 mL com 3 mL de PBS-BSA. O objetivo deve ser obter entre 500.000 e 1 milhão ou mais células classificadas por fração (fase G1 e S).</li>
	<li>Após a classificação for concluído, tubos de centrífuga em 1500 x g e 4 ° C por 10 min. Nota: O pequeno centrifugado será difícil ver e é importante para não perturbá-lo, portanto, use de preferência um rotor de balde balançando sobre um rotor de ângulo fixo.</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de 1X PBS. Transferência de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugar a 6.000 x g e 4 ° C por 5 min.</li>
	<li>Cuidadosamente retire todo o líquido do tubo e congelar o pellet seco a-20 ° C. Armazene a pelota a-20 ° C durante 2-3 semanas.</li>
</ol>5. DNA isolamento, tratamento de RNase e purificação de DNA
<ol><li>Remova centrifugado de-20 ° C e lugar no gelo.<ol>
<li>Adicione 400 µ l de tampão SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM de EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) de pelotas e ressuspender.</li>
		<li>Adicione proteinase K para uma concentração final de 0,2 mg/mL e misture vortexing brevemente.</li>
		<li>Incube as amostras no 56 ° C durante 2 h, vórtice cada 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após 2 h, execute extração fenol-clorofórmio, adicionando a 400 µ l de fenol-clorofórmio (álcool isoamílico: fenol: clorofórmio 25:24:1, saturado com 10mm Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).<ol>
<li>Vórtice para 20 amostra s e centrifugar a 16.000 x g por 5 min separar as fases.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a fase aquosa superior (400 µ l) e transferir para um tubo de 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute EtOH precipitação pela adição de 40 µ l de acetato de sódio 3M (pH 5.2), 2 µ l de glicogênio e 1 mL de EtOH.<ol>
<li>Vórtice para misturar bem e colocar a-20 ° C durante a noite para precipitar o DNA. Amostra também pode ser precipitada a-80 ° C ou em gelo seco por 1h.</li>
		<li>Amostra de centrifugação a 4 ° C e 16.000 x g, durante 30 min para o DNA da pelota.</li>
		<li>Descarte a pelota sobrenadante e lavar com 1 mL 70% EtOH. Centrifugar a 4 ° C e 16.000 x g durante 5 min.</li>
		<li>Descarte da pelota de sobrenadante e ar seco à temperatura ambiente por 2-3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolva a pelota em 96 µ l de água esterilizada e adicione 4 µ l de RNase A (2 mg/mL).<ol>
<li>Misture bem por num Vortex e incubar a 37 ° C, durante 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute extração fenol-clorofórmio, adicionando-se 100 µ l de fenol-clorofórmio e o procedimento a seguir em passos 5.2.1 - 5.2.2.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de acetato de sódio 3M, 1 µ l glicogénio e 250 µ l de EtOH e seguindo o procedimento em etapas 5.3.1 - 5.3.5 execute EtOH precipitação.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 60 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM de EDTA (pH 8.0)) e determinar a concentração de DNA utilizando um método quantitativo baseado em fluorescência. Loja DNA a-20 ° C. Nota: É importante para quantificação de DNA utilizando corantes de ligação de DNA baseado em fluorescência, ou outros meios mais confiáveis do que os métodos baseados em espectrômetro UV.</li>
</ol>6. preparação de bibliotecas de DNA e a próxima geração de sequenciamento
Nota: Uma G1 cópia número referência amostra para cada fonte biológica é necessária para cada execução de sequenciamento (ou seja, WT, linha mutante, transgénicos, celular, etc). Compare todas as amostras de fase S da mesma fonte biológica no sequenciamento mesmo executar a mesma referência de G1. Corra pelo menos duas réplicas biológicas de cada amostra para garantir a consistência entre as amostras.
<ol><li>Dilua 1 µ g de DNA até um volume final de 50 µ l e transferir para um tubo especializado para sonication.</li>
	<li>DNA genômico para um destino de 250-300 bp em um ultrasonicator de foco, de acordo com as especificações do fabricante e protocolo de cisalhamento.</li>
	<li>Verificar a qualidade e o tamanho do DNA genômico cortado usando uma máquina automatizada de electroforese, de acordo com as especificações do fabricante e protocolo. Assegurar que há um grande pico de 250 ~ 300-bp para o DNA genômico cortado.</li>
	<li>Prepare-se bibliotecas de sequenciamento, usando um kit de preparação de biblioteca de DNA com oligos multiplex para sequenciamento na plataforma Illumina, de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Verificar qualidade de preparação de biblioteca usando a máquina de electroforese automatizado, de acordo com o protocolo do fabricante. Assegurar que há um grande pico de ~ 400-450 bp, e existem picos mínimos para dímero da primeira demão (bp 80-85) e adaptador dímeros (~ 120 bp).</li>
	<li>Quantificar as bibliotecas usando um kit de quantificação de biblioteca de DNA para sequenciamento de DNA de última geração, de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Diluir a 15 µ l de biblioteca para uma concentração de 5 nM e combinar multiplexado bibliotecas como necessário para alcançar o desejado exclusivamente mapeamento ler contagens por amostra. Nota: O número de exclusivamente de mapeamento leituras por exemplo irá determinar a resolução. Uso apenas 5 milhões mapeado lê para avaliar o tempo de replicação para o genoma de zebrafish. Recomenda-se começar com 10 milhões de leituras.</li>
	<li>Realize o sequenciamento de DNA de genoma inteiro emparelhado-final 100 bp de amostras em uma plataforma de sequenciamento de geração seguinte, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>7. análise de dados de sequenciamento
Nota: As instruções nesta seção destinam-se como uma diretriz para análise. Use métodos adicionais para o alinhamento de sequenciamento, filtragem, processamento, etc. Esta seção do protocolo vai lidar com o método preferido de análise neste trabalho. Se forem usados métodos adicionais, ajuste os parâmetros e funções para atender a essas finalidades. Os comandos abaixo são inseridos no Ubutnu ou Mac terminal, com os pacotes apropriados instalados.
<ol><li>Obter as versões mais recentes do genoma zebrafish (danRer10, a partir de quando este protocolo foi escrito) do navegador UCSC genome usando os seguintes comandos: wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz<ol>
<li>Descompacte o arquivo fa.gz com o seguinte comando: gunzip danRer10.fa.gz</li>
		<li>Alinhe dados de sequenciamento de genoma usando BWA-mem usando os seguintes comandos: BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converta arquivo Sam para arquivo .bam usando o samtools com o seguinte comando: samtools Ver os input.sam -bS > output.bam<ol>
<li>Classificar os arquivos de sequenciamento alinhadas usando samtools com o seguinte comando: samtools tipo output.bam > output_sorted.bam</li>
		<li>Indexe o arquivo .bam usando o samtools com o seguinte comando: samtools índice output.bam</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mark PCR duplicatas com Picard usando os seguintes comandos: Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \ Input=Input.bam Output=output.bam REMOVE_DUPLICATES = false METRICS_FILE=output_metrics.txt</li>
	<li>Gere arquivos de texto (. txt) de leituras para cada cromossomo usando o seguinte comando: por eu em 1,25 {}; fazer CHROM = "chr" $i; Eco $CHROM; samtools Ver os input.bam $CHROM | corte -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i}. txt; feito Nota: As colunas no arquivo. txt resultante são bandeira, localização, mapQ, emparelhar chr, par localização e tamanho do fragmento, respectivamente.</li>
	<li>Ler arquivos. txt em Matlab (ou qualquer outro software similar) usando a função de textos.<ol>
<li>Filtre o mapeamento de baixa qualidade leituras, definindo um limite de mapQ de 30.</li>
		<li>Remova leituras com sinalizadores para alinhamento não primário, duplicatas PCR ou mapeamento de par para um cromossomo diferente.</li>
		<li>Filtre qualquer leituras com seu par, além de um limite de distância de 2000 bp.</li>
		<li>Avalie as estatísticas de leituras resultantes para determinar o número de estatísticas de leitura, cobertura, inserção de tamanho e qualidade (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine Leia cobertura em 100 windows bp fixada para cada amostra, contando o número de leituras em 100 intervalos de bp em todo o comprimento de cada cromossomo.<ol>
<li>Calcule que a mediana ler contagem para todas as janelas.</li>
		<li>Filtre as regiões de alta cobertura, removendo windows maiores que 5 desvios-padrão da mediana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina regiões para análise as amostras de referência G1 encontrando segmentos ao longo de cada cromossomo com 200 leituras usando janelas de correr.<ol>
<li>Determine a profundidade de leitura em cada amostra de fase S contando o número de leituras de fase S no windows 200-leitura contagem definido para a referência de G1 que acompanha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alise os dados brutos, usando a função csaps no software, com um fator de interpolação (p) de 10-16.</li>
	<li>Normalize os dados suavizados para pontuação z com uma média de 0 e desvio padrão de 1.</li>
</ol>

<ol><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721284/">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dynamics+of+replication+timing+revealed+by+in+vitro+models+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis.</a> Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li>
<li>Link, B. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-59745-285-4_13">Zebrafish as a Model for Development.</a> Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+during+development+anticipates+transcriptional+programs+and+parallels+enhancer+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation.</a> Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Zebrafish fornecem um sistema de modelo novo e exclusivo na vivo para estudar tempo de replicação do DNA. Quando cronometrados acasalamentos são realizados como detalhado no presente protocolo experimental, milhares de embriões podem ser coletados em um único dia para experimentos. Esses embriões se desenvolvem sincronicamente por precisamente cronometrados e distintamente caracterizados estágios de desenvolvimento. Zebrafish pode ser facilmente e com precisão encenado por morfologia usando um estereomicroscópio...

Para as células dividir com sucesso, eles devem primeiro com precisão e fielmente replicar seu genoma inteira. Duplicação do genoma ocorre em um padrão reproduzível, conhecido como o DNA replicação sincronismo programa1. Sincronismo de replicação de DNA está correlacionado com a organização da cromatina, marcas epigenéticas e expressão de gene2,3. Alterações no calendário de replicação ocorrerem durante todo o desenvolvimento e estão significativamente relacionados com transcriptional programas e alterações de marcas da cromatina e organização4,5. Além disso, sincronismo de replicação está correlacionado com frequências mutacional e alterações no calendário são observadas em vários tipos de câncer,6,7,8. Apesar destas observações, os mecanismos e os determinantes de estabelecimento de calendário de replicação e Regulamento ainda são em grande parte desconhecidos e o papel que desempenha no desenvolvimento e doença é indeterminada. Além disso, até recentemente a replicação do genoma-largo cronometrar as mudanças que ocorrem durante todo o desenvolvimento de vertebrados tinha apenas sido examinada em modelos de cultura de células.
Peixe-zebra, Danio rerio, são adequados para estudar replicação sincronismo na vivo durante o desenvolvimento, como um único par de acasalamento pode render centenas de embriões que se desenvolvem rapidamente com muitas semelhanças com o desenvolvimento dos mamíferos9, 10. Além disso, durante todo o desenvolvimento do zebrafish, existem alterações ao ciclo celular, organização da cromatina e programas transcriptional que compartilham relações com DNA replicação sincronismo11. Zebrafish também são um excelente modelo genético, como eles são particularmente passíveis de manipulação por transgênese, mutagênese e alvo de mutações, e telas genéticas identificaram diversos genes necessários para o desenvolvimento de vertebrados12. Portanto, o zebrafish pode ser usado para identificar genes envolvidos na manutenção e criação de temporização de replicação e para observar os efeitos da desregulamentação timing de replicação em desenvolvimento de vertebrados. Linhas transgénicas também podem ser usadas para avaliar o tempo de replicação da célula individual tipos isolados em diferentes momentos do desenvolvimento ou em condições de doença. Importante, existem vários modelos de zebrafish de doenças humanas que podem ser usados para investigar o papel do sincronismo de replicação em doença formação e progressão9,13,14.
Recentemente, os perfis de tempo de replicação primeiros foram gerados de zebrafish, estabelecendo isso como um sistema modelo para estudar a replicação sincronismo na vivo15. Para fazer isso, as células foram coletadas de zebrafish embriões em vários estágios de desenvolvimento e em um tipo de células isoladas de zebrafish adulto. As células foram então classificadas por FACS (classificação de fluorescência-ativado da pilha) com base no conteúdo de DNA para isolar populações de fase G1 e S. Usando o exemplo do G1 como um controle de número de cópia, copie o números variações na fase S populações foram determinadas e usadas para inferir a replicação relativo tempo16. Alterações no calendário de replicação em seguida podem ser directamente comparadas entre diferentes amostras de desenvolvimento e tipos de células, e isso foi usado para determinar mudanças no calendário de replicação que ocorrem na vivo durante todo o desenvolvimento de vertebrados. Este método oferece diversas vantagens sobre outros métodos de genômicas, principalmente que não exige rotulagem com análogos da timidina ou imunoprecipitação de DNA4,6.
Aqui está detalhado os protocolos para sincronismo de replicação de DNA de todo o genoma de perfil de alta resolução no zebrafish. Estes protocolos têm sido utilizados para determinar as relações com recursos de genômicas e epigenéticas no genoma de zebrafish, bem como alterações nesses relacionamentos que ocorrem durante todo o desenvolvimento de criação de perfil. Estes protocolos são também facilmente adaptados para estudar alterações no calendário de replicação em cepas mutantes de zebrafish e nos modelos de doença. Além disso, esses métodos fornecem uma base que pode ser expandida em cima para estudar tempo de replicação em tipos de células específicas, classificando primeiro os tipos de célula individual do zebrafish. O zebrafish pode servir como um excelente na vivo sistema modelo para estudar o tempo de replicação e, finalmente, revelar as funções biológicas dessa importante característica epigenética.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr>Solução de <td>protease</td> <td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Reagentes Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>para quantificação de DNA baseada em fluorescência</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>tubo especializado para sonicação</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>ultrasonicator focado</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td></td><td>Agilent G2991AA</td><td>máquina de eletroforese automatizada</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Reagentes para máquina de eletroforese automatizada</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit para Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>Kit de preparação</td></tr><tr><td>de biblioteca de DNA NEBNext Multiplex Oligos Kit para Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>oligos multiplex para kit</td></tr> <tr><td>de preparação de biblioteca de DNANEBNext Multiplex Oligos Kit para Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td><td>oligos multiplex adicionais para kit de preparação de biblioteca de DNA</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630L</td><td>kit de quantificação para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>magnetic beads</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td>plataforma de sequenciamento de DNA de próxima geração</td></tr><tr><td>40 &micro; Filtro de Células de Nylon Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Descartável VWR 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 6.0 mL para Nichiryo Modelo 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Posi-Click, 1.7 mL, Cor Natural</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Livre de Dnase/Rnase</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de lavagem</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Polietileno de baixa densidade, filtro de boca larga</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6,9 cm, malha fina</td></tr><tr><td>Tanque de corssing</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>tanque de reprodução individual</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A</td><td>grande tanque de reprodução</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>máquina de classificação de células</td></tr><tr><td>Wild M5a steromicroscópio</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>microscópio de dissecação</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>método quantitativo baseado em fluorescência para determinar a concentração de DNA</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versão 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versão 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de ferramentas de ajuste de curva Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versão 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

sincronismo de replicação de dna usando zebrafish como um sistema modelo in vivo de criação de perfil

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação do DNA é uma característica importante do celular, exibindo relacionamentos significativos com taxas de mutação do DNA, transcrição e estrutura da cromatina. Alterações no calendário de replicação ocorrerem durante o desenvolvimento e no câncer, mas o tempo de replicação do papel que desempenha no desenvolvimento e doença não é conhecida. Zebrafish estabeleceram-se, recentemente, como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação. Aqui está detalhado os protocolos para usando o zebrafish para determinar o tempo de replicação do DNA. Depois da classificação de células de embriões e adultos do zebrafish, padrões de tempo de replicação de DNA de alta resolução todo o genoma podem ser construídos, determinando alterações no número de cópia de DNA através da análise de dados de sequenciamento na próxima geração. O sistema de modelo zebrafish permite avaliar as mudanças de tempo de replicação que ocorrem in vivo durante todo o desenvolvimento e também pode ser usado para avaliar as mudanças nos tipos de células individuais, modelos de doença ou linhas mutantes. Esses métodos permitirá estudos investigando os mecanismos e os determinantes de estabelecimento de calendário de replicação e manutenção durante o desenvolvimento, o tempo de replicação papel joga em mutações e tumorigênese e os efeitos de distorçer tempo de replicação sobre desenvolvimento e doença.

Usando dados de tempo de replicação publicado, perfis de temporização de replicação representativa e medidas de controle de qualidade são fornecidas15. Os passos iniciais da transformação envolvem alinhar os dados de sequenciamento do genoma, calcular comprimento Leia e estatísticas de cobertura do genoma e filtragem de baixa qualidade, não pareada, e leituras duplicadas de PCR. Estatísticas de leitura para uma amostra de sequenciamento de zebrafish típicos são mos...

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar mapas de tempo de replicação do DNA do genoma completo a partir de embriões de peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do ciclo celular e da biologia da cromatina, como como as alterações da cromatina que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário podem afetar o início dos garfos de replicação do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela mapeia as mudanças de replicação que ocorrem in vivo em estágios definidos do desenvolvimento embrionário.Embora esse método possa fornecer informações sobre como a replicação do DNA muda durante o desenvolvimento do peixe-zebra, ele também pode ser aplicado a outros sistemas ou organismos modelo, como tunicados, sapos e moscas. Geralmente, as pessoas novas nesse método podem ter dificuldades porque é preciso alguma prática para gerar suspensões unicelulares a partir de embriões de peixe-zebra. Na noite anterior à coleta de embriões, coloque dezenas de adultos reprodutores em tanques de reprodução, usando um número aproximadamente igual de machos e fêmeas.Dependendo do experimento, use uma das seguintes estratégias d

profiling-dna-replication-timing-using-zebrafish-as-an-vivo-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir...

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e...

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Aprenda a gerar mapas de sincronismo de replicação de DNA em embriões de zebrafish em diferentes estágios de desenvolvimento. Este método in vivo permite estudar mudanças na cromatina e sua influência na iniciação da replicação.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Explorar mais vídeos