Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

O objetivo geral deste estudo é investigar os efeitos osteoindutores da vitamina D em células-tronco mesenquimais cultivadas que foram colhidas do periósteo alveolar dentário. O uso de células-tronco mesenquimais é um grande avanço na odontologia na última década. Eles foram isolados e cultivados com sucesso a partir de muitas partes do tecido dentário.

O objetivo, porém, é isolar e cultivar células-tronco mesenquimais do periósteo alveolar e investigar o potencial osteoindutor do composto de vitamina D. De um modo geral, indivíduos novos neste assunto terão dificuldades por causa da nova ideia de formação óssea em células-tronco mesenquimais derivadas do periósteo alveolar. A demonstração do procedimento da equipe do laboratório será a Srta.

Para começar, colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dentária usando um separador periosteal. Colete fatias de cerca de dois por cinco milímetros.

Armazene as fatias de tecido em DPBS com antibióticos. No laboratório, use um bisturi para picar completamente os fragmentos de tecido periosteal alveolar dentro de 24 horas após a colheita. Em seguida, cultive o tecido em placas de Petri de 35 milímetros no meio de cultura apropriado.

Use uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de gás dióxido de carbono. Três dias depois, descartar os tecidos periosteais coletados e trocar o meio. Quando as células tiverem proliferado a cerca de 80% de confluência, separe as células cultivadas adicionando tripsina.

E incubar a cultura por três minutos. Depois disso, adicione 0,8 mililitros de meio para encerrar o descolamento. Depois de coletar e contar, distribua 5.000 células em um mililitro por placa.

Marque as células revestidas como passagem um neste estágio. Cultive essas células e separe-as novamente depois de terem proliferado até 80% de confluência. O meio com passagem um é inicialmente de cor laranja/vermelho.

Quando o meio começar a ficar laranja três dias depois, troque-o. Quando a passagem de uma célula atingir 80% de confluência, crie as células da segunda para a quinta geração repetindo os mesmos procedimentos usados para preparar a geração zero para a primeira geração. Troque o meio duas vezes por semana.

Quatro semanas depois, avaliar o potencial das células para se diferenciarem em uma linhagem osteogênica, observando a morfologia das células ao microscópio. Estamina-se as células usando um ensaio de von kissosa. Este ensaio distingue a presença de depósitos calcificados em sua cultura.

Lave as células com PBS e fixe-as por 30 minutos em um mililitro de 10% de formalina. Depois disso, remova a formalina e depois lave as células e trate-as com 5% de nitrato de prata. Exponha as células à luz ultravioleta por uma hora.

Em seguida, remova o nitrato de prata e trate as células com dois mililitros de sulfato de sódio a 5% quatro vezes por três minutos de cada vez. Substitua a solução entre os tratamentos. Por fim, lave as células duas vezes com água destilada.

20 das 34 amostras de tecido periosteal produziram com sucesso colônias de células-tronco derivadas da medula. Nenhum fator em relação aos doadores afetou significativamente o sucesso da cultura. Inicialmente, os PDCs formaram colônias e aglomerados esféricos com uma mistura de células redondas e fusiformes.

Após a primeira passagem, as células eram homogeneamente semelhantes a fibroblastos com formato de fuso. Ao final da diferenciação osteogênica, o ensaio de von kossa indicou a possível presença de depósitos de cálcio e diferenciação osteogênica. Esses resultados indicam fortemente que, entre as populações de células periosteais, as células progenitoras possuem o potencial de se diferenciar em células osteogênicas.

As células precursoras osteogênicas também foram tratadas com calcitriol e examinadas usando RTPCR para avaliar o nível de expressão da fosfatase alcalina, que é um forte indicador da diferenciação osteogênica precoce das células. Tanto o tratamento com vitamina C quanto com o calcitriol, um metabólito ativo da vitamina D, aumentaram a expressão da fosfatase alcalina. Além disso, a expressão dos níveis de mRNA de colágeno um aumentou em resposta aos mesmos tratamentos.

Verificou-se que a expressão do mRNA da sialoproteína óssea aumentou para as células tratadas com maior concentração de calcitriol. No entanto, a expressão de CBFA e mRNA ostocálcico não respondeu aos tratamentos. Depois de assistir a este vídeo, o público deve ter uma boa compreensão do protocolo de mineralização e cultura do periósteo alveolar humano.

Uma vez dominada, essa busca pode ser feita em quatro a cinco semanas, se realizada corretamente. Ao tentar este experimento, é importante usar uma técnica cuidadosa e estéril para evitar a contaminação da célula.