Visualização e quantificação de células mesenquimais Adipogenic diferenciação potencial com um marcador específico da linhagem

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a diferenciação das células estromais em linhagem adipogênica, usando um marcador proteico específico da linhagem, a proteína quatro de ligação a ácidos graxos. Isso é feito primeiro isolando e expandindo as células estromais de interesse. As células estromais são então colhidas e plaqueadas em placas de cultura in vitro padrão.

Após a incubação por alguns dias, as células são tratadas com um meio de diferenciação adipogênica. As células são incubadas por 14 dias, com reposição regular do meio. Após a diferenciação, as células são fixadas e coradas com anticorpos contra a proteína quatro de ligação a ácidos graxos.

Um microscópio imunofluorescente de triagem automatizado de alto conteúdo é usado para capturar imagens das células marcadas nas placas de micropoços. A diferenciação é então quantificada, usando um software especializado de análise de imagem. Em contraste com os métodos tradicionais de medição da diferenciação adipogênica utilizando corantes como o Oil Red O, o ensaio descrito neste vídeo utiliza um anticorpo contra a proteína específica da linhagem, a proteína quatro de ligação a ácidos graxos, para confirmar a diferenciação adipogênica.

Ao fazer isso, este método quantifica as mudanças na expressão gênica que correspondem à diferenciação adipogênica. Este ensaio é capaz de fornecer uma riqueza de informações, incluindo porcentagem de células diferenciadas, intensidade do sinal de fluorescência por célula e alterações na morfologia celular. A capacidade de analisar múltiplas características permite a identificação de possíveis mudanças sutis na diferenciação em resposta a vários tratamentos.

Este ensaio também tem alta capacidade de tração, tornando-o ideal para aplicações de triagem de medicamentos de alta tração. Ressuspenda as células em meio ASC completo, que é o meio basal DMEM/F-12, suplementado com soro bovino fetal a 10%, GlutaMAX e antibióticos. Pipetar para uma placa de cultura de 96 poços, a 5000 células por poço.

São necessários oito poços para cada doador. Quatro poços recebem meio controle, enquanto o restante recebe meio de diferenciação. Cada quarto poço de cada tratamento servirá para um controle primário de nódulo.

Incubar células a 37 graus, umidificadas com uma condição atmosférica de 5% de dióxido de carbono por quatro dias. Isso é para permitir que as células cresçam até a confluência em cada poço. No quarto dia, retire as placas da incubadora.

Remova metade da mídia de cada poço. Adicione um volume igual de meio ASC completo ou meio de diferenciação adipogênica, que é suplementado com insulina, isobutilmetilxantina, dexametasona e indometasona. Incubar a placa a 37 graus, umidificada com uma condição atmosférica de 5% de dióxido de carbono.

O período de tempo necessário para uma diferenciação suficiente é de 14 dias. Durante esse tempo, reabasteça a mídia realizando a mudança de mídia a cada dois ou três dias. Após a diferenciação, retire as placas da incubadora.

Pipete cuidadosamente todos os meios de cada poço. Conserte as células adicionando metanol gelado. Incube por cinco minutos em temperatura ambiente.

Remova o metanol e lave com solução salina tamponada com Tris. Bloqueie adicionando 0,25% de bloqueador de caseína. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente.

Remova a caseína e lave com solução salina tamponada com Tris. Prepare a mistura de anticorpos primários diluindo o anticorpo anti-FABP4 200 vezes no tampão de diluição do anticorpo. Adicione mistura a todos os poços, exceto aqueles reservados como controle primário do nó.

Em vez disso, adicione tampão de diluição de anticorpos a esses poços. Incube em temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, lave as células uma vez com solução salina tamponada com Tris.

Retire, adicione solução salina fresca tamponada com Tris e incube por cinco minutos no balancim. Repita esse processo duas vezes. Prepare a segunda mistura de reanticorpos diluindo o segundo reanticorpo Anti-Rabbit Alexa 488 200 vezes no tampão de diluição de anticorpos.

Adicione DAPI, que rotula os núcleos das células, em uma diluição final de um a 2000. Adicione a mistura a todos os poços e embrulhe o prato com papel alumínio para evitar o fotobranqueamento. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após a incubação, lave as células com TBS e mais duas lavagens de 15 minutos no balancim. Remova todo o tampão dos poços e adicione tampão de armazenamento, suplementado com 0,4 miligramas por mililitro de timerosal, para evitar o crescimento bacteriano. Uma máquina de triagem de alto conteúdo equipada com estágio automatizado, objetivas de foco e filtros é usada para obter imagens deste bioensaio.

Verifique se os filtros corretos estão no lugar. Limpe o fundo do prato para obter a melhor qualidade. Coloque a placa no palco com A1 posicionado no canto superior esquerdo.

Usando o assistente de aquisição de placas, registre informações essenciais sobre o experimento, como número da placa, ampliação, data, condições experimentais e detalhes de rotulagem. Selecione o tipo de placa de micropoços usada. Os usuários podem selecionar poços e o número de locais a serem adquiridos.

Selecione todos os poços a serem fotografados destacando a grade. Mova o palco para o poço mais brilhante. Selecionar o poço mais brilhante garantirá que todas as imagens sejam adquiridas com valores de pixel cinza que estão em uma faixa linear e, portanto, diretamente proporcionais à intensidade da coloração.

Se esta etapa não for executada, as imagens tiradas em poços mais brilhantes podem estar supersaturadas. Selecione as combinações de canais, o tempo de exposição e os parâmetros de deslocamento Z apropriados para o experimento. Os filtros usados para imagens de FABP4 e DAPI correspondem aos rótulos específicos usados para visualizar a coloração.

Alexa 488, que excita a 480 nanômetros e emite a 560 nanômetros, foi usado para visualizar o FABP4. E o corante DAPI, que excita a 360 nanômetros e emite a 460 nanômetros, foi usado para visualizar os núcleos das células. Para placas marcadas com Oil Red O, gotículas de gordura foram visualizadas com luz brilhante transmitida por combustível.

E o rótulo Oil Red O também foi visualizado com fluorescência, pois excita a 575 nanômetros e emite a 630 nanômetros. Quando toda a configuração estiver concluída, o ensaio biológico estará pronto para ser adquirido. A imagem é salva automaticamente no servidor online, para permitir fácil acesso remoto às imagens.

O conjunto completo de imagens armazenadas no servidor online pode ser acessado usando o programa de área de trabalho remota. As imagens podem então ser analisadas usando o software MetaXpress. O aplicativo de pontuação celular permite que os usuários selecionem um comprimento de onda para detectar todos os núcleos em um campo, como DAPI, neste caso.

Os comprimentos de onda subsequentes podem ser usados para detectar um marcador positivo no núcleo, citoplasma ou em ambos os locais das células. A proteína quatro de ligação a ácidos graxos, ou FABP4, é um marcador de linhagem adipogênica. A expressão de FABP4 está localizada no núcleo e citoplasma de adipócitos diferenciados.

Neste ensaio biológico, analisamos a expressão de FABP4, usando o módulo de pontuação celular. Primeiro, detecte núcleos celulares usando o canal DAPI, com parâmetros definidos pelo usuário para tamanho e intensidade do sinal acima do fundo. Detecte o sinal FABP4 usando o canal C do pé e parâmetros definidos pelo usuário para tamanho e intensidade do sinal acima do fundo.

Neste ensaio biológico, gotículas de gordura marcadas com Oil-Red-O, que fluorescem na faixa de 560 nanômetros, foram analisadas com um módulo de lata MetaXpress, Transflour. Este algoritmo de análise detecta células totais usando núcleos marcados com DAPI, que atendem aos critérios de tamanho de célula e intensidade de coloração especificados pelo usuário. O usuário também especifica o tamanho e a intensidade dos poços, que neste caso detectam gotículas de gordura nas proximidades dos núcleos celulares.

As informações sobre o tamanho da gota de gordura, intensidade da coloração, número por célula, são registradas pelo ensaio Transflour. É importante notar que o rótulo Oil Red O vazou ou se dissolveu em algumas células, potencialmente limitando e confundindo a verdadeira quantidade de diferenciação que ocorre. Imagens representativas de células de passagem precoce e tardia, controle e células diferenciadas, marcadas com DAPI, uma coloração nuclear e FABP4 são mostradas ao lado de imagens de mesclagem e segmentação.

As imagens de segmentação exibem células diferenciadas com uma sobreposição verde e células indiferenciadas com uma sobreposição vermelha. A porcentagem de células que expressam FABP4 foi usada como medida do potencial de diferenciação adipogênica. Um aumento significativo nas células que expressam FABP4 foi observado com a diferenciação adipogênica nas células de passagem precoce e tardia.

As células de passagem precoce demonstraram um aumento significativamente maior na diferenciação do que as células de passagem tardia. As imagens representativas de DAPI e Oil Red O são mostradas ao lado de imagens de mesclagem e segmentação. As imagens de segmentação retratam todos os núcleos com sobreposição verde e gotículas lipídicas coradas com Oil-Red-O com uma sobreposição vermelha.

A área de coloração Oil Red O por célula foi usada como medida do potencial de diferenciação adipogênica. Um aumento significativo na área de coloração Oil Red O foi observado com a diferenciação adipogênica. As células de passagem precoce apresentaram maior área de coloração Oil Red O por célula, em comparação com as células de passagem tardia.

O Western blot foi realizado para analisar o nível de expressão da proteína FABP4 de ASCs diferenciados de passagem precoce e tardia. A análise semiquantitativa da densidade óptica das bandas de FABP4 como uma proporção do controle de carga total de proteínas mostrou que a imunomarcação de FABP4 foi significativamente aumentada na passagem inicial e, em menor grau, nas células diferenciadas de passagem tardia. Ao assistir a este vídeo, você deve ter entendido como diferenciar células-tronco em linhagem adipogênica, como realizar a coloração de imunofluorescência usando marcador adipogênico específico do gene, proteína de ligação a ácidos graxos quatro e, finalmente, como visualizar e analisar todas as características morfológicas relevantes de células imunopositivas para proteína de ligação a ácidos graxos quatro.

Espero que você ache este vídeo útil para sua pesquisa.