Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

O objetivo geral deste procedimento de amputação é remover seletiva e completamente a faringe das planárias sem danificar outros órgãos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da regeneração. Por exemplo, como as células-tronco reconhecem órgãos ausentes e iniciam sua regeneração.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é muito precisa e que outros órgãos não são danificados durante o processo. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando estava anestesiando planárias com azida sódica. Percebi que a exposição à azida sódica fazia com que a faringe saísse.

A demonstração visual deste método é crítica, pois a amputação requer a seleção adequada dos animais, bem como uma observação cuidadosa do movimento e morfologia dos animais. Demonstrando o procedimento estará Divya Shiroor, estudante de pós-graduação do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, use uma pipeta de transferência de plástico para selecionar vermes que foram alimentados cinco a sete dias antes em uma placa de Petri limpa.

Coloque uma régua plana sob a placa de Petri para confirmar se cada planária tem pelo menos 6 milímetros de comprimento enquanto rastejam pela placa. Em seguida, transfira até 20 minhocas selecionadas para uma placa de Petri de 35 milímetros e use uma pipeta de transferência para remover toda a água da planária da placa. Coloque o prato sob um microscópio estéreo e ajuste a ampliação de forma que vários animais possam ser visualizados.

Adicione cinco mililitros de solução de azida sódica 100 milimolar recém-preparada ao prato. Monitore os animais sem mover o prato por três a quatro minutos para observar a extrusão da faringe. Quando pelo menos metade dos animais no prato tiver estendido totalmente a faringe, use uma pipeta de transferência de plástico para aspirar e dispensar à força os vermes ao redor do prato algumas vezes.

Se alguma faringe estiver totalmente estendida, essa pipetagem vigorosa fará com que ela se desprenda. Como alternativa, use uma pinça fina para agarrar a faringe enquanto levanta a planária em direção ao menisco. À medida que o animal é criado, a tensão superficial fará com que a faringe se desprenda.

Enquanto você está movendo a faringe, tome cuidado para não causar ferimentos acidentais aos animais. As planárias são muito moles e facilmente danificadas, especialmente quando em azida sódica. Use uma pipeta de transferência para mover cerca de 15 animais amputados para um novo prato contendo água fresca de planárias e enxágue as minhocas com água fresca de planárias três vezes.

Certifique-se de lavar completamente a azida de sódio. Mesmo vestígios do produto químico podem fazer com que os animais lisem. Em seguida, incube os vermes a 20 graus Celsius por sete dias.

No dia seguinte à amputação, coloque os vermes de volta ao microscópio para determinar se uma mancha escura é visível no lado dorsal do verme. Para alimentar os vermes, transfira um volume apropriado de pasta de fígado para um tubo de microcentrífuga e centrifugue o tubo brevemente para remover quaisquer bolhas de ar. Depois de estimar o volume do pellet de pasta, adicione água planária a um quinto de seu volume.

Com base no volume total do tubo, adicione dois por cento de corante alimentar vermelho. Misture bem a amostra de alimentos até que o corante esteja uniformemente distribuído por toda a pasta e centrifugue brevemente o tubo novamente. Transfira os animais amputados para uma nova placa de Petri e coloque no escuro por aproximadamente uma hora.

No final da incubação, corte aproximadamente meio centímetro da extremidade de uma ponta de pipeta P200 e use a ponta modificada para transferir 25 microlitros de pasta de fígado vermelha para o prato. Deixe os animais se alimentarem por 30 minutos. Em seguida, coloque as minhocas em um fundo branco para marcar o número de animais que aparecem em vermelho.

Após aproximadamente 6 minutos em solução de azida sódica, a ponta branca da faringe pode ser vista. Poucos minutos depois, os animais se contraem ativamente e ejetam com força a faringe para fora de seus corpos. Após aproximadamente 11 minutos de exposição à azida, os animais relaxam, momento em que a forma característica de sino da faringe se torna claramente visível.

Agora está pronto para amputação. A remoção dessa grande massa de tecido não pigmentado resulta no aparecimento de uma mancha escura no lado dorsal dos animais amputados. Para monitorar a regeneração da faringe com mais precisão, os animais podem ser corados com estreptavidina conjugada fluorescente durante a noite.

Ao combinar corante alimentar com a pasta de fígado, os animais que comem podem ser distinguidos dos animais que não comem. O número de animais vermelhos pode então ser quantificado para avaliar a porcentagem de animais com faringe funcional. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 20 ou 30 minutos.

Ao tentar este procedimento, lembre-se de observar cuidadosamente o movimento da planária para identificar quando a amputação deve começar. As amputações seletivas podem ajudar a resolver questões como como as células-tronco iniciam as decisões de linhagem apropriadas para realizar a regeneração. Este vídeo deve fornecer uma boa compreensão de como realizar a remoção seletiva da faringe usando azida sódica.

Trabalhar com azida de sódio pode ser extremamente perigoso. Lembre-se de sempre manuseá-lo com luvas, descartar os resíduos adequadamente e limpar seu espaço de trabalho após o experimento.