Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse
28 de fevereiro de 2018
Enriquecimento ambiental (EE) é um ambiente de alojamento dos animais que é usado para revelar os mecanismos que fundamentam as conexões entre o estilo de vida, estresse e doença. Este protocolo descreve um procedimento que utiliza um modelo do rato da tumorigênese cólon e EE para definir especificamente alterações na microbiota biodiversidade que pode afetar a mortalidade de animais.
O principal objetivo desta publicação é apresentar um método para normalizar o microbioma de roedores. Nesta demonstração, o efeito do enriquecimento ambiental no microbioma é testado durante a gênese do tumor de cólon. Este protocolo mostra como a normalização do microbioma antes de uma intervenção de enriquecimento ambiental melhora a reprodutibilidade experimental.
Também mostramos como reduzir o estresse animal e melhorar as interações usando um ambiente enriquecido. Embora tenhamos nos concentrado no efeito do enriquecimento ambiental em um modelo de tumor de cólon, o método pode ser facilmente aplicado para entender melhor o papel do microbioma na etiologia da doença. Configure as gaiolas em condições estéreis trabalhando sob um capô ventilado.
Os controles para este experimento consistem em gaiolas convencionais com cama e tecido de laboratório para nidificação, mas por outro lado não possuem dispositivos de enriquecimento. Para configurar a criação de filhotes ou gaiolas ambientalmente enriquecidas, conecte duas grandes gaiolas autoclavadas com um túnel protegido por ilhós esterilizados e inclua uma plataforma esterilizada em cada gaiola para aumentar o espaço no chão. Para EE, também forneça rodas de corrida esterilizadas, túneis, iglus, cabanas, bolas de rastreamento e material de nidificação.
Coloque as gaiolas enriquecidas e de controle no mesmo rack para fornecer ventilação igual. Para reprodução, combine um touro e duas mães potenciais em gaiolas normais. Todas as manhãs, verifique se há tampões vaginais que indicam que o animal acasalou durante a noite.
Se um tampão não for visto, a resistência à sondagem vaginal pode detectar um tampão internalizado. Se uma fêmea tiver um tampão vaginal, transfira-a para uma grande gaiola de criação de filhotes. Até 12 mães prenhes podem ser alojadas nas gaiolas ambientalmente enriquecidas com plataformas, desde que todas tenham parto durante a mesma semana.
Quando os filhotes tiverem de 21 a 28 dias de idade, distribua os machos e fêmeas por genótipo em ambientes controle ou ambientes enriquecidos. Certifique-se de manter uma proporção de cada genótipo em cada gaiola. As gaiolas não enriquecidas podem suportar até cinco ratos, enquanto as gaiolas enriquecidas requerem pelo menos 20 ratos para estimulação social e podem suportar até 41 ratos.
Comece a coletar fezes um ou dois dias antes de sacrificar os camundongos. Sempre colete na mesma hora do dia. Para coletar fezes de animais vivos, cuidadosamente coloque o animal sobre uma gaiola limpa.
Em seguida, colete as fezes defecadas usando uma pinça estéril e transfira para um tubo de microcentrífuga estéril. Se um animal não defecar imediatamente, coloque-o em uma gaiola limpa e espere que o animal defeque, o que pode levar até uma hora. Para coletar fezes de um animal sacrificado, disseque-as para acessar o cólon.
Em seguida, corte o cólon logo abaixo do ceco e coloque-o em um pedaço de papel de filtro. Em seguida, use uma pinça para levantar a parte superior do tubo do cólon e abra o lúmen usando uma tesoura. Corte longitudinalmente distal a proximal para abrir o cólon longitudinalmente.
Em seguida, colete as fezes do cólon distal em um tubo de microcentrífuga estéril usando uma pinça estéril. Armazene as amostras de fezes a menos 80 graus Celsius. Além das fezes, colete outras amostras de tecido do cólon e intestino delgado, microssomas, tecido adiposo e assim por diante.
Utilize um kit comercial para isolar o DNA microbiano das fezes seguindo um protocolo de detecção de patógenos nas fezes. Ao fazer isso, transfira as amostras do freezer de 80 graus Celsius negativos para gelo seco e pese-as. Em seguida, configure um PCR que amplifica o DNA microbiano conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, limpe os produtos de reação usando esferas magnéticas. Para a limpeza, primeiro centrifugue brevemente a placa de PCR do amplicon para agrupar os produtos da reação. Em seguida, vortex as esferas magnéticas para dispersá-las uniformemente e transferir alíquotas de 20 microlitros para cada poço de reação.
Misture bem as esferas com a solução, pipetando todo o volume lentamente 10 vezes. Em seguida, deixe as contas assentarem por cinco minutos. Em seguida, coloque a placa de PCR em um suporte magnético e aguarde dois minutos para que os sobrenadantes desapareçam após a coleta magnética de grânulos.
Em seguida, remova e descarte os sobrenadantes. Em seguida, com a placa ainda no ímã, encha cada poço de grânulos com 200 microlitros de etanol fresco a 80% e aguarde 30 segundos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante.
Repita esta etapa de lavagem uma vez e deixe as contas secarem ao ar por 10 minutos. Agora elui os produtos da reação dos grânulos removendo a placa do suporte magnético e adicionando 52,5 microlitros de Tris a cada poço. Misture completamente as esferas em solução pipetando todo o volume lentamente 10 vezes.
Em seguida, colete as esferas no suporte magnético como antes e transfira 50 microlitros do sobrenadante para uma placa PCR limpa. Cubra a placa com um adesivo transparente e guarde-a a menos 20 graus Celsius por até uma semana. Use o sobrenadante coletado para realizar uma PCR de índice para anexar códigos de barras à sequência do adaptador.
Em seguida, purifique os produtos e prepare a biblioteca indexada para sequenciamento. Em camundongos, o enriquecimento ambiental é conhecido por melhorar a expectativa de vida e o reparo de feridas tumorais. Para definir o papel da microbiota nesse fenótipo, os animais reprodutores foram integrados à colônia de camundongos por pelo menos um mês para normalizar a microbiota.
Em seguida, eles foram criados e sua progênie foi criada em um ambiente enriquecido ou em um ambiente normal. A progênie também era portadora de tumor ou tipo selvagem. Após 16 semanas, os animais foram eutanasiados e amostras de fezes foram coletadas para isolar o DNA microbiano.
Em seguida, a PCR foi usada para amplificar a subunidade ribossômica 16S nas amostras para pesquisar os componentes do microbioma. Os produtos da reação foram então identificados usando indexação de código de barras. Curiosamente, ambientes aprimorados não melhoram a biodiversidade em animais selvagens, mas aumentam muito a biodiversidade em animais portadores de tumores.
Isso demonstra a sensibilidade do método. Esse aumento na biodiversidade foi atribuído a um aumento da presença do filo Proteobacteria com aumentos significativos nas classes alfaproteobacteria e betaproteobacteria e uma diminuição nas gammaproteobacteria patogênicas. O maior aumento na classe de betaproteobactérias foi no gênero Sutterella, um provável comensal envolvido na degradação da imunoglobulina A secretada.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como alterar as práticas de criação para normalizar o microbioma entre animais experimentais antes de iniciar suas intervenções de interesse. Ao realizar este procedimento, lembre-se de que os animais estabeleceram seu território dentro do ambiente. Por causa disso, mudanças no ambiente podem causar estresse que afetará o microbioma do animal.
Uma mudança repentina no comportamento do animal é um sinal físico de estresse. Após este procedimento, micróbios específicos podem ser isolados e caracterizados para testar a suficiência do micróbio identificado na progressão da doença.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental (EE) sobre a biodiversidade do microbioma intestinal em um modelo de tumor de cólon em camundongos. O método enfatiza a normalização do microbioma antes da intervenção com EE para melhorar a reprodutibilidade experimental e explora como o EE influencia a composição do microbioma, particularmente em camundongos portadores de tumor.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa em microbioma
- Biologia do câncer
- Manejo animal
- Biologia molecular
Contexto
- Demonstrou-se que o enriquecimento ambiental beneficia os desfechos de doenças em seres humanos e modelos animais.
- O enriquecimento ambiental pode reduzir a tumorigênese e melhorar a sobrevida em camundongos por meio da modulação das respostas imunes e da reparação de feridas.
- O microbioma intestinal está implicado na patogênese do câncer de cólon, doença inflamatória intestinal, obesidade e diabetes.
- A normalização do microbioma e o manejo cuidadoso dos animais são essenciais para resultados reprodutíveis em estudos do microbioma.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível para avaliar o impacto do EE na diversidade do microbioma intestinal em um modelo de tumor de cólon em camundongos.
- Demonstrar a importância da normalização do microbioma antes das intervenções experimentais.
- Caracterizar alterações na microbiota utilizando sequenciamento de 16S rDNA após exposição prolongada ao EE.
Métodos Utilizados
- Estabelecimento de ambientes controle e enriquecidos para camundongos, incluindo configurações específicas de gaiolas e dispositivos de enriquecimento ambiental.
- Estratégias de cruzamento para garantir a distribuição de genótipos e a normalização do microbioma.
- Coleta de amostras fecais de animais vivos e eutanasiados sob condições estéreis.
- Isolamento de DNA microbiano de amostras fecais utilizando kits comerciais.
- Amplificação de rDNA 16S por PCR, seguida por purificação com esferas magnéticas e marcação com códigos de identificação (barcoding) para sequenciamento.
- Análise da composição microbiana e da biodiversidade pós-sequenciamento.
Resultados Principais
- O enriquecimento ambiental aumentou significativamente a biodiversidade do microbioma em camundongos com tumor, mas não em animais selvagens.
- O aumento na biodiversidade foi principalmente devido à maior abundância de Proteobacteria, especialmente alfafaproteobacteria e betaproteobacteria, com redução nas gammaproteobacteria patogênicas.
- O gênero Sutterella, um provável comensal, apresentou o maior aumento entre as betaproteobacteria.
- A normalização adequada do microbioma e práticas de manejo reduziram variáveis de confusão e melhoraram a reprodutibilidade.
Conclusões
- O protocolo permite uma avaliação robusta dos efeitos do EE sobre o microbioma intestinal em modelos de doenças.
- A normalização do microbioma antes da intervenção é essencial para resultados confiáveis.
- Essa abordagem pode ser adaptada para estudar os papéis do microbioma em diversas doenças utilizando modelos murinos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Normalizar o microbioma em modelos pré-clínicos com camundongos é essencial para reduzir variáveis confundidoras e melhorar a confiabilidade preditiva de estudos de enriquecimento ambiental na pesquisa oncológica. Este método permite uma avaliação robusta de como fatores ambientais modulam a diversidade do microbioma, impactando diretamente a confiabilidade de modelos relevantes para doenças e a descoberta de biomarcadores translacionais. A integração de protocolos de normalização e enriquecimento do microbioma fortalece a descoberta inicial e a triagem de portfólios ao esclarecer os mecanismos biológicos subjacentes à progressão tumoral.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite investigação rigorosa do papel do microbioma na tumorigênese e na progressão da doença.
- Apoia a desmistificação biológica mediante o controle de fatores de confusão ambientais e microbianos.
- Melhora a confiabilidade preditiva na associação entre enriquecimento ambiental e efeitos mediados pelo sistema imunológico e pelo microbioma.
- Facilita a validação funcional de alvos em modelos de camundongos relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara grupos padronizados de animais para ensaios downstream de microbioma e imunologia.
- Aprimora a reprodutibilidade e a produção quantitativa por meio da coleta controlada de amostras e sequenciamento de rDNA 16S.
- Permite a avaliação confiável de intervenções moduladoras do microbioma em pipelines oncológicos.
- Apóia a escalabilidade dos ensaios e a reutilização da plataforma em múltiplos modelos de doenças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos à doença humana ao abordar a patogênese impulsionada pelo microbioma.
- Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica para terapias direcionadas ao microbioma.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados robustos e reprodutíveis do microbioma.
- Apoia a identificação de biomarcadores translacionais associados à modulação ambiental e microbiana.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao estabelecer condições microbiômicas padronizadas antes de intervenções de enriquecimento ambiental em modelos tumorais de camundongo.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre interações entre o microbioma e o ambiente na tumorigênese.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis do microbioma para comparação de condições experimentais.
- Análises: Fornece dados de sequenciamento de rDNA 16S para apoiar a análise estatística de alterações na diversidade microbiana.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas pré-clínicas às doenças humanas por meio da modelagem de mecanismos impulsionados pelo microbioma.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho reutilizável, adaptável a diversos modelos de camundongos relevantes para doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de microbioma-oncologia.
- Valor Operacional: Padroniza o manejo animal e o processamento de amostras para resultados reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência do capital ao minimizar variáveis de confusão.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas direcionados ao microbioma e a intervenções ambientais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manejo animal, análise do microbioma e técnicas de biologia molecular.
- Exige acesso a instalações animais estéreis, instrumentação de PCR e infraestrutura de sequenciamento.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de reprodução, enriquecimento e coleta de amostras.
- Adaptável a diferentes genótipos de camundongos e modelos de doenças, com atenção à integração da colônia e aos controles ambientais.
- As limitações potenciais incluem alterações do microbioma induzidas por estresse e a necessidade de um manejo ambiental cuidadoso.
