Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

O objetivo geral deste procedimento é observar a morfologia e a funcionalidade dos leucócitos dentro do fígado durante o choque séptico. A principal vantagem dessa técnica é que você pode obter vídeos diretos de leucócitos dentro do fígado. Antes da cirurgia, use etanol a 70% para desinfetar a mesa de cirurgia e todos os instrumentos.

Em seguida, configure as ferramentas para cirurgia hepática e ajuste a placa de aquecimento para 37 graus Celsius. Depois de anestesiar os camundongos injetados com LPS ou PBS de acordo com o protocolo de texto, aplique uma pequena quantidade de pomada para os olhos para evitar que a retina seque. Use uma lâmina de barbear e creme depilatório para remover os pelos ao redor do abdômen.

Em seguida, use gaze úmida para limpar o abdômen. Ao realizar uma injeção retroorbital usando uma seringa de insulina, injete 200 microlitros de solução de dextrano vermelho do Texas. Use um marcador para marcar a área subcostal direita do processo xifóide até o final da costela.

Em seguida, aplique iodopovidona no abdômen do camundongo para prevenir infecções secundárias. Use fórceps e tesouras para cortar a epiderme. Em seguida, usando microtesouras e fórceps, abra a cavidade abdominal e exponha cuidadosamente o fígado.

Use cotonetes para estender o lobo lateral esquerdo. Em seguida, despeje 500 microlitros de PBS estéril na cavidade abdominal para evitar que o fígado seque. Coloque o mouse na posição correta de decúbito em uma câmara projetada sob medida e aplique uma pequena quantidade de cola de tecido no leito de silicone.

Em seguida, use cotonetes para prender cuidadosamente o fígado. O tecido hepático é extremamente friável. Nunca use ferramentas afiadas ou pesadas ao expor e segurar o fígado.

Alguns segundos depois, molhe o fígado novamente com 500 microlitros de PBS estéril para evitar que seque. Em seguida, coloque a estrutura de metal no fígado e use porcas para fixá-la firmemente. Sempre coloque as porcas de suporte antes de colocar a estrutura de metal.

Isso ajudará a reduzir a pressão da estrutura de metal. Para realizar imagens intravitais do fígado, execute o software Zen para ligar o laser. Defina o comprimento de onda para 880 nanômetros e defina os canais verde e vermelho.

Em seguida, ajuste a potência do laser de acordo com a intensidade da fluorescência. Coloque a câmara no estágio de imagem e posicione a lente objetiva de imersão em água de 20 potências perto da lamínula. Fixe o aquecedor de borracha de silicone sob o corpo do mouse para manter a temperatura corporal.

Em seguida, extraia 500 microlitros de água destilada na estrutura de metal. Em seguida, posicione a lente objetiva perto do fígado. Ajuste o foco e determine a profundidade e o tempo da área de imagem.

Para imagens de longo prazo, injete meia dose da mistura anestésica Zoletil e Rompun preparada anteriormente para cada hora durante a imagem por razões éticas. Mantenha a temperatura corporal em 37 graus Celsius e sempre fique de olho no mouse, pois os tempos de anestesia diferem para cada mouse. Para analisar os dados, abra o Velocity e importe os dados brutos da biblioteca.

Em seguida, remova o ruído da imagem e tire uma foto. Por fim, ajuste os itens editados para 100% e exporte os arquivos como arquivos JPEG ou TIF para imagens instantâneas e arquivos AVI para filmes. A análise de imagem intravital de camundongos controle mostrou que um pequeno número de neutrófilos estava circulando no vaso sanguíneo.

Considerando que o número de neutrófilos aumentou significativamente em camundongos tratados com LPS. Na condição de LPS, muitos neutrófilos estavam circulando dentro da corrente sanguínea, mas não migraram para fora do vaso. Como visto nesses filmes, em comparação com os camundongos de controle, os neutrófilos nos camundongos tratados com LPS estavam mais firmemente aderidos à superfície luminal do vaso, o que tornava os neutrófilos detectados com mais frequência no vaso.

Além da motilidade dos neutrófilos, macrófagos capsulares hepáticos, ou LCMs, em camundongos CX3CR1-GFP foram observados na superfície do tecido hepático, e não profundamente dentro do tecido. Além disso, os LCMs mostraram pouco movimento ou ativação no fígado, mesmo em camundongos tratados com LPS. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de definir a linha de incisão do processo xifóide até o final do abdômen subcostal direito. Após este procedimento, outros métodos, como injeção de tratamento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como o fígado se recupera de danos e infecções. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de medicina explorarem a reação do leucócito durante a sepse e testarem possíveis medicamentos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expor um fígado com incisão mínima no abdômen. Não se esqueça de que trabalhar com lipopolissacarídeo pode ser extremamente perigoso e precauções como esterilização e lavagem das mãos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.