Name: Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica em modelos de AVC isquêmico em ratos usando o corante Evans Blue. Este método reprodutível permite medir a integridade vascular cerebral após lesão isquêmica.

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Os autores agradecem ao Chanceler Vice de investigação das Ciências da Universidade de Ardabil médica (Ardabil, Irã) para o apoio financeiro (conceder n: 9607).

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Ardabil University of Medical Sciences Research Council, para a realização de estudos com animais (número de identificação ética: ir JARROS. REC.1394.08). neste estudo visualizado, usamos ratos macho adulto Sprague-Dawley (300-350 g) obtidos de pastagem Institute (Teerã, Irã).
1. anestesia e Flowmetry
<ol><li>Induzir a anestesia usando 4% de isoflurano e mantê-lo com isoflurano (1-1,5%) em uma mistura de óxido nitroso (70% v/v) e oxigênio (30% v/v) para a duração da cirurgia.</li>
	<li>Coloque o animal anestesiado na postura inclinada sobre uma manta de aquecimento controlado de feed-back e manter a temperatura do corpo 37±0.5 ° C por meio de uma sonda retal conectada a esta unidade de aquecimento.</li>
	<li>Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar ressecamento.</li>
	<li>Raspe a região cirúrgica no lado esquerdo do crânio com tosquiadeiras elétricas. Use betadine solução com uma gaze para desinfectar a pele. Enxágue desta região com uma almofada estéril contendo 70% de etanol e repita as duas etapas para três ciclos17.</li>
	<li>Para analgesia, injete 0,2 mL de bupivacaína a 0,5% por via subcutânea a cirurgia região17.</li>
	<li>Faça uma incisão de pele longa de 1 cm no crânio (estendendo-se desde o canto lateral do olho esquerdo até a base da orelha esquerda) e dissecar o músculo temporalis esquerdo para expor o crânio. Em seguida, crie uma rebarba pequeno furo 5 mm lateralmente e 1 mm posterior para o bregma18 a facilidade de colocação da ponta da sonda lápis fluxômetro Doppler.</li>
	<li>Vire o rato dos propensos a posição supina e coloque a sonda de lápis do laser o crânio previamente perfurados furos cegos para monitorar o fluxo sanguíneo cerebral regional (rCBF).</li>
	<li>Gravar rCBF de linha de base de cada animal e considerando isto como 100%. Notavelmente, oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é iniciado sempre que uma diminuição na rCBF de mais de 80% é detectados19,20.</li>
</ol>2. indução da isquemia Focal Cerebra
<ol><li>Raspar a região do pescoço e desinfectar a pele com betadine solução e 70% de etanol. Injete 0,2 mL de bupivacaína a 0,5% por via subcutânea no local da cirurgia para analgesia17.</li>
	<li>Fazer uma incisão de 2 cm tempo cirúrgico na superfície ventral do pescoço para acessar a artéria carótida comum esquerda (LCCA). Isole o LCCA do nervo vago e a fáscia vizinha para acessar a bifurcação da artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida interna (ACI).</li>
	<li>Ligate permanentemente o LCCA ou ECA empregando uma sutura de seda 5-0 e dissecar ICA gratuito ao nível da artéria pterigopalatina.</li>
	<li>Vagamente, coloque um laço de sutura de seda 5-0 ao redor LCCA, e então temporariamente ICA prenda com um clipe de micro vascular.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão sobre o LCCA antes a gravata solta previamente colocada e depois insira uma sutura de silicone revestido de nylon 4-0 no espaço luminal do ICA e aperte a sutura ao redor da LCCA para proteger a sutura de nylon e evitar vazamento de sangue.</li>
	<li>Retire o microgrampo vascular do ICA. Em seguida, avança um filamento intraluminal revestido de silicone até observar um declínio marcado na rCBF que indica oclusão de origem MCA. No final do período isquêmico (90 min), começa a reperfusão retirando o intraluminal sutura21.</li>
</ol>3. Veia Jugular canulação e Evans Blue injeção (EB)
<ol><li>Fazer uma incisão longitudinal de 1 cm no pescoço para o lado esquerdo da linha média e em seguida sem rodeios dissecar afastada fáscia superficial para acessar o ramo externo da veia jugular esquerda (LGV). Então, permanentemente ligate extremidade cranial do LGV com sutura seda 5-0. Vagamente, coloque dois laços em torno da veia e então temporariamente braçadeira cardíaca final do LGV com um micropinça vascular.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão sobre o LGV entre duas suturas e depois introduza o cateter de soro heparinizado preenchido no espaço luminal do LGV e avançá-lo aproximadamente 10 mm... depois, aperte as ligaduras em torno da veia para fixar o cateter e prevenir hemorragias. Injete pequenas quantidades de soro para evitar o colapso da veia.</li>
	<li>No início do período de reperfusão, lentamente injete tintura EB (1 mL/kg de solução EB 2% em solução salina) durante um período de 5 min. Posteriormente, lavar a cânula por injeção de solução salina de 0,5 mL e retirar a cânula de injeção a veia12,22.</li>
	<li>Finalmente, suturar as incisões de pescoço e cabeça e injetar 0,05 mg/kg de buprenorfina intraperitonealmente (IP) e repita a injeção a cada 6-8 h durante o período de reperfusão para analgesia pós-operatória17.</li>
	<li>Injete 5 mL de saline(IP) previamente aquecido para fornecer hidratação na gaiola de recuperação17.</li>
	<li>Lugar do animal em uma gaiola de recuperação especial equipado com temperatura e controle de ar condicionado e acompanhar a recuperação do animal da anestesia.</li>
</ol>4. avaliação da permeabilidade de barreira sangue cérebro
<ol><li>Após 24h de reperfusão, profundamente anestesia o animal com tiopental sódico. Em seguida, abra a cavidade torácica, fazendo um pequeno furo abaixo do esterno.</li>
	<li>Faça uma pequena abertura no átrio direito e injetar 250 mL de solução salina 0,9% previamente aquecido (37 ˚ c) a uma pressão de 110 mmHg através do ventrículo esquerdo durante 15 minutos lavar EB longe a circulação até as saídas de Salinas normais da aurícula torna-se incolor23.</li>
	<li>Imediatamente remover o cérebro do crânio e colocá-lo na matriz do cérebro. Dissecar o bulbo olfatório e cerebelo, e em seguida, usando uma lâmina de barbear limpa, separe o hemisfério direito do cérebro do lado esquerdo (Lesioned) ao longo da linha mediana.</li>
	<li>Pesar cada hemisfério e homogeneizá-los separadamente em 2,5 mL de solução salina tamponada fosfato e misture isto com 2,5 mL de ácido tricloroacético (60%) por 2 min usando uma máquina de vórtice.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de cérebro por 30 min a 1.322 x g e permitir que as amostras arrefecer no frigorífico 4 ° C durante 10 min.</li>
	<li>Use os sobrenadantes para estimar a absorvância EB por um espectrofotômetro em 610 nm23.</li>
	<li>Calcule as concentrações EB contra uma curva padrão e resultados expressos em µ g/g de tecido cerebral.</li>
</ol>5. produção da curva padrão EB
<ol><li>Prepare soluções de amostra 10 do EB com concentrações de 1-10 µ g de EB em 5 mL de solução salina tampão fosfato.</li>
	<li>Medir os valores de absorvância de cada amostra em 610 nm, utilizando um espectrofotômetro.</li>
	<li>Fazer um gráfico de dispersão, usando uma folha de cálculo e concentrações de EB presentes no eixo X e os valores de absorvância no eixo Y (Figura 1).</li>
	<li>Defina uma linha de tendência linear para a curva com sua equação. Em seguida, usá-lo para obter a concentração do EB de amostras.</li>
	<li>Relate os resultados finais do extravasamento de EB como µ g/g de peso de tecido do cérebro.</li>
</ol>6. operação sham
<ol><li>Realizar o mesmo processo cirúrgico com ratos no grupo de operação (incluindo fazendo uma incisão na região do pescoço e injeção de EB) mas excluir o MCAO.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Até agora, vários métodos como autoradiografia e detecção dos traçadores radioativos24,25, microscopia de imunofluorescência26,27, EB extravasamento técnica20, e 23 têm sido utilizados para avaliar o dano da barreira hemato - encefálica. Tintura EB é fortemente podem ligar para a albumina e é usada como um marcador para detectar vazamento vascular...

Edema cerebral de vasogénico devido ao rompimento da barreira hemato - encefálica (BBB) continua a ser uma complicação importante do acidente vascular cerebral isquêmico e um importante determinante da taxa de sobrevivência no curso pacientes1,2. A barreira hemato - encefálica (BBB), que é formada por células endoteliais capilares do cérebro (BCECs) e composta por componentes neurovascular distintas (por exemplo, apertado junções entre células neuronais3, pericitos, Ralevic e BCECs), fornece uma especializados e dinâmica interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação do sangue periférico-4,5. Insultos, tais como lesões de isquémia-reperfusão poderiam perturbar a integridade funcional do BBB e conduzir a penetração posterior de leucócitos em circulação para o parênquima cerebral que em última análise, provocam inflamação cerebral e lesões cerebrais primários 6 , 7. modelos animais são necessários para a detecção exata da disfunção do BBB após ocorrência de um acidente vascular cerebral. Tais modelos são de grande importância para o estudo subjacente mecanismos fisiopatológicos e introdução de novas estratégias de neuroprotetor. Em vitro celular cultura baseado em modelos do BBB foram altamente desenvolvidos e utilizados para o estudo molecular do BBB fisiopatologia8,9,10. No entanto, na vivo modelos animais, que produzem danos isquêmicos do BBB semelhante ao humanas condições clínicas, também são muito interessante a este respeito. A detecção quantitativa do extravasamento de azul de Evans (EB) é uma técnica bem aceita e sensível que tem sido utilizada para avaliação da integridade do BBB e função em doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular cerebral isquêmico11, 12 , 13 , 14. este método é cost-effective, viável, reprodutível e totalmente aplicável em qualquer laboratório experimental. Sua implementação não requer equipamentos avançados, tais como traçadores radioativos15 ou ressonância magnética (MRI)16, que são pré-requisitos para outros métodos. Neste artigo, demonstramos exaustivamente processos básicos de técnicos de avaliação de BBB usando o extravasamento de EB em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>AWN 34041100</td><td>20 - 25 &deg; C</td></tr><tr><td>2,3,5-Cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)</td> <td>Molekula</td><td>31216368</td><td>4 anos</td></tr><tr><td>Sprague&ndash; Ratos Dawley&nbsp;</td><td>Pasture Institute (Teerã, Irã)</td><td></td> <td>300-350g</td></tr><tr><td>Evans Blue&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>76-03-9</td><td>2 anos</td></tr><tr><td>Bupivacaína HCl (0,5%)</td><td>Delpharm Tours</td><td></td><td>abaixo&nbsp; 25 &deg; C</td></tr><tr><td>Bupernorfina</td><td>Exir (Irã)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Di-Hidrogenofosfato de sódio</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>231-448-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>silicone(Xantopren)</td><td>Heraeus</td><td>EN ISO 4823</td><td></td></tr><tr><td>Ativador universal mais</td><td></td> Pinça Micro-Dissecante <td>Heraeus</td> 66037445 <td></td></tr><tr><td></td><td>Stoelting</td><td>52100-41</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scisors</td><td>Stoelting</td><td>52130-00</td><td></td></tr><tr><td>Operacional&nbsp; Tesoura</td><td>Roboz</td><td>52140-70</td><td></td></tr><tr><td>Matriz cerebral&nbsp;</td><td>Máquina de anestesia Stoelting</td><td>51390</td><td></td></tr><tr><td>para pequenos animais |</td><td>&nbsp; Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Power Lab system</td><td>AD Instruments</td><td>ML880</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de vazão Doppler a laser</td><td>AD Instruments</td><td>ML191</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de alimentação de aquecimento</td><td>Harvard Appratus</td><td>72-7560</td><td></td></tr><tr><td>Micro braçadeira vascular</td><td>FineScience Tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Fio de sutura de seda 5-0</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td></td></tr><tr><td>Fio de sutura Ethilon 4-0</td><td>Ethicon</td><td>EH6740G</td><td></td></tr></tbody></table>

uma avaliação in vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Acidente vascular cerebral isquêmico leva a edema cerebral vasogénico e lesões cerebrais primários posteriores, que é mediada através da destruição da barreira hemato - encefálica (BBB). Ratos com isquemia induzida foram estabelecidos e usados como modelos na vivo para investigar a integridade funcional do BBB. Detecção espectrofotométrica de azul de Evans (EB) em amostras de cérebro com lesão isquêmica poderia fornecer uma justificação confiável para pesquisa e desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas. Esse método gera resultados reprodutíveis e é aplicável em qualquer laboratório sem a necessidade de equipamento especial. Aqui, apresentamos uma orientação técnica e visualizada na detecção do extravasamento de EB após indução de acidente vascular cerebral isquêmico em ratos.

Não houve diferença significativa nos níveis EB no hemisfério direito vs hemisfério esquerdo dos ratos operação (1,06 ± 0,1 µ g/g e 1,1 ± 0,09 µ g/g, respectivamente). Conforme mostrado nas figuras 2A-2B, indução de isquemia transitória (90 min isquemia / reperfusão 24h) causou uma diferença significativa nos níveis de EB (10,41 ± 0,84 µ g/g, p &lt; 0,001) no hemisfério esquerdo de ratos isquêmicos, em comparação com os respectivos Hemisfério nos ratos de operaçã...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica altamente reprodutível para avaliação na vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um método altamente reprodutível de avaliação in vivo da ruptura da barreira hematoencefálica em um modelo de reação de AVC isquêmico. Isso é realizado pela indução de AVC isquêmico usando filamento intraluminal para oclusão da artéria cerebral média no lado esquerdo do cérebro. O próximo passo do procedimento é a canulação do ramo externo da veia jugular e injeção de corante Evans Blue no final da oclusão da artéria cerebral média e início do período de reperfusão.Vinte e quatro horas depois, sob anestesia profunda, o sistema circulatório do animal é lavado do Evans Blue e o cérebro é removido. Em seguida, dois hemisférios cerebrais são separados, homogeneizados e centrifugados e, finalmente, sobrenadantes de tecidos são usados para medir a concentração de Azul de Evans com um espectrofotômetro. Anestesia e fluxometria.Induza a anestesia com isoflurano a 4% e mantenha-a com isoflurano a 1-1,5% em uma mistura de óxido nitroso a 70% e oxigênio a 13% durante a cirurgia. Coloque o animal anestesiado em decúbito ventral na manta de aquecimento de controle de feedback e mantenha a temperatura corporal na faixa fisiológica normal por meio

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Este vídeo demonstra um procedimento para avaliar a ruptura da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo EAE. Corantes fluorescentes de diferentes tamanhos são injetados retroorbitalmente e circulam pelos vasos sanguíneos do cérebro. O corante menor vaza através de lacunas no tecido cerebral, enquanto o corante maior entra apenas se a ruptura for grave, correlacionando-se com a extensão do dano da barreira.

Determinando a ruptura da barreira hematoencefálica usando corantes fluorescentes em um modelo de camundongo EAE

Este vídeo demonstra a avaliação da zona de infarto e edema cerebral em fatias de cérebro de ratos submetidos à oclusão da artéria cerebral média. As áreas infartadas são identificadas usando coloração redox, enquanto um filtro azul e uma função de limiar no software de análise de imagem quantificam a zona de infarto e o edema no hemisfério afetado.

Medindo a zona de infarto e edema cerebral em um cérebro de rato após oclusão da artéria cerebral média

Fonte: Kuts, R. et al. Lesão cerebral induzida por laser no córtex motor de ratos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a avaliação da integridade da barreira hematoencefálica (BHE) após lesão cerebral induzida por laser em ratos. Um corante de rastreamento é injetado na veia da cauda, permitindo que ele circule para o cérebro e vaze para o tecido através do BBB danificado. O cérebro é então extraído e processado para liberar o corante. A intensidade de fluorescência do corante é medida para...

Avaliando a integridade da barreira hematoencefálica em um modelo de rato com lesão cerebral induzida por laser 

Hemato-encefálica ruptura da barreira auxilia a distribuição de certas drogas para o cérebro. Manitol entregue intra-arterialmente células vizinhas encolhe vasos sanguíneos, a fim de interromper a barreira física.

Modelo de ratos de sangue-cérebro Rompimento de barreira para permitir alvejado Neurovascular Therapeutics

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Neste estudo, apresentamos um procedimento fácil e eficiente para avaliar o rompimento da barreira hemato - encefálica em condições neurodegenerativas. Para alcançar nosso objetivo, nós infundida de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína rotulado (FITC)-albumina na jugular do mouse veia e avaliada a sua fuga para o parênquima cerebral por microscopia de fluorescência.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Este protocolo descreve uma nova técnica de medição dos três parâmetros mais importantes de lesão cerebral isquêmica no mesmo conjunto de amostras cerebrais de roedores. Usar apenas uma amostra cerebral é altamente vantajoso em termos de custos éticos e econômicos.

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

Um método foi desenvolvido para visualizar o extravasamento de corante devido à quebra da barreira hematoencefálica (BBB), administrando dois corantes fluorescentes a camundongos em diferentes momentos. O uso do glicerol como crioprotetor facilitou a imuno-histoquímica na mesma amostra.

Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Modelos in vivo de ratos são ferramentas indispensáveis para investigar os mecanismos patológicos e alvos terapêuticos do AVC isquêmico. Este trabalho descreverá a realização de coloração por imunofluorescência em fatias de cérebro infartadas após oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em ratos.

Avaliação da sinalização de morte celular por imunofluorescência em um modelo de rato de AVC isquêmico

Aprenda a avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica em modelos de AVC isquêmico em ratos usando o corante Evans Blue. Este método reprodutível permite medir a integridade vascular cerebral após lesão isquêmica.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico (Vídeo) | JoVE Journal

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

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