Name: Caracterização de Polímeros Sintéticos via Espectrometria de Massa por Ionização a Laser com Matriz Assistida por Tempo de Voo (MALDI-TOF) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a caracterizar polímeros sintéticos por MALDI-TOF MS, determinando peso molecular, dispersão e identidade de grupos terminais. Este protocolo otimizado garante resultados precisos em análises de polímeros como poli(L-lactídeo).

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Os autores reconhecem que o consórcio Smart Design de materiais, análise e processamento (SMATDAP) financiado pela National Science Foundation sob acordo de cooperação IIA-1430280 e o LA placa de Regents para uma bolsa de pós-graduação (MEP). Amostras de polímero para estas experiências foram fornecidas por MilliporeSigma (Sigma-Aldrich).  Publicação de acesso aberta do presente artigo é patrocinada pela MilliporeSigma.

Atenção: Todas as reações foram executadas em uma coifa. Por favor, leia todo Material segurança dados folhas (MSDS) para qualquer produto químico usado e tomar as devidas precauções.
1. preparação da amostra
<ol><li>Preparação das soluções estoque matriz<ol>
<li>Dissolva 20 mg de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (HCCA) em 1 mL de tetrahidrofurano instabilizados (THF) e vórtice até dissolver.</li>
		<li>Dissolva 20 mg de ácido benzoico-2,5 (DHB) em 1 mL de THF e vórtice até dissolver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução-mãe do alcaloide cação<ol>
<li>Dissolva 2 mg de sódio contra-íons (NaTFA) em 1 mL de THF e vórtice até dissolver.</li>
		<li>Dissolva 2 mg de potássio contra-íons (KTFA) em 1 mL de THF e vórtice até dissolver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação das soluções estoque de analito<ol>
<li>Exemplo 1: Dissolver 2 mg de poli (etileno glicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) em 0,5 mL de THF e vórtice até dissolver.</li>
		<li>Exemplo 2: Dissolver 2 mg de bis(azide) de polioxietileno (Mn = 2000) em 0,5 mL de THF e vórtice até dissolver.</li>
		<li>Exemplo 3: Dissolver 2 mg de poly(L-lactide), tiol finalizado (Mn = 2500) em 0,5 mL de THF e vórtice até dissolver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de misturas de amostra para análise<ol>
<li>Prepare uma série de soluções através da mistura de solução de matriz, o analito e o cátion enquanto variando as proporções relativas dos componentes, tal que as misturas de nove amostras originais são feitas. Por exemplo, manter a quantidade de constante de solução-mãe de matriz adicionado (EG., 10 µ l), variar a quantidade de solução de analito por um fator de três (EG., 45, 15 e 5 µ l), enquanto também, variando a quantidade de solução de cação por um fator de três (ex. ., 9, 3 e 1 µ l). Estas amostras efetivamente produzem uma grade de 3x3 de amostras com as duas variáveis de concentração diferente em x e y eixos (Figura 1).</li>
		<li>Para o exemplo representativo, combine 15 µ l da solução de poly(L-lactide), com 15 µ l da solução DHB e 1 µ l da solução NaTFA.</li>
		<li>Adicionar 1 μL de cada mistura de solução em uma amostra individual bem sobre a placa-alvo MALDI (Figura 2). Adicione as amostras incrementalmente em pequenas porções para evitar que a amostra fluindo para fora do poço de amostra, permitindo que cada alíquota evaporar a seco antes de adicionar a amostra adicional. Nota: Para maior ponto de ebulição de solventes, uma pistola de ar pode ser necessária para acelerar a evaporação do solvente, mas cuidado deve ser usado para evitar o aquecimento da placa da amostra, que pode causar a placa para dobra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de amostras-padrão para calibração<ol>
<li>Prepare os padrões de calibração usando o protocolo fornecedor sugerido. Nota: Foram selecionados para este estudo dendrímeros calibrants e estão disponíveis como os puros dendrímeros ou pré-misturado com matrix, calibrant e cação em rácios otimizados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. otimização de aquisição de dados
<ol><li>Iniciando a aquisição de dados<ol>
<li>Abra o software de aquisição de dados "FlexControl".</li>
		<li>Ejete a plataforma para permitir o carregamento da placa alvo pressionando o "<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq1v2.jpg">" botão.</li>
		<li>Coloque delicadamente a placa-alvo com as amostras de calibrant e analito carregadas na plataforma na orientação adequada.</li>
		<li>Use o software de aquisição para injetar a placa-alvo na plataforma, pressionando o "<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq1v2.jpg">" novo botão.</li>
		<li>Selecione um método de aquisição de dados apropriado (método de aquisição de modo positivo) pressionando arquivo | Selecione o método. Nota: Para a maioria das amostras de polímero, incluindo nossos representante analitos, ionização está prevista através de complexação com um cátion e, portanto, um método de aquisição de modo positivo é mais adequado. Dependendo do instrumento, para intervalos de massa inferiores (500-10.000 Da) ou quando a resolução maior é desejada, selecione um arquivo de método de modo reflector. Para maior peso molecular amostras ou quando a maior sensibilidade do sinal é necessária e baixa resolução é aceitável, selecione um arquivo de método de modo linear.</li>
		<li>Antes da aquisição de dados, certifique-se de um conjunto adequado de massa para a coleta de dados é selecionado-idealmente que o intervalo de massa metade da menor massa incluirá a distribuição esperada, bem como dobrar a massa mais alta na distribuição esperada. Verificar isso clicando na guia detecção e visualização Intervalo de massa. Nota: Isso ajuda a garantir aquele sinal de fragmentos de degradação de peso molecular mais baixos ou mais alto peso molecular agregados (dímero) que possam estar presentes na amostra estão incluídos no conjunto de dados. Além disso, observe que oligómeros de matriz são frequentemente notados com intensidades de sinal elevado na maioria dos espectros de massa MALDI-TOF, fornecendo o ruído de alta intensidade com massas tão altas quanto Da 1.000, complicando a análise abaixo esta massa. Embora a calibração será necessário antes de obter um conjunto de dados final, um arquivo de calibração precisa só pode ser adquirido se parâmetros de aquisição idênticos são usados como aqueles otimizado para o analito específico. Portanto, uma otimização preliminar do espectro de massa do analito é necessário antes da calibração, seguida pela reaquisição de um espectro de massa do analito calibrado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aquisição de dados preliminares<ol>
<li>O software de aquisição, selecione a posição da placa de destino que corresponde ao analito desejado.</li>
		<li>Inicie a coleta de dados ao mover o alvo do laser ao redor da amostra para maximizar o sinal. Para iniciar a coleta de dados, pressione Iniciar. Nota: O laser pode esgotar a matriz em uma localidade específica após a amostragem repetida.</li>
		<li>Usando a barra deslizante no lado esquerdo da janela da câmera, ajuste a potência do laser, tal que a potência mínima necessária para obter uma resolução isotópica é alcançada. Nota: Ao analisar várias amostras para confirmar a proporção ideal de analito, cação e matriz, use a mesma potência do laser em cada uma das amostras de analito para determinar qual amostra apresenta a melhor relação sinal/ruído para os parâmetros de aquisição. Continue a otimização de aquisição futura com a amostra que aparece para expor o melhor sinal à relação de ruído.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otimização de aquisição de dados<ol>
<li>Zoom em um pico individual no meio da faixa de massa de interesse, otimizar a resolução ajustando a diferença em tensões de aceleração (para os instrumentos neste estudo, isto envolve o ajuste o valor de "IS2"), que é o espectrômetro guia. Nota: Isto mais rapidamente é otimizado, variando o valor de IS2 em grandes passos, tomando nota de que o valor gera a melhor resolução (i. e., o menor completa a largura do pico a meia intensidade de sinal máximo) e em seguida, otimizando ainda mais em passos menores de o valor de IS2. Normalmente, o valor ideal de IS2 é maior (mais perto IS1) para polímeros de massa baixos e inferior para a massa de altos polímeros.</li>
		<li>Se desejar, aumente a resolução usando o modo reflectron. Nota: Reflectron modo permite a compensação de discrepâncias na velocidade inicial de íons do mesmo m/z , forçando os íons de velocidade mais elevados do mesmo valor m/z em um caminho mais longo para o detector. Este aumento no caminho para o detector permite que íons mais lentos do mesmo valor de m/z chegam ao detector simultaneamente, efetivamente, focando os íons para maior resolução. Embora reflectron modo tipicamente melhora a resolução do sinal, para amostras com intensidade de sinal fraco, modalidade linear pode ser necessário a fim de visualizar os dados.</li>
		<li>Finalmente, otimizar a potência do laser, reduzindo a potência do laser mais baixa possível enquanto ainda gerando um sinal razoável à relação de ruído (ex., o sinal à relação de ruído de aproximadamente 10). Nota: Porque maiores potências do laser, geralmente, reduzem a resolução e podem induzir a fragmentação, os espectros de massa com melhor qualidade são adquiridos usando o poder do laser reduzida, mas um número maior de exames.</li>
		<li>Uma vez que os parâmetros de aquisição são otimizados, salve os espectros de massa não calibrados, selecionando o arquivo e, em seguida, Salvar o espectro de arquivo como. Para calibração externa, uma nova aquisição do calibrant sob esses parâmetros idênticos, otimizados deve ser efectuada antes de uma nova aquisição é iniciada para gerar o espectro de massa calibrado do analito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. MALDI calibração
<ol><li>Aquisição do espectro de massa de calibração<ol>
<li>Usando os parâmetros de aquisição já otimizados para o analito, adquira um espectro otimizado em massa da amostra de padrões em massa. Nota: Idealmente, o conjunto de calibração deve incluir um padrão acima da faixa de interesse, um abaixo e pelo menos um na faixa de interesse. A exatidão da calibração é melhor se todos os parâmetros de aquisição são idênticos para ambas as amostras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criar um arquivo de calibração<ol>
<li>Certifique-se que qualquer calibração existente é anulada ou em posição de ser sobrescritos pressionando Invalidar a calibração sob o espectrômetro guia.</li>
		<li>Usando os mesmos parâmetros de aquisição (EG., poder, tensão IS2 laser), passar o laser para o poço de amostra contendo o calibrant (EG., padrão, peptídeo dendrímeros) selecionando o correspondente bem com o cursor e adquirir um espectro, pressionando Iniciar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que adquiriu sinal suficiente, pressione começar para terminar a aquisição de dados.</li>
	<li>Uma vez que adquiriu um espectro de massa da calibrant, selecione o menu dropdown de Lista de controle de massa na guia de calibração que corresponde a esse padrão de calibração. A lista de controle de massa adequado terá as massas de referência do calibrant selecionado com o cátion apropriado. Nota: Estas devem estar disponíveis ao fornecedor de calibrant e certifique-se de usar os valores de massa monoisotópico quando resolução isotópica é alcançada (EG., modo reflector abaixo m/z = 5000), e uma massa média quando os valores isotópica resolução Não pode ser alcançado (por exemplo, o modo linear acima m/z = 5000),</li>
	<li>Antes de combinar o pico de referência correspondentes a cada pico de calibrant selecionado, certifique-se de que um pico apropriado escolher protocolo está sendo usado, selecionando a guia de processamento . Nota: Os protocolos de colheita do pico podem variar de acordo com resolução espectral. Para um cálculo da massa médio, o software deve tomar a massa média em toda a série dos picos isotópicas. Para um cálculo de monoisotópico em massa, o software deve ser definido para calcular a massa exata de somente o primeiro pico isotópica.</li>
	<li>Aplica a massa de referência de lista de controle de massa para o sinal correspondente para o espectro de massa calibrant selecionar a área à esquerda do pico de interesse e clicando sobre a massa correspondente na lista de controlo para aplicar. Continue o processo para os restantes picos de calibrant. Nota: Para a calibragem mais exata e precisa, coloque as amostras do analito e calibrant tão próximos quanto possível sobre a placa-alvo, porque sutis variações na altura do prato de destino podem afetar a exatidão da calibração.</li>
	<li>Readquirir o espectro da substância a analisar, uma vez que a escala de massa para os parâmetros de aquisição otimizada foram calibrados.</li>
</ol>4. interpretação e análise de dados
<ol><li>Pico de colheita<ol>
<li>Abra o espectro de analito do software de análise de dados (FlexAnalysis).</li>
		<li>Zoom em um pico para identificar se isotópica resolução foi conseguida, selecionando o botão de Zoom no intervalo de X .</li>
		<li>Pressione lista de massa | Encontrar para selecionar picos. Se o pico monoisotópico é resolvido, selecione este primeiro pico na distribuição isotópica para determinar sua massa usando um protocolo de pico-colheita monoisotópico. Se não for resolvido o pico monoisotópico, use um pico de massa médio, escolher o protocolo e determinar a massa média da distribuição isotópica inteira.</li>
		<li>Continue este pico escolhendo o processo para cada n-mer na distribuição do polímero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculos de análise caracterização e participante do grupo polímero Nota: Quando usado corretamente, MALDI-TOF MS pode fornecer dados valiosos, precisos para cálculos de distribuição em massa de polímeros. Note-se que dados de distribuição em massa só são precisos quando o dispersity da amostra do polímero é relativamente baixa (EG., aproximadamente Đ= 1.3 ou abaixo).<ol>
<li>Calcule o peso molecular médio número, a massa média em relação ao número de moles de cada fração em massa, usando a fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq2v2.jpg"> onde Neu = número de moléculas de peso molecular específico e Meu = o peso molecular específico dessas moléculas.</li>
		<li>Calcule o peso molecular médio do peso, a massa média em relação ao peso de cada fração em massa, usando a fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq3v2.jpg"> onde N eu = número de moléculas de peso molecular específico e M eu = o peso molecular específico dessas moléculas.</li>
		<li>Uma vez que tanto a Mw e Mn foram calculados, quantificar a amplitude da distribuição do peso molecular, usando a relação Mw/mn que é chamado de dispersity, Đ.</li>
		<li>A característica mais única e poderosa de análise de dados de MALDI-TOF MS é a capacidade de determinar ou confirmar os grupos fim de homopolímeros. Determine o fim de grupo rearranjando-se a seguinte fórmula para a massa observada de um n-mer no espectro de massa (Mn-mer): M demer-n = n (MRU ) MEG1 + MEG2 + Míon onde n = grau de polimerização, MEG1 = massa do grupo α-fim, MEG2 = massa do grupo ω-fim, MRU = a massa da unidade de repetição do polímero, e Míon = massa do íon que complexos com o polímero.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm interesse financeiro relacionado com o esférico calibrants utilizado neste estudo.

Espectrometria de massa MALDI-TOF é uma ferramenta analítica inestimável para a caracterização do polímero devido à sua capacidade de gerar íons de polímero no estado isoladamente carregado e com mínima fragmentação. Esta técnica de ionização suave utiliza pulsos de laser curto para desorb estado sólidas amostras do analito polímero incorporado em uma matriz composto para gerar íons de polímero na fase gasosa. Normalmente, as macromoléculas são ionizadas por complexação com cátions são adicionados à matriz para permitir sua análise por espectrometria de massa. Estes íons macromoleculares são então acelerados por uma tensão de extração para trazê-los para a região de campo-livre do tubo do voo que pode habilitar seus m/z a ser determinado com base em seu tempo de voo entre a fonte de íon e o detector5 , 32.
Em comparação com outras técnicas de caracterização de polímeros, qualidade de espectros de MALDI-TOF MS é fortemente dependente de parâmetros de aquisição de dados e preparação da amostra. Embora não haja nenhuma fórmula definida para a preparação da amostra, compreendendo a função de cada componente da preparação amostra permite a otimização empírica mais rápida. O fator mais importante na preparação da amostra MALDI é seleção da matriz pois compatibilidade da matriz com o analito de polímero é fundamental para permitir que a matrix animado para gerar macromoléculas dessorvidas, única em um estado ionizado5, 15,17,19. Uma vez apropriado matriz e cationization agentes foram selecionados, deve ser determinada a relação correta de analito, matriz e cationization agente. Isto pode ser conseguido empiricamente, criando uma grade bidimensional de amostras (Figura 1) sobre a placa-alvo MALDI-TOF MS (Figura 2) com o aumento da concentração de matriz em um eixo e aumento da concentração do agente de cationization sobre o outros.
Semelhante à preparação da amostra MALDI, não há nenhuma fórmula definida para a determinação de parâmetros de aquisição de dados; no entanto, certas tendências devem ser consideradas para agilizar a otimização espectral. Modo de Reflectron, que aumenta a resolução, mas diminui o sinal global, normalmente é escolhido para baixa massa varia (nestes exemplos, abaixo Da 4.000) onde será possível resolução isotópica. Nestes casos, cálculos de massa monoisotópico e pico escolher métodos foram utilizados. Para amostras de polímero com massas acima Da 4.000, modalidade linear foi usada com cálculos de massa médios e pico de métodos de colheita. Para melhorar a resolução do sinal, as tensões de fonte do íon devem ser ajustadas em pequenos incrementos, com a tendência geral de maiores massa polímeros com maior tensão diferencial (IS1 contra IS2).
Tempo otimizado a preparação da amostra e aquisição parâmetros podem fornecer precisão, exatidão em massa só pode ser alcançado através da calibração eficaz. O tempo de voo para uma determinada massa pode variar sutilmente com relação a parâmetros de aquisição variável e posições de placa mesmo, portanto uma calibração deve ser efectuada para cada conjunto de parâmetros de aquisição otimizada para produzir massa exata determinações de5,30. Uma vez que os parâmetros de aquisição e preparação da amostra foram otimizadas, o espectro deve ser calibrado usando essas mesmas condições.
Por causa do excepcional resolução e precisão em massa observada nos espectros de massa MALDI-TOF otimizados de polímeros, essa técnica tornou-se uma valiosa ferramenta gratuita para a determinação de dados de distribuição em massa de polímero. No entanto, sua capacidade de resolver as unidades individuais de repetição dentro da distribuição em massa de polímero fornece uma vantagem específica para análise de grupo final em relação ao outro polímero técnicas de caracterização, como cromatografia de permeação de gel (GPC) e nuclear ressonância magnética (NMR). Isto é particularmente valioso para determinar a fidelidade de reações de functionalization grupo final e a natureza quantitativa de reacções de conjugações de grupo final. Este manuscrito tem demonstrado a capacidade de resolver a massa de repetir unidades individuais de polímero, com até dois pontos decimais de precisão em massa, permitindo a confirmação de modificações de grupo final com um elevado nível de confiança. Com os avanços substanciais que têm sido feitos recentemente no campo da síntese do polímero de precisão, MALDI-TOF MS está se tornando uma ferramenta cada vez mais importante para determinar a estrutura macromolecular e funcionalidade.

Com melhorias em visitas técnicas de polimerização, polímeros de precisão com grupos quantitativamente funcionalizados final são cada vez mais disponível1. O desenvolvimento simultâneo de azida-alquino e thiolene clique químicas permitiu o acoplamento quase quantitativo de macromoléculas para outras partes, fornecendo acesso a uma gama de híbridos materiais2,3,4 . No entanto, são necessárias técnicas de analíticas precisas para caracterizar tanto a partida materiais e produtos destas reações de conjugação de polímero. Tempo de dessorção/ionização do laser assistida por matriz de espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF MS) é uma técnica analítica de ionização suave valioso para caracterizar polímeros porque pode gerar íons de polímero em um estado de carga única com mínimo fragmentação de5,6. MALDI-TOF MS tem grandes vantagens sobre outros métodos convencionais de caracterização de polímeros, porque pode fornecer espectros de massa com resolução da n-mers individuais dentro da distribuição em massa de polímero. Como consequência, tais espectros de massa pode fornecer informações precisas sobre o peso molecular médio, repita a unidade de massa e peso molecular dispersity7, que por sua vez pode elucidar mecanismos de polimerização concorrentes tais como transferência de cadeia8 . No entanto, MALDI-TOF MS é particularmente poderoso para fornecer informações sobre o polímero final grupos9,10, que pode ser usado para confirmar o final grupo modificações10,11 e outros transformações12 como polímero cyclizations11,13. Igualmente importante, a relativamente pequena quantidade do analito (submicrogramas) necessários para espectrometria de massa análise torna esta técnica útil para a caracterização, quando somente quantidades de traço de material estão disponíveis.
A análise de MALDI-TOF MS de polímeros pode ser dividida em quatro etapas distintas: preparação, calibragem, aquisição espectral e análise dos dados da amostra. Preparação da amostra é o mais essencial passo para gerar otimizado de espectros de massa MALDI-TOF e ocorre antes que a amostra é introduzida o instrumento14,15. A seleção de um apropriado matriz com parâmetros de solubilidade semelhantes como o analito de polímero é fundamental para obter espectros de massa MALDI-TOF da alta qualidade e diretrizes para a seleção da matriz têm sido relatados em outros lugares14,15, 16,17. Um banco de dados de polímero MALDI "receitas" para a preparação da amostra também foi publicado on-line18. Para polímeros romance, seleção de matriz pode ser abordada primeiro compreender a solubilidade do polímero e selecionando uma matriz com solubilidade similares parâmetros14,19. Polímeros com afinidade protônica alta podem ser protonados pela maioria das matrizes14 (que frequentemente contêm grupos carboxila), mas para outros polímeros, um agente de cationization é necessário14. Íons alcalinos aduto bem com oxigênio-contendo espécies (EG. poliésteres e poliéteres), Considerando que hidrocarbonetos insaturados (ex. poliestireno) aduto com metais de transição como íons de prata e cobre14, 19. porque as amostras de polímero neste experimento continham átomos de oxigênio na espinha dorsal, de sódio ou potássio contra-íons (TFA) foram usados como o agente cationization. Uma vez que os agentes de matrix e cationization foram selecionados, as proporções relativas de analito, agente cação e matriz devem ser cuidadosamente otimizadas para garantir alto sinal de ruído. Neste procedimento, os parâmetros para a preparação da amostra já foram otimizados, no entanto um procedimento de otimização de amostra empírica (passo 1.4.1., Figura 1) que varia sistematicamente as concentrações dos três componentes (analito, cações e matriz) é eficaz para determinar rapidamente suas proporções ideais.
Aquisição de dados também exige a otimização de um número de parâmetros. Os parâmetros mais importantes incluem o modo de íon positivo ou negativo do aparelho, o modo de operação do instrumento (linear versus refletor), a tensão de aceleração e o tempo de atraso de extração. Outra forma que a resolução pode ser aumentada é através da utilização de "reflectron" modo20,21,22,23. Reflectron modo essencialmente duplica a trajetória dos íons ao detector refletindo os íons na extremidade do tubo de voo para um detector perto da fonte enquanto reorientação íons com diferentes ímpetos, e, portanto, aumentando a resolução embora diminuindo a intensidade do sinal. Além disso, espectros de resolução mais elevados podem ser obtidos, diminuindo a potência do laser que minimiza a relação sinal-ruído, diminuindo o número e a energia das colisões e, portanto, reduzindo a fragmentação e heterogeneidades cinética24. Por tuning todos esses parâmetros, os íons podem ser focados para minimizar o efeito de qualquer homogeneidade na posição inicial ou a velocidade que ocorre durante o processo de dessorção do laser. Quando os parâmetros de aquisição são otimizados, resolução isotópica muitas vezes pode ser alcançada para íons com massas superiores a 10.000 Da, embora este também é dependente do comprimento do tubo de voo e o design do instrumento. Mais orgânicos compostos que contêm pelo menos um heteroátomo são propensos a complexantes com cátions alcalinos, tais como lítio, sódio e potássio. Muitos dos metais alcalinos são monoisotopes ou isótopos limitado e, portanto, não ampliar a distribuição.
Enquanto os parâmetros do instrumento podem ser ajustados para otimizar a precisão de dados, precisão dos dados só é alcançado com uma calibração adequada11. Proteínas e peptídeos foram originalmente usados como calibrants devido à sua monodispersity e disponibilidade, mas sofrem de estabilidade variável e a prevalência de impurezas25. Alternativas mais rentáveis e estáveis incluíram aglomerados inorgânicos e polydisperse polímeros26,,27,28,29. Infelizmente, estes apresentam alternativas dispersar massas, que complicam atribuições em massa, bem como massas menores, em geral, tornando-os úteis apenas para calibrações abaixo de 10.000 Da. Para combater estes problemas, Grayson et al. 25 desenvolveu um sistema de calibração MS baseado em dendrímeros, poliéster que é monodisperso e possui tanto ampla matriz e solvente compatibilidade, estabilidade de vida útil (> 8 anos) e menor custo de produção. Com base nos pontos fortes deste sistema, foi selecionado como o calibrant para estas experiências.
Existem dois tipos principais de calibração: interno e externo de30. Quando calibrar externamente, um padrão com massas que suporte isso do analito são colocados sobre a placa de destino MALDI numa posição diferente da amostra que o analito para gerar um espectro de massa separado do qual pode ser gerado um arquivo de calibração. Por outro lado, maior precisão, muitas vezes pode ser conseguido com uma calibração interna, que envolve a mistura de calibrant com o analito para obter um espectro de híbrido com sinais de calibrant e de analito. O procedimento descrito abaixo, foi implementada uma calibração externa. Após a calibração adequada da escala maciça, podem ser adquiridos em massa dados precisos do analito. Para garantir a calibragem mais precisa, é importante que a aquisição de dados ocorre logo após a calibração.
Finalmente, uma vez calibrado o otimizado, conjuntos de dados foram adquiridos, e os dados foram analisados para fornecer informações estruturais sobre os exemplos de polímero. O espaçamento entre n-mers dentro da distribuição do polímero pode fornecer uma medida exata da unidade de repetição em massa. O número de massa molecular média (Mn) e outros cálculos de distribuição de massa (por exemplo, Mw (peso molecular médio de peso) e Đ (dispersity)) também pode ser determinada a partir da distribuição do sinal no espectro de massa ( Passo 4.2 para cálculos). Talvez mais excepcionalmente, no caso de homopolímeros, a soma das massas do grupo da final pode ser confirmada por determinar o deslocamento da distribuição do polímero com relação a massa das unidades de repetição sozinhos. Os espectros de massa MALDI-TOF ricos em informação fornecem dados valiosos de caracterização que são complementares às técnicas de caracterização de polímeros mais tradicionais tais como cromatografia de exclusão, espectroscopia de infravermelho-transformada de Fourier, e ressonância nuclear magnética.

<table><tbody><tr><td>polioxietileno bis(azida) (Mn=2000)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>689696</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>poli(etilenoglicol) 2-amino-etil éter acético ácido (Mn=5000)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>757918</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>poli(L-lactídeo), tiol terminado (Mn=2500)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>747386</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; peptídeo baixo</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS20</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; meio peptídico</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS21</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; peptídeo alto</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS22</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>2,4 dinitrofluorobenzeno</td><td>TCI</td><td>A5512</td><td></td></tr><tr><td>maleimida</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>129585</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1-etinilfluorobenzeno&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>766-98-3</td><td></td></tr><tr><td>trietilamina</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>471283</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>N,N,N',N",N"-pentametildietilenetriamina</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>369497</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Cobre(I)Brometo</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>254185</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38212</td><td></td></tr><tr><td>metabissulfito de sódio</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>13459</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>trifluoroacetato de potássio</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>281883</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>trans-2-[3-(terc-butilfenil)-2-metil-2-propileno]malononitrilo</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>727881 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US</td><td></td></tr><tr><td>ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico</td><td>MilliporeSigma (Sigma)</td><td>C8982</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>tetrahidrofurano</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-1</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>VWR Analítico</td><td>BDH1113-4LG</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de polímeros sintéticos via espectrometria de massa por ionização a laser com matriz assistida por tempo de voo (maldi-tof)

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Existem muitas técnicas que podem ser empregadas na caracterização de homopolímeros sintéticos, mas poucos fornecem tão útil de informações para análise de grupo final como tempo de ionização de dessorção do laser assistida por matriz de espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF-MS). Este tutorial demonstra métodos para otimização da preparação amostra, aquisição espectral, e análise de dados de polímeros sintéticos, usando parâmetros críticos de MALDI-TOF MS. durante a preparação da amostra incluem a seleção da matriz, identificação de um sal de cationization apropriado e ajuste as proporções relativas da matriz, cação e analito. Os parâmetros de aquisição, tais como o modo (linear ou refletor), polarização (positiva ou negativa), tensão de aceleração e tempo de atraso, também são importantes. Espectros dado algum conhecimento da química envolvida na síntese do polímero e otimizando tanto os parâmetros de aquisição de dados e as condições de preparação de amostra, devem ser obtidos com precisão em massa e resolução suficiente para permitir a inequívoca determinação dos grupos final da maioria dos homopolímeros (massas abaixo de 10.000), além da unidade de repetição em massa e a distribuição de peso molecular geral. Embora demonstrado em um conjunto limitado de polímeros, estas técnicas gerais são aplicáveis a uma gama mais ampla de polímeros sintéticos para determinar a distribuição em massa, apesar de determinação de grupo final só é possível para homopolímeros com dispersity estreita.

Um protocolo para o tempo de ionização de dessorção do laser assistida por matriz de caracterização de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) de polímeros sintéticos é descrita, incluindo a otimização da preparação da amostra, espectral aquisição e análise de dados de voo.

Caracterização de Polímeros Sintéticos via Espectrometria de Massa por Ionização a Laser com Matriz Assistida por Tempo de Voo (MALDI-TOF)

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

O objetivo geral deste tutorial do MALDI-TOF MS é ensinar aos usuários sobre a preparação de amostras, aquisição e análise de polímeros durante a caracterização por MALDI-TOF MS. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de caracterização de polímeros, como peso molecular do polímero, dispersão e identidade do grupo final. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação de grupos terminais de homopolímeros. Primeiro, prepare uma série de soluções misturando soluções de matriz, analito e cátions previamente preparadas, variando as proporções relativas dos componentes, de modo que nove misturas de amostras exclusivas sejam feitas.Para este experimento, combine 15 microlitros de solução de poli (L-lactídeo) com 15 microlitros de solução de ácido 2, 5-di-hidroxibenzóico e um microlitro de solução de tricloroacetato de sódio. Pipetar um microlitro de cada mistura de solução para um poço de amostra individual numa placa-alvo MALDI. Adicione as amostras gradualmente em pequenas porções para evitar que a amostra flua para fora do poço da amostra, permitindo que cada alíquota evapore até a secura antes de adicionar uma amostra adicional.Para iniciar a aquisição de dados, primeiro abra o software de aquisição de dados, Flexcontrol. Ejete a plataforma para permitir o carregamento da placa alvo pressionando o botão de ejeção. Coloque cuidadosamente a placa-alvo com o calibrante carregado e as amostras de analito na plataforma na orientação apropriada.Em seguida, use o software de aquisição para injetar a placa alvo na plataforma pressionando o botão de ejeção novamente. Selecione um método de aquisição de dados apropriado pressionando File e escolhendo Select Method. Antes de adquirir dados, certifique-se de que uma faixa de massa apropriada para coletar dados esteja selecionada clicando na guia Detecção e visualizando a Faixa de Massa.No software de aquisição, selecione a posição na placa alvo que corresponde ao analito desejado. Para iniciar a coleta de dados, pressione Iniciar e mova o alvo do laser ao redor da amostra para maximizar o sinal. Usando a barra deslizante no lado esquerdo da janela da câmera, ajuste a potência do laser de forma que a potência mínima necessária para obter a resolução isotópica seja alcançada.Ampliando um pico individual no meio da faixa de massa de interesse, otimize a resolução ajustando a diferença nas tensões de aceleração variando o valor IS2 na guia Espectrômetro. Por fim, otimize a potência do laser reduzindo-a o mais baixo possível enquanto ainda gera uma relação sinal-ruído razoável. Depois que os parâmetros de aquisição forem otimizados, salve o método selecionando File e, em seguida, Save Method As.Certifique-se de que qualquer calibração existente esteja anulada ou em posição de ser substituída pressionando Invalidate Calibration na guia Spectrometer (Espectrômetro).Usando os mesmos parâmetros de aquisição, mova o laser para o sample poço contendo o calibrante selecionando o poço correspondente com o cursor e adquira um espectro pressionando Iniciar. Depois que um sinal suficiente for adquirido, pressione Iniciar para concluir a aquisição dos dados. Depois que um espectro de massa do calibrante for adquirido, selecione o menu suspenso Lista de controle de massa na guia Calibração que corresponde a esse padrão de calibração.Antes de combinar o pico de referência correspondente com cada pico de calibrante selecionado, certifique-se de que um protocolo de seleção de pico apropriado esteja sendo usado selecionando a guia Processamento. Aplique a massa de referência da Lista de Controle de Massa ao sinal correspondente para o espectro de massa do calibrante, selecionando a área à esquerda do pico de interesse e clicando na massa correspondente na lista de controle a ser aplicada. Continue este processo para os picos de calibrante restantes.Readquirir o espectro do analito assim que a escala de massa para os parâmetros de aquisição otimizados tiver sido calibrada. Abra o Analyte Spectrum no software de análise de dados. Aumente o zoom em um pico para identificar se a resolução isotópica foi alcançada selecionando o botão Zoom in X range.Agora, pressione Lista de massa e escolha Localizar para selecionar picos. Se o pico monoisotópico for resolvido, selecione este primeiro pico na distribuição isotópica para determinar sua massa usando um protocolo de seleção de pico monoisotópico. O MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita de poli(L-lactide)tiol terminado e o software de análise foi usado para calcular as características do polímero mostradas aqui.A massa observada para o 26-mer é 1973,62, que é menos 0,07 daltons diferente do valor teórico. Um sinal menor em 2045,74 é indicativo de transesterificação durante a polimerização da abertura do anel do ácido lático. Um pequeno pico em 2057,73 é provavelmente a consequência da iniciação da água durante a polimerização da abertura do anel do monômero lactídeo.MALDI-TOF MS confirma a distribuição estreita do poli(L-lactídeo)tiol terminado após uma reação de tiol-eno com maleimida e software de análise foi usado para calcular as características do polímero mostradas aqui. A massa teórica do 26-mer de poli(L-lactide)tiol terminado corresponde a 2070,56891, que é 0,03 daltons diferente da massa observada. A mesma espécie ionizando com potássio também é observada em 2086.49.Um pequeno pico em 2167,58 é indicativo da mesma impureza da iniciação da água que foi observada no material de partida. O mesmo deslocamento de massa observado para os produtos da reação tiol-eno não ocorre, o que indica que este composto terminado em ácido carboxílico não tinha o grupo final do tiol para sofrer a reação de funcionalização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como otimizar a preparação de amostras e os parâmetros de aquisição de dados, bem como analisar os dados gerados pela caracterização de polímeros por espectrometria de massa MALDI-TOF.

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Química

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Caracterização de Polímeros Sintéticos via Espectrometria de Massa por Ionização a Laser com Matriz Assistida por Tempo de Voo (MALDI-TOF)

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