Name: Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais do periósteo alveolar humano e avaliar os efeitos osteoindutivos da vitamina D na diferenciação celular. Este método avança as terapias regenerativas em odontologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional para clínicas pesquisa de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 4728B-101 e 103-4223C). Este estudo foi suportado por Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.

O protocolo de estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital. Todos os participantes fornecido o consentimento informado por escrito.
1. tecido preparação
<ol><li>Colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dental (Figura 1). Após reflexão flap sob anestesia local, pegue um pedaço de tecido do periósteo do osso alveolar usando um separador periosteal31.</li>
	<li>Após a colheita, armazene as fatias periosteal tecidos de aproximadamente 5 × 2 mm na salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) com 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de estreptomicina. Transferi os tecidos para o laboratório no prazo de 24 h.</li>
	<li>Picar os fragmentos de tecido periosteal alveolar com bisturis até bem picada e manter as amostras em meio de passagem 0 (composto de 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de estreptomicina, α-MEM e 5% de soro fetal bovino [FBS]) cultivadas em uma incubadora a 37 ° C, com ar umidificado (5% de dióxido de carbono). Na incubadora, prepare uma bacia de água para manter a umidade.</li>
	<li>Mude o meio, depois de 3 dias e duas vezes por semana depois disso.</li>
	<li>Quando as células têm alcançado subconfluence (80%), liberar as células aderentes com 200 µ l de tripsina 0,25% na incubadora (37 ° C) por 3 min e então use 4,5 mL de meio para encerrar a reação.</li>
	<li>As células novamente no meio de passagem fresco 1 da placa (α-MEM, 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Placa é 5 × 103 células (como contados por um hemocytometer).</li>
	<li>Execute cada passagem subsequente após as células alcançar 80% de confluência31. Nota: No início, o meio será vermelho alaranjado. Após cerca de três dias, a cor média deve mudar para um tom amarelado. O tempo de duplicação das células é aproximadamente 30 – 40 h, precisando de 7 dias para 3 – 5 gerações.</li>
	<li>Cultura os PDCs isolados em α-MEM suplementado com 10% FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2).</li>
	<li>Observar o crescimento celular diariamente e substituir o meio de crescimento duas vezes por semana. Use células de terceiro a quinto-geração para tudo mais experiências.</li>
</ol>2. fluxo Cytometry
<ol><li>Colheita de 1 × 106 células através da digestão do trypsin:<ol>
<li>Adicione 200 µ l de tripsina 0,25%. Depois de 3 min, use 4,5 mL de meio de cultura contendo FBS para finalizar a reação de tripsina e recolher através de centrifugação (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).</li>
		<li>Lave as pelotas de célula três vezes usando 1 x DPBS. Ressuspender as células em 200 µ l 1 x buffer de permeabilização. Conte as células com um hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examine os marcadores de superfície expressados expressados dos PDCs através de fluxo cytometry (classificação de fluorescência-ativado da pilha)32. Uso de anticorpos monoclonais (MAb) contra CD19 (isotiocianato de fluoresceína (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) e HLA-DR (FITC)32.<ol>
<li>Adicione os anticorpos para as amostras e a cultura no escuro a 4 ° C por 30 min.</li>
		<li>Lave as células com 1 x DPBS três vezes.</li>
		<li>Consertar as células usando 2% de formaldeído e proceder com fluxo cytometry análise32.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. penhora e viabilidade com osteogênica, Adipogenic e Chondrogenic de diferenciação de células
Induzir a diferenciação nas células em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic pelo cultivo as células do periósteo em todas as três passagens em seis poços placas com meios de diferenciação específica.
<ol><li>Para diferenciação osteogênica, cultura de células em α-MEM em uma densidade de 5000 células por poço em placas de cultura de seis poços.<ol>
<li>Em alcançar 80% de confluência, cultura de células em meios contendo α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10−7 M. dexametasona (0,1 mM) e 5 mL de ácido ascórbico (100...). Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.</li>
		<li>Mude a mídia duas vezes por semana.</li>
		<li>Após 4 semanas, avalie o potencial das células de se diferenciar em uma linhagem osteogênica manchando as células usando um ensaio de von Kossa, que distingue a presença de depósitos calcificados em uma cultura de33.<ol>
<li>Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, adicionar 5% de nitrato de prata e tratar sob raios ultravioleta (UV) por 1h à temperatura ambiente.</li>
			<li>Adicionar 5% Na24 quatro vezes, permitindo que 3 min para cada reação. Finalmente, lave as células duas vezes com água destilada. Nota: Von Kossa coloração é uma reação de precipitação onde os íons de prata e fosfato reagem na presença de materiais ácidos; Esta técnica de coloração não é específica para o cálcio. Neste estudo, quando as células investigadas foram tratadas com solução de nitrato de prata, cálcio — que é reduzido pela forte luz UV — foi substituído por prata, que se tornou visível como prata metálica.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para diferenciação de adipogenic, cultura de células em uma densidade de 5000 células por poço em placas de cultura de seis poços contendo α-MEM.<ol>
<li>Em alcançar 80% de confluência, cultura das células em meios contendo α-MEM 5% FBS, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicilina, 10− 6 M dexametasona (1 mM), insulina (5 mg/mL) e indometacina (60 mM).</li>
		<li>Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.</li>
		<li>Depois de 6 a 9 semanas, use O vermelho para manchar as células e destacar gotas de lipídios, determinando, assim, a presença de adipogenic diferenciação33de óleo:<ol>
<li>Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, a manchar as células com 0,5% óleo vermelho O em temperatura ambiente por 10 min e depois lavar as células três vezes com isopropanol 60% por 3 min cada tempo; Finalmente, lave as células com água destilada. Nota: Óleo vermelho oé um lisocromo (lipossolúvel) corante usado para a coloração de lipídios neutros, principalmente Ésteres de colesterol, lipoproteína e triacilglicerol. O corante se dissolve nas gotículas lipídicas na célula, transformando as gotículas lipídicas vermelho.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para diferenciação de condrócitos, células de cultura em placas de cultura de seis-bem com cada um contendo bem 5000 células.<ol>
<li>Adicione uma diferenciação médio contendo α-MEM, 5% FBS, 10−7 M. dexametasona (0,1 mM), piruvato de sódio (100 µ g/mL), insulin-transferrina-selênio-A (1 × ITS), fator de crescimento transformador-β (10 ng/mL) e 5 mL de ácido ascórbico (100 µM).</li>
		<li>Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.</li>
		<li>Depois de 4-5 semanas, use Alcian azul de coloração para realçar os polissacarídeos ácidos, tais como glicosaminoglicanos ou alguns tipos de mucopolissacarídeos, na cartilagem das células para determinar a presença de condrócitos diferenciação33.<ol>
<li>Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, adicione ácido acético a 3% e permitir que 2 min para a reação. Posteriormente, lave com água destilada três vezes, adicionar 1% azul de Alcian 8GX incubado por 30 min e depois lave com água destilada. Finalmente, adicione ácido acético a 3% e lavar por 3 min e em seguida lavar com água destilada para terminar. Nota: As partes da célula que mancham especificamente por este corante tornar-se azul a azul esverdeado após coloração e são chamadas de "alcianophilic".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. efeitos da 25-dihidroxivitamina D3 (1,25-(OH),2D3) na osteogênese
<ol><li>Dividi o P3 para P5 PDCs em seis grupos e cultura em placas de 6-poços com vários meios de cultura:</li>
	<li>grupo negativo (α-MEM e 5% FBS);</li>
	<li>Grupo de vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e dexametasona 10−7 M + 100 hum vitamina C);</li>
	<li>e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupo (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e 10−7 M dexametasona + 10−7 1,25-(OH) M2D3).</li>
	<li>Adicione 2 mL do meio de uma incubadora (37 ° C) em cada poço e mudar o médio duas vezes por semana.</li>
</ol>5. inverter a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa/transcrição
<ol><li>Depois d 7 da diferenciação osteoblástica, isolar o RNA total no gelo usando um reagente comercial (ver Tabela de materiais):<ol>
<li>Adicione 1 mL do reagente de isolamento para cada poço. Adicionar 200 µ l de bromochloropropane e deixar por 10 min gerar RNA em camadas e em seguida centrifugar a 10.000 rpm por 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Após a centrifugação, adicione 500 µ l de 2-propanol a 500 µ l do sobrenadante contendo RNA. Precipitar o RNA no gelo e deixe 15 min para a reação.</li>
		<li>Após o procedimento, centrifugar a 12.000 rpm por 15 min a 4 ° C, após o qual o RNA está localizado na parte inferior do tubo. Posteriormente, remover o sobrenadante usando 1 mL de álcool de 75% para lavar e centrifugar a 7.500 rpm por 8 min em 4 ° C.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e usar um concentrador a vácuo para produzir RNA do fundo do líquido. Recupere-se com água.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reverso transcrever o RNA (1 μg) usando o transcriptase reverso vírus myeloblastosis aviária. Definir a reação em cadeia do polymerase (PCR) para executar a 25 ° C por 10 min, seguido de 50 ° C por 60 min e, em seguida, 85 ° C por 5 min, antes de finalmente manter a 4 ° C.</li>
	<li>Sintetiza primeiro-strand DNA complementar (cDNA). Realizar o PCR quantitativo (qPCR) usando 5 μL de 01:10 diluído do cDNA. Conduta de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) utilizando primers para ALP, BSP, OCN, CBFA1 e colágeno-1. Nota: Para evitar a contaminação de DNA pelos sinais, as sequências de frente e verso de cada primer foram projetadas em distintas exões.</li>
	<li>Executar qPCR usando um comercial do PCR Master Mix (ver Tabela de materiais), em conformidade com as instruções do fabricante. Definir o termociclador a 50 ° C por 2 min, seguido de 95 ° C por 10 minutos e então 40 ciclos cada um a 95 ° C por 15 s seguido de 60 ° C por 60 s. Nota: O protocolo SYBR também requer uma fase de curva de derreter, que é executada a 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 60 s e em seguida a 95 ° C por 15 s.</li>
	<li>Normalizar os valores de limiar de ciclo para ALP, BSP, CBFA1, colágeno-1 e OCN do gene das tarefas domésticas GAPDH. 34
</li>
	<li>Pares da primeira demão são listados na Tabela de materiais.</li>
</ol>6. alcalina fosfatase atividade
<ol><li>Avaliar a atividade de enzima ALP das células usando a técnica descrita anteriormente,35, que converte p- nitrofenil fosfato de p- nitrofenol; p- nitrofenil fosfato é um substrato de fosfatase que fica amarelo quando dephosphorylated por ALP, conforme determinado no comprimento de onda de 405 nm. Normalizar o total de p- nitrofenol formado com base na proteína total conforme determinado pelo ensaio de Bradford.</li>
	<li>Comparar as atividades ALP do controle (α-MEM, 5% FBS), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM, 10−7 M dexametasona + 100 hum vitamina C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e 10−7 M dexametasona + 108 M 1,25-(OH)2D3) e vitamina C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM, 10−7 M dexametasona + 100 hum +1,25-(OH) de vitamina C2D3) grupos após 1, 2, 3 e 4 semana de cultura.</li>
	<li>Execute um procedimento de extração de proteínas no gelo:<ol>
<li>Raspar as células das placas 6-poços e adicionar 50 µ l de tampão de Lise. Posteriormente, coloque as pilhas no gelo por 30 min destruir as células e liberar a proteína.</li>
		<li>Depois de 30 min, centrifugar a 13000 rpm a 4 ° C por 15 min. Após a centrifugação, extrair o sobrenadante para armazenamento e uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Uma modalidade terapêutica recentemente desenvolvida, ou seja tecido de engenharia que impliquem MSCs, tem inúmeras vantagens. MSCs, que estão presentes em diversos tipos de tecido, são células multipotentes que podem se diferenciar em uma variedade de células de tecidos mesodérmicos funcional37 e outras células, como os osteoblastos.
O periósteo serve como um nicho de células progenitoras, e como uma fonte de rica vascularização para o osso envolve-38...

Apesar de inúmeras técnicas relevantes têm sido desenvolvidas nos últimos anos, osso restos de reconstrução limitado por várias restrições e estimar que a extensão da reconstrução necessária muitas vezes é impossível. Aumento do tecido duro é necessário para alcançar objetivos estéticos e funcionais, além de uma taxa de sucesso a longo prazo favoráveis. Métodos comumente utilizados para tais procedimentos incluem enxerto ósseo autólogo e alogênico, Xeno e aloplásticos transplante de osso. Entre os vários tipos de enxerto ósseo, enxertos ósseos autógenos são considerados os mais eficazes. Entretanto, a morbidez do local doador, vascularização comprometida e tecido limitada disponibilidade1 foram grandes inconvenientes para enxerto ósseo autógeno. Além disso, enxertos ósseos alogênico e xenografts têm sido associados com a transmissão da doença. Atualmente, enxertos sintéticos são amplamente utilizados para resolver estes problemas. No entanto, com sua falta de potencial osteogênico, desfechos clínicos têm variado amplamente. Materiais, tais como celulose estão associados com a flutuação do volume, infecção e falta de força.
Aumento do osso, usando a engenharia de tecidos tem gerado um interesse considerável. Nesta técnica, as células-tronco mesenquimais (MSCs) inicialmente são utilizadas para promover a diferenciação de osteoblastos, que em seguida são transplantadas para o local da perda óssea para alcançar a reparação óssea. Este procedimento é aplicado atualmente em terapia celular. Alcançar a reconstrução óssea extraindo uma quantidade limitada de tecido é mais simples e menos invasivo em comparação com outros métodos.
O papel potencial do MSCs como uma ferramenta para terapias baseadas em células destinadas a regeneração dentária é um interesse emergente entre vários grupos de investigação. Estudos têm confirmado que MSCs podem ser diferenciados entre os seguintes tipos de tecido: medula óssea, membrana sinovial, tecido adiposa, Pericito, osso trabecular, humano de cordão umbilical e tecidos dentais2,3. Fontes comuns de MSCs incluem a medula óssea, tecido adiposo e tecidos dentais. Comparado com MSCs derivadas de tecido adiposo e da medula óssea, as vantagens das células-tronco dentárias são de fácil acessibilidade e menor morbidade após a colheita. Em comparação com células-tronco embrionárias, MSCs derivados de tecidos dentários aparecem nonimmunogenic e não estão associados com preocupações éticas complexas3.
Em 2006, a sociedade internacional de terapia celular recomendado usando as seguintes normas para identificar MSCs: primeiro, MSCs devem ser capazes de anexar ao plástico. Em segundo lugar, MSCs devem ser positivo para os antígenos de superfície CD105, CD73 e CD90 e negativo para os marcadores de monócitos, macrófagos e células B, além dos antígenos hematopoiéticos CD45 e CD344. Como um critério final, MSCs devem ser capazes de se diferenciar em três tipos de células sob condições padrão de diferenciação em vitro : osteoblastos, condrócitos e adipócitos4. Até à data, seis tipos de células-tronco dentais humanas foram isolados e caracterizados. O primeiro tipo foi isolado do tecido pulpar humano e denominadas de células-tronco de polpa dentária pós-natal5. Posteriormente, três tipos adicionais do MSCs dentais foram isolados e caracterizados: células-tronco de dentes decíduos esfoliada6, o ligamento periodontal7e a papila apical8. Mais recentemente, derivado de folículo dental9, derivado de tecido gengival10, broto dental haste cells(DBSCs)11e cisto periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 também foram identificados.
Friedenstein foi o primeiro a definir MSCs13. MSCs apresentam uma elevado potencial de proliferação e podem ser manipulados para diferenciar-se antes de ser transplantado, o que sugere que eles são candidatos ideais para procedimentos regenerativos10.
Embora a maioria dos estudos usou como fonte de células-tronco da medula óssea, células derivadas de periósteo (PDCs) também têm sido usados recentemente14. O periósteo é mais facilmente acessível, que é a medula óssea. Portanto, nesta técnica, vamos usar o periósteo alveolar para eliminar a necessidade de incisões adicionais durante a cirurgia e reduzir a morbidade pós-cirúrgicas em pacientes. O periósteo é o tecido conjuntivo que forma o revestimento exterior de ossos longos e é composto por duas camadas distintas: a camada exterior fibrosa é composto por fibroblastos, colágeno e fibras elásticas15e a camada interna do cambium célula rica em contato direto com a superfície óssea. A camada do cambium contém uma população de mistura de células, principalmente fibroblastos16, osteoblastos17, pericitos18e uma subpopulação crítica identificado como MSCs19,20,21. A maioria dos estudos têm relatado que PDCs são comparáveis, se não superior, a medula óssea-derivado células-tronco (bMSCs) em osso cura e regeneração22,23,24. O periósteo é facilmente acessível e apresenta excelente eficácia regenerativa. No entanto, poucos estudos têm incidido sobre o periósteo25,26,27.
Em matéria de reparação óssea, a prática clínica atual envolve o transplante de células progenitoras periosteal amplificado dentro apoio andaimes. Estudos recentes têm-se centrado na aquisição de células-tronco em regiões com defeito e empregando células progenitoras para regeneração de tecido20. Dentistas também antecipam a aplicação futura de regeneração óssea periodontal em implantes dentários e tratamentos periodontais. Sobre o site do doador, o periósteo pode ser facilmente colhido por cirurgiões-dentistas gerais. Isto compara-se favoravelmente contra células do estroma da medula, como o periósteo pode ser acessado durante cirurgia oral de rotina. Assim, o objetivo deste estudo é estabelecer um protocolo para a colheita PDCs e para avaliar a morfologia, apego, viabilidade e proliferação de células-tronco humanas periósteo.
Metabólitos de vitamina D afetam na vivo mineral óssea equilíbrio dinâmico. Um estudo relatou que o 24R,25-(OH) o2D3 a forma ativa da vitamina D é essencial para a diferenciação osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)28. Homeostase óssea e reparação são regulados por uma rede de vitamina D3 metabólitos, dos quais 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) é o mais biologicamente ativo e relevante na regulação da saúde óssea. Vitamina D3 é essencial para a calcificação29. Em um estudo utilizando ratos de Kunming branco 2-d-old, os corpos do embryoid nos ratos indicaram que suplementos de vitamina C e vitamina D efetivamente promovido a diferenciação de osteoblastos ESC-derivado de30. Entre suas outras atividades biológicas, 1,25-(OH)2, D3 estimula a diferenciação em vitro de hMSCs de osteoblastos, que podem ser monitorados com base no aumento na atividade da enzima fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ou gene OCN expressão.
Alguns estudos detectaram uma relação dose-resposta de tratamentos combinados com vitamina C e 1,25-(OH)2D3 em PDCs humanos com um foco particular na engenharia de tecido ósseo. Portanto, neste estudo, examinamos as concentrações ideais para tratamento simples ou combinado de 1,25-(OH)2D3 e vitamina C para induzir a diferenciação osteogênica de PDCs humanas. O objetivo do presente protocolo é determinar se uma população de células isolada do periósteo alveolar dental contém células com um fenótipo MSC e se essas células podem ser expandidas em cultura (em vitro) e diferenciadas para formar o tecido desejado . Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. A segunda parte do estudo avalia os efeitos da vitamina C e 10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 sobre a atividade osteogênica do PDC. O principal objetivo deste estudo é avaliar as funções da vitamina C e 1,25-(OH)2D3 durante a diferenciação osteoblástica de PDCs por atividade ALP e genes pro-osteogênica, tais como ALP, CBFA1, OCN, BSP e colágeno-1. Além disso, este estudo determina as condições de osteoindutora ideal para PDCs humanas com base nesses resultados.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2-fosfo-L-ascórbicosal trissódico</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina</td><td>ABI</td><td>Hs01029144_m1 Kit de</td><td></td></tr><tr><td>ensaio colorimétrico de atividade de fosfatase alcalina</td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr><tr><td>vírus da mieloblastose aviária transcriptase reversa</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>Cell banker1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>fator de ligação ao núcleo alfa-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 562008 <tr><td>indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>insulina&ndash; transferência&ndash; selênio-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços (0,1 ml)</td> <td>Vida</td><td>útil 4346907</td><td></td></tr><tr><td>filme adesivo óptico MicroAmp</td><td>Vida</td><td>útil 4311971</td><td></td></tr><tr><td>Mínimo Essential Medium 1X Alpha Modification</td><td>HyClone</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de permeabilização</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR Master Mix</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td><td></td> Fator de crescimento transformador <td>de 4304437</td><td></td>de vida</tr><tr><td>-&beta;</td><td>Sigma</td><td>T7039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol (para isolamento de RNA)</td> <td>Vida</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>colágeno-1</td><td>Invitrogen</td><td>primer direto 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>primário para a frente 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>primer para a frente 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'Primers</td><td></td></tr> <tr><td>ALP comerciais Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>CBFA1 comerciais</td></tr></tbody></table>

isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo alveolar humano e efeitos da vitamina d na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Células-tronco mesenquimais (MSCs) estão presentes em uma variedade de tecidos e pode ser diferenciadas em vários tipos de células, incluindo os osteoblastos. Entre as fontes dentais de MSCs, o periósteo é um tecido facilmente acessível, que foi identificado para conter MSCs na camada do cambium. No entanto, esta fonte ainda não foi amplamente estudada.
Vitamina D3 e 1,25-(OH)2D3 foram demonstradas para estimular a diferenciação em vitro de MSCs em osteoblastos. Além disso, vitamina C facilita o crescimento de células de formação e osso de colágeno. No entanto, nenhum estudo ainda investigou os efeitos da vitamina D3 e vitamina C no MSCs.
Aqui, apresentamos um método de isolar o MSCs do periósteo alveolar humano e examinar a hipótese de que 1,25-(OH)2D3 podem exercer um efeito osteoindutivo nessas células. Podemos também investigar a presença de MSCs no periósteo alveolar humano e avaliar a proliferação e a adesão de células-tronco. Para avaliar a capacidade da vitamina C (como um controle) e as diferentes concentrações de 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M) para alterar a chave biomarcadores de mRNA em expressão de RNAm de MSCs isoladas de fosfatase alcalina (FAL ou ALP), osso sialoprotein (BSP), ligação núcleo fator alfa-1 (CBFA1), 1-colágeno e osteocalcina (OCN) são medidos usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR).

Para todos os ensaios quantitativos, os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o Student t-teste. No total, 34 amostras foram obtidas com uma idade média de participantes de 48,1 ± 12,3 y. onze destas amostras foram obtidas de pacientes do sexo masculino e 23 do sexo feminino. Vinte e oito amostras foram obtidas a partir das regiões molares e seis das regiões anteriores; 26 foram obtidos de maxila e 8 da mand...

Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)2D3]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

O objetivo geral deste estudo é investigar os efeitos osteoindutores da vitamina D em células-tronco mesenquimais cultivadas que foram colhidas do periósteo alveolar dentário. O uso de células-tronco mesenquimais é um grande avanço na odontologia na última década. Eles foram isolados e cultivados com sucesso a partir de muitas partes do tecido dentário.O objetivo, porém, é isolar e cultivar células-tronco mesenquimais do periósteo alveolar e investigar o potencial osteoindutor do composto de vitamina D. De um modo geral, indivíduos novos neste assunto terão dificuldades por causa da nova ideia de formação óssea em células-tronco mesenquimais derivadas do periósteo alveolar. A demonstração do procedimento da equipe do laboratório será a Srta. Para começar, colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dentária usando um separador periosteal. Colete fatias de cerca de dois por cinco milímetros.Armazene as fatias de tecido em DPBS com antibióticos. No laboratório, use um bisturi para picar completamente os fragmentos de tecido periosteal alveolar dentro de 24 horas após a colheita. Em seguida, cultive o tecido em placas de Petri de 35 milímetros no meio de cultura apropriado.Use uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de gás dióxido de carbono. Três dias depois, descartar os tecidos periosteais coletados e trocar o meio. Quando as células tiverem proliferado a cerca de 80% de confluência, separe as células cultivadas adicionando tripsina.E incubar a cultura por três minutos. Depois disso, adicione 0,8 mililitros de meio para encerrar o descolamento. Depois de coletar e contar, distribua 5.000 células em um mililitro por placa.Marque as células revestidas como passagem um neste estágio. Cultive essas células e separe-as novamente depois de terem proliferado até 80% de confluência. O meio com passagem um é inicialmente de cor laranja/vermelho.Quando o meio começar a ficar laranja três dias depois, troque-o. Quando a passagem de uma célula atingir 80% de confluência, crie as células da segunda para a quinta geração repetindo os mesmos procedimentos usados para preparar a geração zero para a primeira geração. Troque o meio duas vezes por semana.Quatro semanas depois, avaliar o potencial das células para se diferenciarem em uma linhagem osteogênica, observando a morfologia das células ao microscópio. Estamina-se as células usando um ensaio de von kissosa. Este ensaio distingue a presença de depósitos calcificados em sua cultura.Lave as células com PBS e fixe-as por 30 minutos em um mililitro de 10% de formalina. Depois disso, remova a formalina e depois lave as células e trate-as com 5% de nitrato de prata. Exponha as células à luz ultravioleta por uma hora.Em seguida, remova o nitrato de prata e trate as células com dois mililitros de sulfato de sódio a 5% quatro vezes por três minutos de cada vez. Substitua a solução entre os tratamentos. Por fim, lave as células duas vezes com água destilada.20 das 34 amostras de tecido periosteal produziram com sucesso colônias de células-tronco derivadas da medula. Nenhum fator em relação aos doadores afetou significativamente o sucesso da cultura. Inicialmente, os PDCs formaram colônias e aglomerados esféricos com uma mistura de células redondas e fusiformes.Após a primeira passagem, as células eram homogeneamente semelhantes a fibroblastos com formato de fuso. Ao final da diferenciação osteogênica, o ensaio de von kossa indicou a possível presença de depósitos de cálcio e diferenciação osteogênica. Esses resultados indicam fortemente que, entre as populações de células periosteais, as células progenitoras possuem o potencial de se diferenciar em células osteogênicas.As células precursoras osteogênicas também foram tratadas com calcitriol e examinadas usando RTPCR para avaliar o nível de expressão da fosfatase alcalina, que é um forte indicador da diferenciação osteogênica precoce das células. Tanto o tratamento com vitamina C quanto com o calcitriol, um metabólito ativo da vitamina D, aumentaram a expressão da fosfatase alcalina. Além disso, a expressão dos níveis de mRNA de colágeno um aumentou em resposta aos mesmos tratamentos.Verificou-se que a expressão do mRNA da sialoproteína óssea aumentou para as células tratadas com maior concentração de calcitriol. No entanto, a expressão de CBFA e mRNA ostocálcico não respondeu aos tratamentos. Depois de assistir a este vídeo, o público deve ter uma boa compreensão do protocolo de mineralização e cultura do periósteo alveolar humano.Uma vez dominada, essa busca pode ser feita em quatro a cinco semanas, se realizada corretamente. Ao tentar este experimento, é importante usar uma técnica cuidadosa e estéril para evitar a contaminação da célula.

isolation-mesenchymal-stem-cells-from-human-alveolar-periosteum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm potencial de diferenciação em relação à linhagem osteoblástica quando estimuladas com fatores solúveis ou biomateriais específicos. Este trabalho apresenta uma nova opção para a entrega de MSCs a partir de membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emprega a matriz óssea bovina Nukbone (NKB) como um andaime.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Este artigo apresenta um método que combina a adesão total da medula óssea e a classificação da citometria de fluxo para isolar, cultivar, classificar e identificar células-tronco mesenquimais de medula óssea a partir de mandíbulas de ratos.

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.

Cultura Primária de Células-Tronco da Polpa Dentária

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

Este estudo apresenta um procedimento único de dissecção romba para preservar a integridade da geléia de Wharton (WJ), resultando em WJ menos danificado e uma maior quantidade e viabilidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) colhidas. O método demonstra rendimento superior e capacidade proliferativa em comparação com os métodos convencionais de dissecção aguda.

Isolamento de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical com alto rendimento e baixo dano

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais do periósteo alveolar humano e avaliar os efeitos osteoindutivos da vitamina D na diferenciação celular. Este método avança as terapias regenerativas em odontologia.

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Explorar mais vídeos