Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

O objetivo geral deste procedimento é gerar mapas de tempo de replicação do DNA do genoma completo a partir de embriões de peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do ciclo celular e da biologia da cromatina, como como as alterações da cromatina que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário podem afetar o início dos garfos de replicação do DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela mapeia as mudanças de replicação que ocorrem in vivo em estágios definidos do desenvolvimento embrionário.

Embora esse método possa fornecer informações sobre como a replicação do DNA muda durante o desenvolvimento do peixe-zebra, ele também pode ser aplicado a outros sistemas ou organismos modelo, como tunicados, sapos e moscas. Geralmente, as pessoas novas nesse método podem ter dificuldades porque é preciso alguma prática para gerar suspensões unicelulares a partir de embriões de peixe-zebra. Na noite anterior à coleta de embriões, coloque dezenas de adultos reprodutores em tanques de reprodução, usando um número aproximadamente igual de machos e fêmeas.

Dependendo do experimento, use uma das seguintes estratégias de reprodução. Para a primeira estratégia de reprodução, coloque alguns peixes-zebra machos e fêmeas em tanques de reprodução individuais e use uma divisória para separar os machos das fêmeas. Se essa abordagem for usada, configure muitos tanques de reprodução diferentes e agrupe os embriões de cada um para garantir que a variabilidade biológica seja representativa da população.

Para a estratégia de reprodução número dois, combine dezenas de peixes-zebra machos e fêmeas em um grande tanque de reprodução. Use essa estratégia desde que haja um número suficientemente grande de embriões. É razoável supor que eles vieram de uma variedade de fundadores e, portanto, são geneticamente representativos da população.

Para realizar acasalamentos cronometrados, comece assim que os ciclos de luz começarem pela manhã. Deixe os peixes se reproduzirem em águas rasas por um período de 10 minutos, com um fundo falso para os embriões escaparem. Após 10 minutos, colete os embriões despejando-os em uma peneira e usando um frasco de lavagem para enxaguá-los em um prato de 10 centímetros.

Agrupe todos os embriões coletados no mesmo momento, marque-os com o tempo de coleta e coloque-os imediatamente em uma incubadora a 28,5 graus Celsius. Para garantir que os embriões em desenvolvimento sincronizado sejam coletados, é fundamental que os lotes de embriões sejam coletados a cada 10 minutos. Isso é especialmente importante com os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário.

Centenas de embriões podem ser esperados de um único par de acasalamento em um dia. Permita que os adultos se reproduzam em ciclos de 10 minutos até que o número de embriões obtidos seja inferior a 20. Aproximadamente uma a 1,5 horas após a coleta, para classificar os embriões, removê-los da incubadora, observá-los ao microscópio de dissecação e classificá-los para remover os ovos mortos e não fertilizados.

Conte os embriões e coloque-os a uma densidade de 100 embriões por placa de 10 centímetros. Adicione o meio E3 fresco e retorne os embriões à incubadora de 28,5 graus Celsius. Quando os embriões atingirem o estágio de desenvolvimento desejado, verifique o estágio morfologicamente sob um microscópio óptico de acordo com os Estágios de Desenvolvimento Embrionário do Peixe-Zebra.

Se os embriões tiverem 48 hpf ou menos, transfira até 1500 embriões estadiados para um tubo cônico de 15 mililitros e use E3 para lavá-los várias vezes. Para cada 100 embriões, adicione um mililitro de E3 e 20 microlitros de solução de Pronase e agite suavemente. Até 1500 embriões podem ser descorionados em um único tubo com 15 mililitros de E3. Coloque o tubo de lado e organize os embriões em uma camada uniforme para garantir a proporção máxima de superfície para volume.

Agite suavemente o tubo a cada dois ou três minutos até que todos os córions tenham caído dos embriões. O tempo total de descorionação varia de acordo com a atividade do Pronase. Remova o sobrenadante e, com 10 mililitros de E3, enxágue suavemente os embriões três vezes.

Depois de colocar os embriões no gelo e remover o E3 restante, use um mililitro de tampão de desgemamento gelado recém-preparado para cada 500 embriões para lavar a amostra. Em seguida, usando um P1000, pipete suavemente os embriões para cima e para baixo de cinco a 10 vezes para romper o saco vitelino. Em seguida, transfira um mililitro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue a amostra a quatro graus Celsius e 500 vezes a gravidade por cinco minutos.

As amostras devem ser pipetadas com vigor suficiente para criar uma suspensão unicelular sem lisar as células. Esta etapa exigirá alguma prática. Remova o sobrenadante e use um mililitro de 1x PBS gelado para lavar o pellet para remover a solução de Ringer.

Em seguida, centrifugue novamente a amostra. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de 1x PBS. Em seguida, coloque o tubo no gelo.

Adicione três mililitros de etanol gelado a um tubo cônico de 15 mililitros e subtraia suavemente o tubo de EtOH em uma configuração baixa. Usando um P1000, goteje lentamente a suspensão de células embrionárias de peixe-zebra no EtOH enquanto continua a vórtice. Adicionar um total de um mililitro da suspensão de células embrionárias, para uma solução de fixação final de 75% de EtOH.

Depois de adicionar um mililitro de suspensão celular, gire suavemente o tubo para misturar e coloque-o de lado a 20 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora ou guarde a suspensão no freezer por duas a três semanas. Para corar o DNA embrionário, depois de remover as células embrionárias fixadas em EtOH de 20 graus Celsius negativos, centrifugue o tubo a 1500 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos. Coloque o tubo no gelo e remova cuidadosamente o sobrenadante.

Em seguida, usando um P1000, ressuspenda suavemente as células em um mililitro de PBS-BSA frio recém-preparado. Centrifugue as células a 1500 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por cinco minutos e coloque a amostra no gelo. Em seguida, remova o sobrenadante e, para cada 1.000 embriões, adicione 200 microlitros de solução de coloração de iodeto de propídio e ressuspenda as células.

Deixe as células incubarem em solução PI por 30 minutos no gelo, misturando suavemente a cada cinco minutos. Coloque um filtro de células de náilon de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Em seguida, pipete suavemente as células para misturar e filtrar a solução celular através da malha.

Usando a extremidade interna plana de um êmbolo de seringa, interrompa suavemente quaisquer aglomerados de células restantes na malha. Para cada 1.000 embriões, use 500 microlitros de PBS-BSA frio para enxaguar as células através do filtro. Coloque uma malha de 40 micrômetros sobre um tubo cônico de 15 mililitros no gelo e filtre a suspensão celular do tubo cônico de 50 mililitros uma segunda vez no tubo de 15 mililitros.

Finalmente, usando um instrumento de classificação de células apropriado, defina a excitação do laser para 561 nanômetros e a detecção de emissão para 610 sobre 20 para detectar iodeto de propídio. Classifique as células e faça análises adicionais de acordo com o protocolo de texto. Para determinar a qualidade do mapeamento de leitura, os dados de sequenciamento devem primeiro ser alinhados ao genoma, usando estatísticas de valores de mapQ.

Além disso, as estatísticas de comprimento de leitura calculadas são plotadas como um histograma da distribuição de tamanhos de inserção para todas as leituras de sequenciamento. Este experimento em particular resultou em uma mediana de 170 pb. Este gráfico de barras ilustra as estatísticas de leitura para o total de leituras mapeadas, as leituras contendo um sinalizador de baixa qualidade, leituras com pares mapeados para um cromossomo diferente, leituras com um par além do limite de distância e duplicatas de PCR.

Números representativos do total de leituras mapeadas, não mapeadas e não emparelhadas, cobertura e resolução de leitura para uma execução de sequenciamento típica de uma amostra de peixe-zebra estão listados aqui. Após a filtragem, as contagens de leitura são determinadas em janelas de tamanho variável e os dados são suavizados e normalizados. Perfis típicos de tempo de replicação suavizados e normalizados de um cromossomo representativo de peixe-zebra para réplicas biológicas são mostrados aqui.

Os perfis para réplicas biológicas e experimentais devem ser muito semelhantes e também apresentar alta correlação ao longo do comprimento do cromossomo. Os perfis também devem exibir alta correlação entre os valores de tempo em todo o genoma. O mapa de cores representa o coeficiente de correlação de Pearson.

Ao tentar este procedimento, é mais importante lembrar de garantir que os embriões em desenvolvimento sincronizado sejam coletados. Após esse procedimento, outros métodos, como injeções de morfolino ou mutagênese CRISPR-Cas9, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são os mecanismos pelos quais a replicação do DNA é coordenada com outros processos de desenvolvimento? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar células em estágios específicos do ciclo celular de embriões de peixe-zebra em desenvolvimento sincrônico.

A coleta dessas amostras é fundamental para gerar mapas de tempo de replicação do DNA do genoma inteiro.