Histológica quantificação para determinar o pulmão carga fúngica em aspergilose Experimental

O objetivo geral deste protocolo é quantificar a carga fúngica pulmonar em camundongos com aspergilose invasiva por análise histológica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese fúngica sobre mecanismos de resposta protetora e prejudicial do hospedeiro e fatores-chave de virulência fúngica. A principal vantagem desta técnica é que as amostras histológicas existentes podem ser usadas para obter carga fúngica com resultados comparáveis à aplicação quantitativa de PCR do DNA fúngico pulmonar.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a aspergilose invasiva, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças nos quais os patógenos podem ser corados diferencialmente nos tecidos do hospedeiro. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a pensar em métodos alternativos para quantificar a carga fúngica pulmonar com menos variabilidade do que os métodos quantitativos de DNA. Demonstrando os procedimentos de infecção e colheita estará Angar Tsoggeral, um técnico de pesquisa.

24 horas antes da infecção, esgotar os neutrófilos em cada camundongo experimental de sete a 10 semanas de idade com 0,5 miligramas de anticorpo anti-camundongo-Ly-6G em solução salina estéril administrada por via intraperitoneal em um ângulo de 45 graus no quadrante inferior direito lateral de cada animal e retornar os camundongos às suas gaiolas. Na manhã seguinte, despeje 1,5 gramas de contas de vidro de 0,5 milímetro em uma placa de cultura de conídios de A. fumigatus e incline suavemente a placa para frente e para trás até que as contas estejam revestidas com o fungo. Recolha a mistura de esferas revestidas com conídios em um tubo cônico de 15 mililitros e suspenda as esferas em cinco mililitros de DPBS.

Vortex as contas para separá-las do fungo e conte os conídios em uma diluição de 50X do sobrenadante em um hemocitômetro. Dilua os conídios para uma vez 10 elevado a 8º conídios por mililitro de concentração de DPBS e carregue 50 microlitros de solução de conídios por camundongo em micropipetas individuais. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, coloque o primeiro camundongo anestesiado em uma placa inclinada na posição supina e prenda suavemente os incisivos superiores com um elástico e os incisivos inferiores com um fio de metal.

Em seguida, use uma pequena pinça para segurar cuidadosamente a língua em extensão total e entregar 50 microlitros da solução de conídios na base da língua. Mantendo a língua em extensão total, ouça a respiração rápida e o ruído distinto de clique da aspiração por 20 segundos ou até que a suspensão esteja totalmente aspirada. Em seguida, retorne suavemente o camundongo à sua gaiola com monitoramento até a decúbito total e infecte o próximo animal.

Quando todos os camundongos estiverem infectados, injete um subconjunto de animais com um agente antifúngico e repita a depleção de neutrófilos em todos os animais 24 horas após a infecção. Três dias após a administração do fungo, coloque o primeiro camundongo em decúbito dorsal em uma placa de espuma coberta com uma almofada absorvente. Certifique-se de que o mouse seja sacrificado com uma pitada no dedo do pé e desinfete o cabelo com etanol a 70%.

Depois de prender os membros, use uma tesoura para abrir cuidadosamente a cavidade torácica superior, cortando a caixa torácica para expor os pulmões e o coração. Corte a veia cava inferior que desce do coração, tomando cuidado para evitar cortar outros vasos sanguíneos ou perfurar quaisquer órgãos, e use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25 mantida em um ângulo de 45 graus para perfundir lentamente cinco mililitros de DPBS fria no ventrículo direito do coração. Após a perfusão com cinco mililitros de formalina a 10% da mesma maneira, exponha cuidadosamente a traqueia e retire as almofadas de gordura circundantes, tomando cuidado para não perfurar a traqueia.

Eleve a traqueia exposta com uma pinça e use uma agulha de calibre 25 para fazer um buraco na traqueia superior. Insira cuidadosamente uma cânula através do orifício em direção aos pulmões e amarre um fio cirúrgico frouxamente ao redor da traqueia para prender a cânula. Use uma seringa de um mililitro para inflar os pulmões com um mililitro de tampão formalina a 10% através da cânula e rapidamente, mas com cuidado, remova a cânula.

Aperte o fio cirúrgico para selar a traqueia e puxe suavemente o fio para desconectar o tecido conjuntivo, permitindo que os pulmões e a traqueia sejam colhidos. Coloque os tecidos em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 15 mililitros de tampão formalina a 10% com uma extremidade da rosca fora do tubo. Em seguida, feche a tampa e inverta o tubo para submergir completamente a amostra e o fixador por pelo menos 24 horas.

Para obter imagens do tecido colhido, primeiro abra um programa de quantificação de imagem apropriado e use um microscópio de luz para obter pelo menos quatro campos distintos de cada prata metanamina modificada de Gomori, ou lâmina corada com GMS, sob a objetiva 10X. Certifique-se de que as imagens sejam representativas das vias aéreas infectadas dentro do pulmão e que exibam uma densidade de tecido semelhante. Para adicionar barras de escala às imagens, no menu Editar, selecione Adicionar/Editar marcas de calibração e selecione a espessura da linha, a cor e o tamanho da barra de escala.

Clique na imagem onde a barra de escala deve ser colocada, abra o menu Editar e selecione Mesclar e Mesclar marcas de calibração para adicionar uma barra de escala a cada imagem e salvar as imagens nas pastas de grupo experimental apropriadas. Para calcular a carga fúngica em cada animal, abra um programa de processamento de imagem apropriado e abra a primeira pasta de imagens. No menu Imagem, selecione Tipo e Pilha RGB para converter as imagens.

Usando a tecla de seta para a direita, selecione a segunda das três imagens e pressione Control-Shift-T para abrir o ajustador de configurações do menu Limiar. Localize a imagem tiff ou jpg original como referência e abra a imagem com um programa de visualização de imagens. Ao selecionar o valor limite, é fundamental poder visualizar a imagem original para que a área selecionada seja representativa das hifas fúngicas e para garantir a consistência entre as amostras.

Mova o controle deslizante superior totalmente para a esquerda e ajuste o controle deslizante inferior até que a área vermelha selecionada seja representativa da imagem da microscopia. Clique em Definir e OK e selecione Analisar e Definir Medidas verificando Área, Fração de área, Limitar ao limite, Exibir rótulo e deixando as configurações inferiores como padrão. Clique em OK e selecione Analisar e medir.

Os resultados devem aparecer. Em seguida, exporte os dados para um programa de análise de dados para gráficos e análise estatística e insira a média das quatro ou mais porcentagens de área para cada amostra de pulmão. Como demonstra este gráfico de sobrevivência representativo, camundongos deficientes em eosinófilos com aspergilose invasiva tratados com um agente antifúngico pós-infecção exibem uma sobrevida aumentada em comparação com animais do tipo selvagem.

A coloração representativa de GMS de camundongos neutropênicos do tipo selvagem e deficientes em eosinófilos com aspergilose invasiva revela uma depuração fúngica quase total em camundongos knockout tratados com antifúngicos que não é recíproca em animais do tipo selvagem com ou sem tratamento antifúngico. Além disso, a PCR quantitativa e a quantificação manual de microscopia óptica GMS, como acabamos de demonstrar, confirmam que o tratamento com agentes antifúngicos resulta na redução mais significativa da carga fúngica entre camundongos do tipo selvagem e deficientes em eosinófilos. No entanto, em camundongos não tratados, apenas a quantificação de GMS determinou uma diminuição significativa em camundongos deficientes em eosinófilos neste experimento.

Quando as áreas médias dos cortes corados com GMS de pulmão inteiro são calculadas sob aumento de quatro X, as diferenças são semelhantes aos resultados obtidos com quatro campos representativos de 10X, embora com menor significância estatística. Resultados semelhantes de sobrevivência, carga fúngica e depuração fúngica também são observados em camundongos com deficiência de células T gama-delta tratados com o mesmo agente antifúngico. Ao tentar este procedimento, é importante permanecer consistente ao tirar fotos dos cortes histológicos e ao ajustar o valor limite para obter resultados comparáveis.

Após este procedimento, outros métodos envolvendo a análise histológica de amostras de diferenças claras entre a coloração alvo e de fundo podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas à patologia da doença nos pulmões e outros tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar camundongos com conídios fúngicos por aspiração involuntária e como medir o crescimento fúngico em seções de tecido pulmonar com um software de processamento de imagem. Não se esqueça de que trabalhar com Aspergillus fumigatus e a mancha de prata de metanamina modificada de Gomori pode ser perigoso e que precauções como usar equipamento de proteção individual e trabalhar sob um capuz bem ventilado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.