Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Este método é otimizado com sucesso para classificar pacientes com câncer de mama em grupos terapêuticos conhecidos e não conhecidos. A alta sensibilidade deste ensaio identifica amostras heterogêneas que podem ser estudadas usando microdissecção a laser. A principal vantagem do ensaio multiplex baseado em RNA é a reprodutibilidade dos resultados usando material de arquivo embebido em parafina fixado em formalina corada com hematoxilina e eosina, permitindo resultados de alta resolução e validação de biomarcadores.

Prepare o tecido conforme descrito no protocolo de texto. Para iniciar a dissecação, defina os limites da lâmina e calibre o movimento da platina do microscópio. Agora escaneie as lâminas de membrana manchadas usando a objetiva 4X.

Selecione e circunde as áreas-alvo para microdissecção na lâmina de membrana. Acompanhe a área total. Pelo menos 42 milímetros quadrados são necessários para uma análise adequada do RNA a jusante.

Em seguida, inicie o corte a laser nos parâmetros definidos. Em seguida, use o mecanismo de elevação da tampa para recuperar a seção dissecada e coloque a seção na tampa do difusor de um tubo rotulado preso a um apêndice mecânico. Se a seção dissecada não for recuperada na tampa, repita a dissecção da área alvo.

A precisão da microdissecção é uma etapa crítica e deve-se sempre garantir que a área microdissecada presente na tampa coincida com a imagem marcada e digitalizada. Colete quantas seções de tecido desejar, cada uma em um tubo separado, e prossiga com a lisagem das amostras de tecido. Para a lise, aplique 2,4 microlitros de solução homogeneizadora pré-milímetro quadrado de área de tecido em cada amostra e, em seguida, vórtice as amostras por 10 segundos na velocidade máxima.

Em seguida, gire as amostras por cinco segundos a 2.500 g. Em seguida, transfira as amostras para tubos de 1,5 mililitro, se necessário, e coloque em um bloco de aquecimento agitado a 65 graus Celsius. Agite-os a 600 rpm por 12 a 18 horas.

Em seguida, centrifugar os lisados a 21 000 g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Recolha cuidadosamente o sobrenadante transparente num novo tubo rotulado. Evite transferir quaisquer fragmentos de tecido.

Os sobrenadantes podem ser armazenados a 80 graus Celsius negativos. Depois de preparar todos os reagentes para o ensaio baseado em hibridização, carregue até 90 poços de uma placa de separação magnética de 96 poços com homogeneizado de tecido de 25 microlitros. Carregue 25 microlitros de amostras de controle em três poços designados e carregue uma solução homogeneizadora de 25 microlitros em três poços como os espaços em branco.

Em seguida, sele a placa de separação magnética usando uma vedação de pressão de plástico transparente e coloque a placa em uma incubadora de 54 graus Celsius por 18 a 22 horas com agitação. No dia seguinte, monte e trave a placa em uma lavadora de placas magnéticas portátil, remova a vedação de pressão e aguarde um minuto para que as esferas magnéticas assentem. Agora faça uma lavagem.

Escorra o prato sobre uma pia e use um lenço de papel para secar suavemente, depois carregue todos os poços com 100 microlitros de tampão de lavagem 1X e aguarde 15 segundos. Repita esse processo três vezes para concluir a etapa de lavagem. Após remover a última lavagem, recarregue os poços com 50 microlitros do reagente pré-amplificador, sele a placa com um selador de placa de alumínio e agite a placa a 800 rpm por um minuto em temperatura ambiente.

Em seguida, continue agitando o prato a 50 graus Celsius por uma hora. Quando isso estiver concluído, execute outra etapa de lavagem. Em seguida, recarregue os poços com 50 microlitros do reagente amplificador, sele a placa com uma vedação de placa de alumínio e repita a incubação por agitação de um minuto à temperatura ambiente, seguida de uma hora a 50 graus Celsius, seguida de outra etapa de lavagem.

Agora vortex a sonda de rótulo por 10 segundos na velocidade máxima e, em seguida, adicione 50 microlitros de sonda de rótulo a cada poço. Em seguida, feche novamente a placa e repita a incubação agitada como antes, seguida de outra etapa de lavagem. Em seguida, carregue os poços com 50 microlitros de estreptavidina ficoeritrina recém-misturada e, em seguida, execute uma incubação agitada à temperatura ambiente a 600 rpm, seguida de uma etapa de lavagem usando tampão de lavagem estreptavidina.

Depois de concluir a etapa de lavagem, carregue cada poço com 100 microlitros de tampão de lavagem de estreptavidina e sele a placa com uma vedação de placa de alumínio, depois agite a placa a 800 rpm em temperatura ambiente por três minutos. Durante a última etapa de incubação, inicie o analisador de esferas magnéticas e certifique-se de que o instrumento esteja calibrado e que os protocolos de validação tenham sido executados. No software, adicione uma nova análise selecionando Criar lote usando um protocolo existente na guia Lotes.

Em seguida, no layout da placa, designe os poços como desconhecidos ou em branco e forneça um rótulo para cada um no painel Amostra. Agora remova a vedação de alumínio da placa de reação, ejete a bandeja do carregador de placas e carregue a placa no analisador. Em seguida, clique em Recuar e, em seguida, em Executar Lote para iniciar o analisador.

Após a leitura, ejete a placa e limpe o analisador de esferas magnéticas conforme recomendado pelo fabricante. Para análise, vá para a guia Resultados do lote. Selecione o respectivo arquivo de análise e use a opção de exportá-lo como um arquivo csv e, em seguida, crie médias e pontuações brutas usando um software de planilha.

Certifique-se de que os controles mostrem os sinais esperados. Normalize os dados brutos de amostra e analise a distribuição de dados usando uma plataforma de ciência de dados ou usando algoritmos definidos para executar uma análise de componente principal. O desempenho do leitor e ensaio de esferas multiplex é crítico e a execução de diluições em série de amostras de controle bem anotadas antes de amostras valiosas de pacientes garante resultados corretos.

Para atributos, selecione o subconjunto de dados de genes normalizados e uma variável nominal, como um subtipo de câncer de mama. Aplique um algoritmo de classificação treinado e validado para caracterizar amostras desconhecidas. O método descrito foi aplicado para a medição simultânea de 40 transcritos em material FFPE corado com H&E, microdissecado e altamente degradado.

Usando este método, é possível mostrar uma caracterização precisa do status do receptor e da expressão diferencial do marcador mesenquimal FN1 ao comparar o tumor e o tecido controle compatível nos vários subtipos de receptor positivo e negativo. A heterogeneidade dentro dos tumores pode ser caracterizada usando este método. Um tumor ER positivo exibe expressão diferencial espacial de FN1 dentro de áreas que mostram morfologia tumoral e atividade mitótica distintas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como medir vários genes diretamente de lisados de tecidos após a hibridização do RNA alvo para grânulos, amplificação de sinal e quantificação. A sensibilidade do ensaio permite o uso de material microdissecado a laser. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de calibrar o equipamento antes de cada ensaio e determinar a faixa de sensibilidade usando material de controle de qualidade antes de executar amostras preciosas do paciente.

O fluxo de trabalho do ensaio é facilmente adaptável aos laboratórios clínicos. O perfil de RNA de até 90 amostras pode ser realizado em 12 horas ao longo de dois dias. Medir o status do receptor do câncer de mama em um laboratório de patologia é demorado e requer patologistas experientes.

O uso deste ensaio digitalizado e multiplex baseado em esferas quantifica a expressão de RNA com precisão. A análise de biomarcadores fracionados em biópsias em um diagnóstico primário é uma apresentação do tumor. O uso dessa metodologia com um painel de biomarcadores mais amplo e também a utilização de seções inteiras identifica amostras heterogênicas.

O desenvolvimento de ensaios utilizando esta metodologia é versátil e requer baixa entrada de amostra. A amostra inclui amostras clínicas anotadas importantes para a validação de biomarcadores e também biópsias líquidas que são importantes para a vigilância do paciente e diagnóstico precoce.