Name: Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental na biodiversidade do microbioma intestinal em modelo de tumor de cólon em camundongos. Este método normaliza o microbioma antes da intervenção para garantir resultados reprodutíveis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos B. Dalley no núcleo genómica da Universidade de Utah para sequenciamento de biblioteca e K. Boucher no núcleo para conselhos de estatístico e acesso a estes núcleos técnicos suportado pelo prêmio do National Cancer Institute P30 CA042014 Bioestatística da Universidade de Utah. O projeto descrito foi apoiado pelo National câncer Institute subsídios P01 CA073992 e K01 CA128891 e o Huntsman Cancer Foundation.

<ol><li>Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+reduces+the+likelihood+of+alopecia+in+adult+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).</li>
<li>Jankowsky, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+mitigates+cognitive+deficits+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).</li>
<li>Kondo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+ameliorates+a+motor+coordination+deficit+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome--Mecp2+gene+dosage+effects+and+BDNF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome--Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression.</a> Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).</li>
<li>Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+and+gut+inflammation+modify+stress-induced+c-Fos+expression+in+the+mouse+corticolimbic+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system.</a> PLoS One. 8 (1), 54811(2013).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+genetic+activation+of+a+brain-adipocyte+BDNF%2Fleptin+axis+causes+cancer+remission+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition.</a> Cell. 142 (1), 52-64 (2010).</li>
<li>Bice, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Induces+Pericyte+and+IgA-Dependent+Wound+Repair+and+Lifespan+Extension+in+a+Colon+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model.</a> Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+factor+4+functions+as+a+tumor+suppressor+whose+disruption+modulates+colon+cell+proliferation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).</li>
<li>Holmdahl, R., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+littermate+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The need for littermate controls.</a> Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).</li>
<li>Ubeda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+transmission+rather+than+defective+innate+immunity+shapes+the+distinct+intestinal+microbiota+of+TLR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice.</a> J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).</li>
<li>Spor, A., Koren, O., Ley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+effects+of+the+environment+and+host+genotype+on+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).</li>
<li>Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+changes+in+composition+of+intestinal+microbiota+in+neonatal+BALB%2Fc+mice+through+cluster+analysis+of+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers.</a> Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).</li>
<li>Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+methods+in+newborn+C57BL%2F6+mice%3A+a+developmental+and+behavioural+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation.</a> Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).</li>
<li>Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+enrichment+during+postnatal+development+induces+transgenerational+effects+on+emotional+and+reproductive+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+behavioral+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25(2009).</li>
<li>National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="NULL">Institute for Laboratory Animal Research (U.S.)</a>. , National Academies Press. Washington, D.C. 220(2011).</li>
<li>Silver, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSilver%2C+LM+%22Mouse+genetics+%3A+concepts+and+applications%22">Mouse genetics : concepts and applications</a>. , Oxford University Press. New York. (1995).</li>
<li>Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tattooing+Various+Combinations+of+Ears%2C+Tail%2C+and+Toes+to+Identify+Mice+Reliably+and+Permanently%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+Database+Project%3A+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).</li>
<li>Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turicibacter+sanguinis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+a+novel+anaerobic%2C+Gram-positive+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Evol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium.</a> Int J Syst Evol Microbiol. 52, Pt 4 1263-1266 (2002).</li>
<li>Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+lumen+and+mucosa-associated+microbiota+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer.</a> PLoS One. 7 (6), 39743(2012).</li>
<li>16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf">https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf</a> (2017).</li>
<li>Illumina Experiment Manager. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html">https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html</a> (2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li>
<li>Aronesty, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/319159822_ea-utils_Command-line_tools_for_processing_biological_sequencing_data">ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data.</a> Expression Analysis. , Durham, NC. (2011).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Paired Ends Script. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html">http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De-Novo OTU Picking Protocol. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html">http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html</a> (2017).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyNAST%3A+a+flexible+tool+for+aligning+sequences+to+a+template+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.</a> Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Split Libraries Fastq Script. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html">http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De Novo Otus Script. QIIME. , http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Links to Sample Identification. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/documentation/file_formats.html">http://qiime.org/documentation/file_formats.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Validation of Mapping File. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html">http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Link of OTUs to Sample Description Using Mapping File. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html">http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Summarize Taxa Through Plots. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html">http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html</a> (2017).</li>
<li>Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Biome Summarize Table Command. QIIME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://qiime.org/documentation/summarizing_biom_tables.html">http://qiime.org/documentation/summarizing_biom_tables.html</a> (2017).</li>
<li>Moon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+faecal+IgA+levels+determine+extra-chromosomal+phenotypic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation.</a> Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).</li>
<li>Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+16S+ribosomal+RNA+gene+segments+for+the+diagnosis+of+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria.</a> J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+dietary+fiber+intake+and+structural+alteration+of+gut+microbiota+in+patients+with+advanced+colorectal+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma.</a> Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+intestinal+lumen+microbiota+in+an+animal+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer.</a> PLoS One. 9 (6), 90849(2014).</li>
<li>Evans, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+prevents+weight+gain+and+alters+the+gut+microbiota+in+a+mouse+model+of+high+fat+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity.</a> PLoS One. 9 (3), 92193(2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.

Este procedimento permite a análise da microbiota isolado de fezes de enriquecimento ambiental de normal ou tumor rolamento animais a seguir. Porque estas são as grandes experiências que envolvem a reprodução para obter muitos animais de sexos diferentes e de genótipos, normalizar o microbiome entre animais antes do início do experimento é essencial evitar a não-EE relacionados com efeitos na microbiome biodiversidade.
Para consistência entre condições NE e EE, o processo de criação é realizad...

Estudos de enriquecimento ambiental (EE) utilizam parâmetros de complexo habitacional para afetar a estimulação social (habitação grandes gaiolas, grandes grupos de animais), estimulação cognitiva (cabanas, túneis, materiais de nidificação, plataformas) e atividade física (correr rodas). EE tem sido utilizada por muitos laboratórios para compreender os efeitos da atividade aumentada e melhorada de interações sociais e cognitivas na doença início e progressão usando uma ampla gama de modelos do rato, incluindo a alopécia induzida barbeiro, a doença de Alzheimer, Síndrome de Rett e doença tumoral e digestivo vários modelos1,2,3,4,5,6.
Vários modelos de mouse foram desenvolvidos para estudar a tumorigênese de cólon em ratos. Talvez o modelo mais bem definido é o mouse ApcMin . O mouse ApcMin foi desenvolvido no laboratório de William pomba em 19907e tem sido usado como um modelo do rato de mutações no gene APC que são comumente associados com câncer colorretal humano. Em contraste com os humanos abrigando mutações do APC , ApcMin ratos principalmente desenvolvem pequenos tumores intestinais, com ocorrência muito rara de tumores de cólon. No entanto, um alelo Tcf4Het com uma única mutação heterozigoto knockin-nocaute em Tcf4, aumenta vastamente tumorigênese cólon quando combinado com o alelo de ApcMin 8. Recentemente, este modelo de rato da tumorigênese cólon serviu para determinar os efeitos de EE no cólon tumorigênese6. No Bice et al. estudar, os efeitos fisiológicos e fenotípicos de EE nos machos e nas fêmeas de quatro linhas de mouse diferente (tipo selvagem (WT), Tcf4Het / + Apc+ +, Tcf4+ + ApcMin / +, e Tcf4 Het / + APCMin / +)) foram definidos. Talvez a descoberta mais interessante foi que EE aumenta significativamente a vida útil dos animais de rolamento de tumor de cólon tanto masculinos como femininos. Isto demonstrou que EE pode reduzir pelo menos alguns dos sintomas associados a tumorigênese do cólon e melhorar a saúde animal. Notavelmente, este prazo de vida melhorado nos machos não é um resultado direto da tumorigênese reduzido e em vez disso, estava relacionado com o início de uma resposta, incluindo melhoria microbiome biodiversidade6de cicatrização de feridas de tumor.
Vários estudos específicos de EE têm sido publicados com resultados interessantes. No entanto, do ponto de vista técnica, importantes resultados muitas vezes não são traduzíveis para outros laboratórios. Manutenção de metodologias EE idênticas entre diferentes laboratórios é um incrivelmente complexa, não só devido a dispositivos de enriquecimento e habitação usada, mas também roupa de cama, comida, ventilação, reprodução, genética, atividade em sala e do protocolo de animais requisitos, entre outros9,10,11. Um exemplo é a integração de animais, onde os animais devem ser estàvel integrados a colônia de rato, portanto normalizando a composição genética da dieta e plano de fundo, para evitar efeitos relacionados não-tratamento. Além disso, muitos estudos EE foram concluídos antes da realização da importância da microbiome na doença e a maneira que práticas de maneio comuns do mouse podem afetar a composição do intestino microbiome10,12.
Colocação de estratégia e animal de criação em EE pode aumentar o estresse se não for executado corretamente. Desde que estudos EE utilizam grandes números de animais machos e fêmeas e vários genótipos, instalação experimental pode ser difícil dada a exigência de animais de várias ninhadas para ser combinado. Portanto, uma criação e estratégia de desmame foi desenvolvido para permitir a combinação de animais desmamados com o genótipo de correto de ninhadas diferentes. A principal justificativa para isso foi para normalizar a microbiota entre ninhadas e reduzir o estresse, quando os animais foram transferidos para o ambiente experimental. A microbiome foi transmitido do dam10. Para fornecer diversidade microbiana para a colônia, fêmeas foram adquiridas de laboratórios de Jackson e integradas a colônia por um mês antes do início do experimento de10,9,12. Para normalizar mais microbiome biodiversidade entre os animais, as fêmeas foram co alojadas antes da reprodução. Após a criação, habitação comunal durante a criação e a capacidade de escape enfermagem filhotes melhoraram os níveis de estresse de cuidados maternos13,14, possivelmente promover microbiome normalização. Para evitar a não-EE relacionados com efeitos sobre a microbiome, esta habitação comunal de todos os animais experimentais impediu estresse adicional e luta que ocorreu quando combinando vários machos de ninhadas diferentes em uma gaiola experimental. Finalmente, um número igual de animais de todos os genótipos foram incluído nas gaiolas. Isto forneceu a oportunidade para a biodiversidade da microbiota melhorada através de genótipos e removido a contribuição de coprofagia (tendência do animal para consumir fezes) ou possíveis diferenças comportamentais de genótipo específico para o estudo global.
Este protocolo fornece uma estratégia que expande os estudos anteriores EE para incluir aspectos conhecidos de microbiome pesquisa, incluindo integração de colônia transmissão e animal microbiota para normalização da microbiota, para permitir mais uniforme microbiome populações entre animais experimentais. Atendendo a estas precauções é essencial devido à capacidade de não-tratamento relacionados microbiota diferenças para confundir as conclusões do estudo. Eliminação não-EE relacionadas com alterações da microbiota permitirá aos pesquisadores definir especificamente o papel do EE na composição da microbiota durante o desenvolvimento da doença e a progressão.

<table><tbody><tr><td>Teklad Diets / Harlan Labs Chow</td><td>Harlan Labs</td><td>3980X</td><td>Ração irradiada padrão formulada pelo Dr. Mario Capecchi em colaboração com a Harlan Labs.</td></tr><tr><td>Roupa de cama Cell-Sorb Plus</td><td>Autoclave Fangman Specialties</td><td>82010</td><td>antes do uso.</td></tr><tr><td>Sistema de tatuagem AIMS para recém-nascidos</td><td>AIMS</td><td>NEO-9</td><td>https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Outros sistemas e tintas de tatuagem de grau animal podem ser usados com resultados semelhantes, incluindo o Aramis Micro Tattoo Kit.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone Mouse Micro-Isolator System Completo com gaiola, tampa do filtro AllerZone e sistema modular de entrega de dieta</td><td>Produtos de laboratório</td><td>82120ZF</td><td>Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 Dispositivo de Enriquecimento de Vida Útil</td><td>Produtos de Laboratório</td><td>82109ZF</td><td>Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 Cage 13-7/8" Comprimento X 19-1/16" Largura X 7-3/4" Profundidade</td><td>Produtos de Laboratório</td><td>82100ZF</td><td>Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF, e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter top</td><td>Produtos de Laboratório</td><td>82101ZF</td><td>Cada gaiola EE requer um de cada catálogo # 82120ZF, 82100ZF e 82101ZF, bem como dois de 82109ZF. A comida está apenas de um lado.</td></tr><tr><td>Túnel</td><td>Bio-Serv</td><td>K3323 ou K3332</td><td>Conecte gaiolas juntas e use para enriquecimento</td></tr><tr><td>Ilhós para conectar o túnel às gaiolas</td><td>Fabricado pela Oficina de Máquinas da Universidade de Utah</td><td>n/a</td><td>Certifique-se de que o material é resistente à mastigação e autoclavável</td></tr><tr><td>Roda fast-track</td><td>Bio-Serv</td><td>K3250 ou K3251</td><td>Use com iglu de rato e iglu de rato de chão</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Serv</td><td>K3328, K3570 ou K3327</td><td>Use com roda e piso Fast-track</td></tr><tr><td>Mouse Igloo floor</td><td>Bio-Serv</td><td>K3244</td><td>Use com mouse Igloo e Fast-Track</td></tr><tr><td>Mouse Hut</td><td>Bio-Serv</td><td>K3272, K3102 ou K3271</td><td></td></tr><tr><td>Crawl Ball</td><td>Bio-Serv</td><td>K3330 ou K3329</td><td></td></tr><tr><td>Bio-hut</td><td>Bio-Serv</td><td>K3352</td><td>Wood pulp hut usado para abrigar e aninhar</td></tr><tr><td>Filme adesivo&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60941-072</td><td>Utilize para cobrir temporariamente o orifício perfurado em uma gaiola grande para evitar que os ratos escapem</td></tr><tr><td>Rack ventilado de fluxo laminar</td><td>Techniplast</td><td>Bio-C36</td><td>O armário que utilizámos neste estudo não é fornecido de momento. O Bio-C36 é muito semelhante.</td></tr><tr><td>Tubo Microfuge de 1,5 mL - livre de RNAse e DNAse</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool MiniKit</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td>Este kit fornece reagentes para 50 preparações de DNA. Tampão de lise fecal = ASL; Tampão de lise de cloreto de guanidínio = AL; Tampão de lavagem 1 com cloreto de guanidínio = AW1; Tampão de lavagem 2= AW2; Tampão de eluição com banho-maria EDTA = AE</td></tr><tr><td>(capaz de aquecer até 95)</td> <td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td>Para incubação de 94 graus de amostras de fezes para lisar células.</td></tr><tr><td>Banho-maria (capaz de aquecer a 70 graus)</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td>Para incubação de amostras de fezes a 70 graus&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol (200 provas)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro: Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA kit de ensaio de amplo alcance</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>EB Buffer ou 10 mM Tris pH 8.5</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Primers específicos para experimentos</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grau de PCR água</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td>para amplificação de amplicon (1,25 mL permite 100 rxns).</td></tr><tr><td>Agarose para execução de géis de diagnóstico</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape Trace</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td>TapeStation ou instrumentos Bioanalyzer são comuns em Núcleos de Genômica Institucional para analisar a qualidade da biblioteca. Alternativamente, um Bioanalyzer DNA1000 Chip (Agilent, 5067-1504) pode ser usado.</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Grânulos Magnéticos</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Grânulos Magentic Para limpeza de PCR - 5 mL limparão 250 reações de PCR</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Life Technologies</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Guia de Preparação da Biblioteca</td><td>Illumina</td><td></td><td>Illumina. Preparação da Biblioteca de Sequenciamento Metagenômico 16S: Preparando Amplicons de Genes de RNA ribossômico 16S para o Sistema Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.</td></tr><tr><td>Software Único de Indexação Dupla</td><td>Illumina</td><td>Illumina Experiment Manager</td><td>Disponível gratuitamente em: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html</td></tr><tr><td>Nextera XT 96 Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1002</td><td>Usado para adicionar códigos de barras a amplicons</td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poços</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Fixture de Placa de Índice TruSeq</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1005</td><td></td></tr><tr><td>Vedação de placa transparente</td><td>Applied Biosystems /ThermoFisher</td><td>4360954</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher Filme adesivo Microamp</td></tr><tr><td>Sequenciamento por MiSeq com reagentes v3 e leituras duplas de 300 bp</td> Kit de Controle PhiX <td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Proteinase K (600 <td></td></tr><tr><td> mAU/ml)</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>Equivalente a 20 mg/ml de proteinase K. Fornecido com o kit QiaAmp</td></tr><tr><td>Ferramentas de análise de dados</td> Software <td>QIIME</td><td>Qiime</td> A <td>instalação pode variar de acordo com o seu sistema e o site do QIIME descreve várias opções (http://qiime.org/install/install.html). Para este estudo, foi utilizado o pacote de software MacQIIME 1.9.1 (compilado por Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime</td></tr><tr><td>Etapa 13.2.</td><td>Método Qiime</td><td>FastQ Join</td><td>&nbsp;( http://code.google.com/p/ea-utils &nbsp;). &nbsp; Para este estudo, foi utilizada a http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html de múltiplas extremidades pareadas. Aronesty, E. ea-utils: Ferramentas de linha de comando para processamento de dados de sequenciamento biológico. Análise de Expressão, Durham, NC. (2011).</td></tr><tr><td>Etapa 13.3.</td><td>Protocolo de coleta Qiime De-Novo OTU</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.</td><td></td></tr><tr><td>Etapa 13.3.1.</td><td></td><td>Abra Unidades Taxonômicas (OTUs) usando Uclust</td><td>Edgar, R.C. Pesquise e agrupe ordens de magnitude mais rápido que o BLAST. Bioinformática. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).</td></tr><tr><td>Etapa 13.3.1.</td><td>Pynast</td><td>Pynast</td><td>Caporaso, J.G. et al. PyNAST: uma ferramenta flexível para alinhar sequências a um alinhamento de modelo. Bioinformática. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010).&nbsp;</td></tr><tr><td>Etapa 13.3.1.</td><td>Pynast</td><td>Pynast_Greengenes</td><td>DeSantis, T.Z. et al. Greengenes, um banco de dados de genes 16S rRNA verificado por quimera e bancada de trabalho compatível com ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). A versão 13_8 de Greengenes foi utilizada neste estudo</td></tr><tr><td>13.3.1. Observação:&nbsp;</td>Bibliotecas <td>divididas múltiplas</td> do <td>Qiime</td><td>http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.</td></tr><tr><td>13.3.1. Observação:&nbsp;</td>Roteiro <td>de OTUs de novo</td> <td>Qiime</td><td>Pick http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html&nbsp;</td></tr><tr><td>Etapa 13.2.2.</td><td>Qiime</td><td>Crie um arquivo de mapeamento</td><td>http://qiime.org/documentation/file_formats.html.</td></tr><tr><td>Etapa 13.2.2.</td><td>Qiime Valide</td><td>um arquivo de mapeamento</td><td>http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.</td></tr><tr><td>Etapa 13.3.3.</td><td>Qiime</td><td>Vincule a OTU à descrição da amostra para o arquivo de mapeamento</td><td>http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.</td></tr><tr><td>Etapa 13.3.4.</td><td>Qiime</td><td>Resumir táxons por meio de parcelas</td><td>http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.</td></tr><tr><td>Etapa 13.3.5.</td><td>Resumo da tabela</td> do <td>Bioma Qiime</td><td>http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html&nbsp; Neste estudo, todas as amostras foram rarefeitas para 20.000 OTUs, seguidas de análise usando script de rarefação alfa no QIIME.</td></tr></tbody></table>

um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de microbiome cólon em um modelo de tumor de cólon de mouse

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Vários estudos recentes ilustraram os efeitos benéficos de viver em um ambiente enriquecido em melhorar a doença humana. Em camundongos, enriquecimento ambiental (EE) reduz a tumorigênese ativando o sistema imunológico do mouse, ou afeta a sobrevivência animal do tumor rolamento, estimulando a resposta de reparação de ferida, incluindo diversidade microbiome melhorada, no microambiente do tumor. Desde que aqui é um procedimento detalhado para avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade da microbiome em um modelo de tumor de cólon do rato. Precauções em matéria de criação de animais e considerações para integração de colônia de genótipo e mouse animal são descritas, que acabará por afectar a biodiversidade microbiana. Atendendo a estas precauções pode permitir a transmissão de microbiome uniforme mais e consequentemente irá aliviar efeitos dependentes do não-tratamento que podem confundir as conclusões do estudo. Além disso, neste procedimento, as alterações da microbiota são caracterizadas usando 16S rDNA de sequenciamento de DNA isolado de fezes coletadas de cólon distal após enriquecimento ambiental a longo prazo. Desequilíbrio de microbiota do intestino está associado com a patogênese da doença e cólon câncer de inflamação intestinal, mas também de obesidade e diabetes entre outros. Importante, este protocolo para análise EE e microbiome pode ser utilizado para estudar o papel da patogênese microbiome através de uma variedade de doenças onde existem modelos de rato robusto que pode recapitular a doença humana.

Vários estudos têm demonstrado que a prática da medicina mente-corpo melhora os resultados de saúde. Da mesma forma, em ratos, enriquecimento ambiental melhora os resultados, incluindo a melhoria de vida útil e tumor ferida reparo6. Portanto, um procedimento EE foi desenvolvido com o objectivo de definir o papel da microbiota este fenótipo enquanto primeiro normalizando o microbiome antes do início do experimento (Figura 1). Importante...

Enriquecimento ambiental (EE) é um ambiente de alojamento dos animais que é usado para revelar os mecanismos que fundamentam as conexões entre o estilo de vida, estresse e doença. Este protocolo descreve um procedimento que utiliza um modelo do rato da tumorigênese cólon e EE para definir especificamente alterações na microbiota biodiversidade que pode afetar a mortalidade de animais.

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

O principal objetivo desta publicação é apresentar um método para normalizar o microbioma de roedores. Nesta demonstração, o efeito do enriquecimento ambiental no microbioma é testado durante a gênese do tumor de cólon. Este protocolo mostra como a normalização do microbioma antes de uma intervenção de enriquecimento ambiental melhora a reprodutibilidade experimental.Também mostramos como reduzir o estresse animal e melhorar as interações usando um ambiente enriquecido. Embora tenhamos nos concentrado no efeito do enriquecimento ambiental em um modelo de tumor de cólon, o método pode ser facilmente aplicado para entender melhor o papel do microbioma na etiologia da doença. Configure as gaiolas em condições estéreis trabalhando sob um capô ventilado.Os controles para este experimento consistem em gaiolas convencionais com cama e tecido de laboratório para nidificação, mas por outro lado não possuem dispositivos de enriquecimento. Para configurar a criação de filhotes ou gaiolas ambientalmente enriquecidas, conecte duas grandes gaiolas autoclavadas com um túnel protegido por ilhós esterilizados e inclua uma plataforma esterilizada em cada gaiola para aumentar o espaço no chão. Para E

a-method-to-define-effects-environmental-enrichment-on-colon

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós demonstramos um protocolo em que a administração do agente genotóxico azoximetano (AOM), seguido por três ciclos da pró-inflamatória de sódio sulfato de agente de dextrano (DSS) de forma rápida e consistentemente gera tumores do cólon em ratos com semelhanças morfológicas e moleculares para as observadas em humanos colite Associadas cancro.

Câncer de modelagem Colite Associada com Azoximetano (OMA) e sulfato de sódio Dextran (DSS)

Este vídeo descreve o protocolo de isolamento de DNA de amostras de fezes de camundongos portadores de tumor de cólon. O DNA extraído é amplificado usando PCR e o produto é posteriormente limpo usando uma abordagem baseada em esferas magnéticas. Este método pode ser usado para determinar o efeito do enriquecimento ambiental na microbiota do cólon e na mortalidade animal.

Isolamento de DNA microbiano de fezes: estudando o efeito do enriquecimento ambiental na diversidade do microbioma em modelo de tumor murino

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal de camundongo ou segmento pcLoop seguido de injeção intraluminal de marcadores fluorescentes no segmento para estudar a permeabilidade epitelial intestinal.

Geração do modelo de alça de cólon proximal de camundongo: um procedimento cirúrgico para gerar alça de cólon proximal e medir a permeabilidade intestinal pela detecção de marcadores fluorescentes no soro após injeção intraluminal

Este vídeo demonstra um procedimento de transplante de microbiota fecal em um camundongo deficiente em interleucina-10 com inflamação do cólon. Os micróbios fecais colonizados no intestino liberam metabólitos secundários, provocando a liberação de citocinas anti-inflamatórias e reduzindo a inflamação do cólon.

Avaliando os efeitos do transplante de microbiota fecal em um camundongo deficiente em interleucina-10

Descrevemos métodos para monitoramento longitudinal da eficácia da terapêutica para o tratamento de patologias colônicas em camundongos usando um endoscópio rígido. Este protocolo pode ser prontamente utilizado para a caracterização da resposta terapêutica de um tumor individual em camundongos vivos e também para monitorar a potencial recidiva da doença.

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

O enriquecimento ambiental para camundongos requer uma configuração complexa e desafiadora, bem como técnicas abrangentes de criação e manuseio para garantir efeitos metabólicos e anticancerígenos robustos nos camundongos. Este protocolo fornece procedimentos detalhados para reproduzir os efeitos acima mencionados em camundongos.

Um protocolo para alojar ratos em um ambiente enriquecido

Os tratamentos actuais de doenças inflamatórias do intestino (IBD) destinam-se a atenuar os sintomas da doença, mas pode causar efeitos laterais graves. Assim, estratégias alternativas estão a ser investigados em modelos de colite em animais. Aqui, vamos explicar como os efeitos benéficos da dieta suplementos em sinais clínicos IBD são analisados ​​de tal modelo de colite.

Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer o modelo de camundongo com colite induzida por sódio com sulfato de dextrano livre de germes induzido por antibióticos para investigar o papel da microbiota intestinal na regulação dos efeitos positivos do Bacillus cereus na colite.

Investigando os efeitos aliviadores da administração de Bacillus cereus na colite por meio da modulação da microbiota intestinal

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Este protocolo descreve as etapas necessárias para a colonização de camundongos com pks+ Escherichia coli em condições não inflamatórias, bem como métodos não invasivos para validação da colonização e avaliação da expansão de pks+ E. coli nas fezes.

Colonização com Escherichia coli de Murine pks+ Escherichia coli sob condições não inflamatórias

Aprenda a avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental na biodiversidade do microbioma intestinal em modelo de tumor de cólon em camundongos. Este método normaliza o microbioma antes da intervenção para garantir resultados reprodutíveis.

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse (Vídeo) | JoVE Journal

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Explorar mais vídeos