Name: Equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a reconstruir um modelo tecidual 3D de gengiva inflamada usando células humanas in vitro. Este método permite estudar cicatrização, regeneração tecidual e inflamação em doenças periodontais.

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Este trabalho foi financiado em parte pela sociedade do Japão para o promoção da ciência (JSPS) subsídio para a investigação científica (26861689 e 17 K 11813). Os autores gostaria de agradecer o Sr. Nathaniel Green para revisão.

Este protocolo é projetado para criar modelos de gengivite, modelos de ferimento gengival e equivalentes de tecido gengival humano. Pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT) foram gentilmente cedidos do Professor Norbert E. Fusenig do Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemanha)7. Fibroblastos gengivais humanos (HGFs) foram isolados a partir de tecidos gengivais, de acordo com os protocolos anteriormente publicados8. Foi obtido consentimento previamente, e o estudo foi aprovado de acordo com as orientações definidas pelo Comitê de ética, a Nippon Dental Universidade escola de vida Odontologia em Tóquio (número de autorização: NDU-T2012-35). Protocolo etapas 1-3 devem ser executadas em uma capa de cultura de células.
1. preparação do tecido humano 3D equivalentes da gengiva (GTE) (figura 1A)
<ol><li>Mix-colágeno tipo-A gel com 10% concentrados MEM-alfa e buffer de reconstrução de 10% (2,2 g de NaHCO3 e 4,47 g HEPES em 100 mL 0,05 N NaOH) em um tubo estéril 15 mL por pipetagem. Conservar a solução mista de colágeno no gelo até usado.</li>
	<li>Coloca uma placa de 24 inserções 24-poço de cultura (poros tamanho 3,0 µm).</li>
	<li>
Remova HGFs da cultura superfície usando a solução de EDTA-tripsina 0,25%. Suspender as células em 10 mL de meio de cultura A (alfa-MEM + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Conte as células por um contador de célula Bürker-Türk.
	<ol>
<li>Extrair a quantidade desejada de células (1-5 x105 células/mL) e, em seguida, centrifugar durante 4 min a 190 x g.</li>
		<li>Suspenda as células na solução mista de colágeno. Manter a mistura no gelo até o próximo passo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 0,5 mL da mistura de célula-colágeno (0.5-2.5 x 105 células/poço) para inserir a cultura sem produzir quaisquer bolhas. Incube a mistura por 10 a 30 min em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C para coagular a mistura em um gel. Nota: Adicione a mistura de colágeno no centro da inserção da cultura, para evitar formação desigual de gel de colágeno.</li>
	<li>Adicione 1 mL do meio de cultura para o bem e 0,5 mL para a inserção. Incubar a placa de cultura para 24h ou durante a noite em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Remova HaCaT células da superfície da cultura usando a solução de EDTA-tripsina 0,25%. Suspender as células em 10 mL do meio B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) e contar as células. Extrair a quantidade necessária de células (1 – 5 x 105 células/mL) com uma pipeta, centrífuga para 4 min em x 190 g. suspender as células em média B.</li>
	<li>Remova o meio das inserções de cultura, que contêm a mistura de HGF-colágeno, por aspiração. Adicione 0,5 mL de suspensão de células HaCaT (0.5-2.5 x 105 células/poço) no topo da mistura de HGF-colágeno. Incube as culturas por 24 horas ou durante a noite. Nota: Neste ponto do tempo, o meio na cultura bem deve ser A média, enquanto a média na inserção da cultura deve ser médio B.</li>
	<li>Substituir o meio de cultura com meio KSR (meio de cultura co) (MEM-alfa + 15% de substituição de soro nocaute + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Adicione 1 mL do meio de cultura para a cultura bem e 0,5 mL para a inserção da cultura. Incube as culturas por 24 – 48 h.</li>
	<li>Substituir o meio de cultura com KSR médio + 1% FBS. Adicione 1 mL na cultura bem e 0,5 mL para a inserção de cultura. Incube as culturas por 24 horas ou durante a noite.</li>
	<li>Substituir o meio de cultura na cultura bem com 0,7 a 1 mL de meio de KSR. Remova completamente o meio de inserção da cultura (a superfície de cultura deve ser exposta ao ar). Incube as culturas por 1 – 2 semanas. Mude o meio na cultura bem duas vezes por semana. Nota: Não deixe que a ascensão de nível média acima da superfície da cultura (a camada superior composta por queratinócitos). Mantenha sempre a superfície de cultura seca.</li>
</ol>2. preparação do GTE ferido (figura 1B)
<ol><li>Prepare um perfurador de tecido 1 a 3 mm de diâmetro. Esterilize-a com uma autoclave a 121 ° C por 20 min.</li>
	<li>Empurre o perfurador de tecido perpendicularmente GTE sobre 300 µm profundo e um buraco no tecido para simular um ferimento.</li>
	<li>Neste passo, use o GTE ferido para investigar a regeneração de tecido e cura ferida. Alternativamente, conserte a GTE usando solução de tampão neutro de formalina 10% para realizar a análise histológica.</li>
</ol>3. preparação do GTE inflamatória (iGTE) (figura 1B)
<ol><li>Cultive células THP-1 de acordo com o relatório anterior9.</li>
	<li>Mix-colágeno tipo-A gel com 10% concentrados RPMI 1640, buffer de reconstrução de 10% (2,2 g de NaHCO3 e 4,47 g HEPES em 100 mL 0,05 N NaOH) e 10 ng/mL PMA. Manter a solução de colágeno misto no gelo até o uso.</li>
	<li>Contagem de 1 – 2 x 106 THP-1 células e centrifugar durante 4 minutos a 190 x g. suspender as células em 1 mL da solução mista de colágeno. Manter a mistura no gelo até o próximo passo.</li>
	<li>Adicione a mistura de THP-1-colágeno do 10 a 30 µ l para a área de feridos do GTE. Substituir o meio de cultura para 0,7-1 mL de meio de KSR contendo 10 ng/mL de PMA.</li>
	<li>Incube a mistura em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C por 72 h.</li>
	<li>Usar o modelo para investigar a gengivite ou doença periodontal (por exemplo, adicionar o potencial medicamento anti-inflamatório para iGTE para ver seus efeitos sobre a liberação de citocinas10). Alternativamente, omitir PMA-tratamento de 72 h, adicionar 2 µ g/mL de LPS na cultura e incubar o tecido em um ambiente umidificado com 5% CO2 a 37 ° C por 48 h11,12.</li>
</ol>4. fixação e toda montagem imunocoloração de GTE e iGTE culturas
<ol><li>
Fixação das culturas.
	<ol>
<li>Remova a placa de 24, o meio de cultura. Lave os tecidos 2 vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS).</li>
		<li>Adicione 1 mL de solução-tampão neutro de formalina 10% para a inserção e 1 mL da cultura bem. Deixe a placa de 24 em um refrigerador a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Remova a solução-tampão neutro de formalina 10% no dia seguinte.</li>
		<li>Para toda montagem imunocoloração, lave os tecidos 3 - 4 vezes com PBS após a fixação.</li>
		<li>Por hematoxilina e eosina (H & E) coloração e imunocoloração regular, prosseguir com a desidratação, incorporação de parafina e de corte. Nota: Para toda montagem imunocoloração, esta etapa pode ser omitida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toda montagem de imunocoloração Nota: Este protocolo foi modificado na referência 13.<ol>
<li>Lavar os tecidos 3 x em PBS 0,5 – 1% Triton, 10 – 30 min cada tempo.</li>
		<li>Incubar os tecidos duas vezes por 30 min em tampão de bloqueio (PBS 1% Triton + 10% BSA), à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave os tecidos 2 × em tampão de bloqueio, 5 – 10 min cada tempo.</li>
		<li>Adicione 50 µ l de solução de anticorpo primário na concentração/diluição necessária para as inserções. Use um filme de plástico plástico fino para encapsular as inserções para evitar a secagem do tecido.</li>
		<li>Incubar o tecido durante 1 a 2 dias a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar os tecidos 3 vezes, por 30 min em PBS 1% Triton + 10% de BSA. Lave novamente 3 vezes, por 5 min em PBS 1% Triton.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de anticorpo secundário em tampão de bloqueio (PBS 1% Triton + 10% BSA) e 5 µ l de solução de Hoechst 33342 (mancha de NucBlue ao vivo celular) para cada inserção. Use um filme de plástico plástico fino para encapsular as inserções para evitar a secagem do tecido.</li>
		<li>Incubar durante 1 a 2 dias a 4 ° C. Embrulhe a placa de 24 em uma toalha de papel molhada e depois colocá-lo em um bloco de plástico a ser usado ao longo de incubação.</li>
		<li>Lavar os tecidos 3 vezes, por 10 min em Tritão de 1% de PBS</li>
		<li>Use uma agulha afiada para cortar a membrana da inserção da cultura para obter o tecido. Lugar da membrana para um slide. Nota: O tecido deve ser na membrana.</li>
		<li>Adicione 2 a 3 gotas de meio de montagem de fluorescência. Cubra o tecido com uma tampa de vidro e a loja a 4 ° C, no escuro até análise.</li>
		<li>Ver os tecidos com um laser confocal, microscopia (LSM).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf">http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf</a> (2017).</li>
<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Este protocolo é baseado em métodos de criação de equivalentes de tecido gengival e equivalentes de tecido adiposo subcutâneos descritos por anteriores relatórios8,21,22. Embora este seja um método simples e fácil, algumas etapas requerem atenção especial. Por exemplo, a mistura de colágeno deve ser mantida no gelo até o uso para evitar a formação de gel na solução. Ao adicionar a mistura de colágeno para a inserção de cultura, ...

As doenças periodontais são a principal causa de perda dentária em adultos. Gengivite e periodontite é as doenças periodontais mais comuns. Ambos apresentam alterações inflamatórias mediada por biofilme agudas ou crônicas na gengiva. A gengivite é caracterizada por inflamação aguda, Considerando que a periodontite apresenta-se geralmente como uma inflamação crônica. A nível histológico, componentes bacterianas desencadear a ativação de células do sistema imunológico, tais como macrófagos, linfócitos, plasmócitos e mastócitos1,2. Estas células imunes, especialmente os macrófagos, interagirem com as células locais (incluindo células epiteliais gengivais, fibroblastos, células endoteliais e osteoblastos) resultando em lesões inflamatórias no tecido periodontal3,4. Modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais, como ratos, hamsters, coelhos, furões, caninos e primatas. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos de doenças periodontais5. Co de cultivo de bactérias periodontais e células epiteliais oral humanas monocamada serviu para investigar o mecanismo das infecções periodontais6. No entanto, culturas de monocamadas de células orais faltam a arquitetura de celulares tridimensional (3D) do tecido intacto; Portanto, eles não podem imitar a situação em vitro .
Aqui, equivalentes 3D tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) são criados para representar doenças periodontais em vitro. Este modelo 3D das doenças periodontais ocupa uma posição intermediária entre as culturas de células monocamadas e modelos animais. Três tipos de células humanas, incluindo HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e THP-1 macrófagos, são co cultivados em gel de colágeno e estimulados pela inflamatórios iniciadores para construir iGTE. IGTE intimamente simula as condições na vivo de diferenciação celular, interação célula-célula e ativação de macrófagos na gengiva. Este modelo tem muitas aplicações possíveis drogas triagem e testando novas abordagens farmacológicas em doenças periodontais, bem como para analisar os mecanismos celulares e moleculares na cicatrização de feridas, inflamação e regeneração de tecidos.

<table><tbody><tr><td>Tipo Inc do colagênio I-A</td><td>Nitta Para</td><td></td><td>fazer a derma de GTE</td></tr><tr><td>MEM-alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>Meio de cultura</td></tr> celular <tr><td>Inserção de cultura celular (para placa de 24 poços), tamanho do poro 3,0 &mu; m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>Para cultura de tecidos</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Reagente de cultura de células</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Meio de cultura de células</td></tr><tr><td>KnockOut Substituição de soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Reagente de cultura de células</td></tr><tr><td>Perfurador de tecido</td><td>Shibata system service co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Para furos de perfuração em GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Meio de cultura de células</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Para imunocoloração</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (coloração de células vivas NucBlue)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Para rotular núcleos</td></tr><tr><td>Meio de montagem de fluorescência</td><td>Dako</td><td></td><td>Para montagem de amostras após imunocoloração</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-citoqueratina 8+18 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Para identificar o epitélio</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Para observar a topografia e composição da superfície das amostras</td></tr><tr><td>Microscopia confocal de varredura a laser</td><td>LSM 700; Fornecedor verificado - Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>Para observar a coloração de imunofluorescência das amostras</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-citoqueratina 19</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>Para identificar epitélio</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vimentina</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Para identificar fibroblastos e macrófagos ativados</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TE-7</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Para identificar fibroblastos na derme</td></tr><tr><td>Anti-CD68 anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>para identificar macrófagos</td></tr><tr><td>Anticorpo CD14 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Para identificar macrófagos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugado anticorpo secundário de cabra anti-coelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugado anticorpo secundário de cabra anti-rato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>EVOS FL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para observar as células de coloração de imunofluorescência da amostra</td></tr><tr><td>THP-1</td> Banco <td>de células Riken BRC</td><td>RCB1189</td><td>Para fazer iGTE</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-miristato 13-acetato)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Para diferenciar células THP-1</td></tr></tbody></table>

equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Doenças periodontais (tais como gengivite e periodontite) são as principais causas de perda dentária em adultos. Inflamação na gengiva é fundamental fisiopatologia das doenças periodontais. Atuais modelos experimentais de doenças periodontais foram estabelecidos em vários tipos de animais. No entanto, a fisiopatologia de modelos animais é diferente dos seres humanos, dificultando a mecanismos celulares e moleculares de analisar e avaliar novos medicamentos para doenças periodontais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reconstruir equivalentes de tecido humano inflamatória da gengiva (iGTE) em vitro. Primeiro construímos equivalentes de tecido humano da gengiva (GTE), utilizando dois tipos de células humanas, incluindo fibroblastos gengivais humanos (HGF) e pele humana queratinócitos epidérmicos (HaCaT), sob condições tridimensionais. Criamos um modelo de ferida usando um furador de tecido para fazer um buraco na GTE. Em seguida, humanos monócitos THP-1 misturados com gel de colágeno são injetados no furo do GTE. Por adimistration de 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) para 72 h, THP-1 células diferenciadas em macrófagos aos focos inflamatórios da forma no GTE (iGTE) (IGTE também pode ser stumilated com 2 µ g/mL de lipopolissacarídeos (LPS) para 48 h iniciar a inflamação ). IGTE é o primeiro em vitro modelo da gengiva inflamatória usando células humanas com uma arquitetura tridimensional. IGTE reflete grandes mudanças patológicas (immunocytes activition, interações intracelulares, entre fibryoblasts, células epiteliais, monócitos e macrófagos) em doenças periodontais. GTE, GTE ferido e iGTE podem ser usados como ferramentas versáteis para estudar a cicatrização de feridas, regeneração tecidual, inflamação, interação célula-célula e tela potenciais medicamentos para as doenças periodontais.

As células HaCaT exibidas morfologia típica queratinócito sob observação microscópica de contraste de fase (Figura 2A). Scanner elétron microscópico (SEM) imagens mostrou que as superfícies de célula HaCaT estavam cobertas por muitos microvilli. Conexões intercelulares entre células de HaCaT foram mediadas por processos de membrana (Figura 2B). HaCaT células expressaram epitélio gengival marcador K8/1814, ...

O objetivo do protocolo é construir um modelo de gengiva humana inflamatória em vitro. Este modelo de tecido co cultiva três tipos de células humanas, HaCaT queratinócitos, fibroblastos gengivais e macrófagos THP-1, sob condições tridimensionais. Este modelo pode ser aplicado para investigar doenças periodontais, como gengivite e periodontite.

Equivalentes de tridimensional tecido humano inflamatória da gengiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

O objetivo geral deste experimento é reconstruir um modelo de tecido gengival inflamatório 3D usando três tipos de células humanas in vitro. Este método pode ajudar a estudar a cicatrização de feridas, regeneração de tecidos, inflamação e rastrear possíveis medicamentos para doenças periodontais. A principal vantagem desta técnica é que este é o primeiro método a construir um modelo in vitro de gengiva inflamatória usando células humanas com arquitetura tridimensional.Em um tubo estéril de 15 mililitros, adicione colágeno tipo IA, 10% de MEM-alfa concentrado e 10% de tampão de reconstrução. Em seguida, deixe a mistura de colágeno no gelo até o próximo uso. Em seguida, posicione as pastilhas de cultura de 24 poços com tamanho de poro de três micrômetros em uma placa de cultura de 24 poços.Em seguida, use a solução de tripsina-EDTA a 25% para separar os HGFs do frasco de cultura. Em seguida, suspenda as células destacadas em 10 mililitros de meio de cultura. Em seguida, conte o número de células usando um contador de células Burker-Turk.Depois de isolar o número de células desejado, centrifugue as células a 190 vezes g por quatro minutos. Em seguida, suspenda o pellet celular com a solução de colágeno e deixe o tubo no gelo. Em seguida, adicione 5 mililitros de mistura de colágeno celular no inserto de cultura sem produzir bolhas de ar.Em seguida, incube a inserção da cultura com a mistura célula-colágeno a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 a 30 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro do meio de cultura no poço e 5 mililitros do meio no inserto. Em seguida, incube a placa de cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por um dia.Em seguida, use 25% de solução de tripsina-EDTA para separar as células HaCaT da placa de cultura. Uma vez que as células estejam separadas, adicione 10 mililitros de meio B às células. Em seguida, conte o número da célula.Depois de isolar o número de células desejado, centrifugue as células a 190 vezes g por quatro minutos. Após a centrifugação, dissolva o pellet celular no meio B.Em seguida, aspire o meio do inserto de cultura. Em seguida, adicione 5 mililitros de suspensão de células HaCaT sobre a mistura de HGF-colágeno.Deixe a inserção da cultura na incubadora por um dia. No dia seguinte, substitua o meio de cultura. Adicione um mililitro de meio KSR de co-cultura suplementado com 5% de soro bovino fetal no poço de cultura e 5 mililitros no inserto de cultura.Em seguida, incube a placa de cultura a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, substitua o meio de cultura por meio de co-cultura KSR suplementado com soro bovino fetal a 1%. Remova todo o meio de cultura do inserto de cultura e da cultura bem após 24 horas.Em seguida, adicione 7 a um mililitro fresco de meio KSR apenas no poço de cultura e continue cultivando por duas semanas. Lembre-se de mudar o meio no poço de cultura duas vezes por semana. Prepare um perfurador de tecido de um a três milímetros de diâmetro e esterilize o perfurador na autoclave a 121 graus Celsius por 20 minutos.Após a esterilização, empurre o perfurador de tecido perpendicularmente para dentro do GTE por cerca de 30 micrômetros de profundidade para fazer uma ferida no tecido. Em seguida, misture 10 nanogramas por mililitro de PMA, 10% de tampão de reconstrução e 10% de meio RPMI concentrado com gel de colágeno tipo IA. Em seguida, deixe a mistura de colágeno no gelo até o próximo uso.Em seguida, centrifugue as células THP-1 a 190 vezes g por quatro minutos. Após centrifugação, suspender o sedimento celular num mililitro de solução de colagénio e deixar no gelo. Em seguida, adicione 10 a 30 microlitros da mistura THP-1 célula-colágeno à área ferida do GTE.Em seguida, substitua o meio de cultura por um meio KSR de 7 a um mililitro contendo 10 nanogramas por mililitro de PMA. Em seguida, incube a mistura a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Para caracterizar o GTE reconstruído, são feitas a coloração H e E e a microscopia eletrônica de varredura.As imagens mostram GTE exibindo uma estrutura de tecido semelhante à gengiva com várias camadas de epitélio e lâmina própria. As imagens também mostram que as células HGF nos GTEs reconstruídos apresentam características morfológicas distintas de fibroblastos circundados por fibras colágenas. Em seguida, a coloração por imunofluorescência é feita para estudar a expressão de marcadores dérmicos e epiteliais.Isso é para validar se GTE e iGTE têm as características moleculares da gengiva humana inflamatória real. As imagens mostram que a vimentina e o TE-7 estão fortemente presentes na lâmina própria do GTE. K19, um marcador específico para o epitélio juncional na periodontite, embora fracamente expresso no epitélio GTE, é forte o suficiente no epitélio iGTE.Finalmente, para gerar os focos inflamatórios no iGTE, os monócitos THP-1 tratados com PMA são injetados na área ferida do tecido. Às 72 horas após o tratamento com PMA, as células THP-1 são diferenciadas em células semelhantes a macrófagos. A imunomarcação de montagem total confirmou que essas células expressam dois importantes marcadores de macrófagos, CD14 e vimentina, e formaram os focos inflamatórios.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro semanas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar contaminação. Após esse procedimento, outros métodos, como o uso de LPS para estimular respostas inflamatórias, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como induzir inflamação por meio das interações hospedeiro-biofilme.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da inflamação, regeneração de tecidos e cicatrização de feridas explorarem o mecanismo celular e molecular e rastrearem medicamentos potenciais para doenças periodontais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um modelo de tecido gengival inflamatório 3D in vitro.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

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