Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

O objetivo geral deste experimento é diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células semelhantes a hepatócitos de uma maneira adequada para triagem de alto rendimento. As células hepáticas são difíceis de cultivar em laboratório, no entanto, podem ser geradas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas, o que fornece uma plataforma de triagem para identificar tratamentos para doenças hepáticas. A principal vantagem dessa técnica é que um número ilimitado de hepatócitos pode ser gerado a partir de qualquer paciente com doença hepática que recapitule a doença em laboratório.

O procedimento é relativamente fácil de estabelecer, mesmo sem amplo conhecimento da biologia das células-tronco. Sua reprodutibilidade permite que os pesquisadores examinem milhares de compostos sem a necessidade de robótica complexa. Ray Liu, um pós-doutorando, e Paige Lamprecht, uma estudante de pós-graduação, demonstrarão o procedimento hoje.

Primeiro, dilua a proteína de fusão Ecad a 15 microgramas por mililitro com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS, que contém cálcio e magnésio. Cubra placas de cultura de tecidos em suspensão de 100 milímetros com cinco mililitros de matriz diluída e incube a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Após a incubação, remova o substrato e substitua por cinco mililitros de meio de cultura iPSC.

Recupere um frasco de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos criopreservados do nitrogênio líquido. Descongele a 37 graus Celsius até que um pequeno cristal de gelo permaneça. Em seguida, pipete suavemente as células em um tubo cônico estéril de 15 mililitros contendo quatro mililitros do meio de cultura.

Centrifugar as células a 300 G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células com cinco mililitros de meio suplementado com dez micromolares de Y-27632, um inibidor seletivo de uma proteína quinase contendo bobina enrolada associada a Rho. Agora, remova o meio de cultura das placas de cultura de tecidos em suspensão de dez milímetros revestidas com ECAD e adicione cinco mililitros das células.

Quando as iPSCs atingirem cerca de 80% de confluência, remova o meio de cultura e lave uma vez com DPBS sem cálcio e magnésio. Aspire o DPBS e adicione uma quantidade suficiente de solução de EDTA 0,02% para cobrir os pratos. Em seguida, incube as células por até três minutos em temperatura ambiente.

Assim que as células começarem a se soltar, remova a solução de 0,02% EDTA e inunde o prato com dez mililitros de meio M para liberar as células. Ajude no desprendimento de iPSCs por pipetagem suave. Transferir 1/10 das células suspensas por placa de cultura de tecidos revestida com ECAD fresco contendo cinco mililitros de meio M.

Incubar as culturas a 37 graus Celsius sob 4% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio diariamente. Recupere um frasco de 250 microlitros de caldo de matriz gelada com concentração de dois miligramas por mililitro e descongele-o no gelo. Em seguida, combine a matriz descongelada com dez mililitros de DMEM/F12 frio, misturando suavemente usando uma pipeta pré-resfriada para fazer uma concentração final de 0,05 miligramas por mililitro.

Transfira 100 microlitros da matriz diluída para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Incube a placa a 37 graus Celsius sob 4% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por pelo menos uma hora. Após a incubação, descartar a matriz e substituir por 50 microlitros de meio M por poço, repetindo o mesmo procedimento de revestimento com o restante das placas.

Agora, cultive as iPSCs em placas de 100 milímetros até que as células se aproximem de 80% de confluência. Para colher as iPSCs de cada placa de 100 milímetros, aspirar o meio de cultura e enxaguar com cinco mililitros de DPBS. Substitua o enxágue por três mililitros de solução de descolamento celular, como Accutase.

Em seguida, incube por cerca de dois minutos a 37 graus Celsius sob 4% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Assim que as células começarem a se desprender, colha adicionando sete mililitros de meio M. Pipete várias vezes para dissociar as colônias de células em pequenos aglomerados de cerca de três a seis células.

Em seguida, recolher os iPSCs num tubo de centrifugação estéril de 15 mililitros e centrifugar a 300 G durante cinco minutos. Quando terminar, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio M. Distribua uniformemente as células em placas revestidas com matriz de 96 poços, pipetando 50 microlitros de células em suspensão em cada poço usando uma pipeta multicanal.

Em seguida, cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius sob 4% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono e repita os procedimentos de semeadura celular com o restante das placas. Examine as placas de 96 poços por microscopia para garantir que as células cubram pelo menos 70% da superfície de cada poço individual. Para o primeiro ao segundo dia de diferenciação, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de diferenciação baseado em RPMI por poço.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius em oxigênio ambiente e 5% de dióxido de carbono por dois dias com uma mudança diária de meio. Do terceiro ao quinto dia de diferenciação, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de diferenciação baseado em RPMI suplementado com 2% de B27 e 100 nanogramas por mililitro de NA ativo. Cultive as células a 37 graus Celsius em oxigênio ambiente e 5% de dióxido de carbono por três dias com uma mudança média diária. No quinto dia de diferenciação, trate cada poço com 100 microlitros de solução de 0,02% EDTA por 30 segundos e remova a solução imediatamente.

Adicione 100 microlitros de meio de diferenciação fresco à base de RPMI e repita o mesmo procedimento para o restante das placas. Para diferenciação entre os dias seis a dez, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de diferenciação baseado em RPMI. Incube as células a 37 graus Celsius sob 4% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por cinco dias com uma mudança média diária.

Para diferenciação entre os dias 11 a 15, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de diferenciação baseado em RPMI, suplementado com 2%B27 e 20 nanogramas por mililitro de HGF. Incube as células a 37 graus Celsius sob 4% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por cinco dias com uma mudança média diária. Para a diferenciação entre os dias 16 e 20, substituir o meio de cultura por um meio de cultura de células de hepatócitos suplementado com 20 nanogramas por mililitro de oncostatina-M.

Incube as células a 37 graus Celsius em oxigênio ambiente e 5% de dióxido de carbono por cinco dias com uma mudança diária de meio. Na conclusão da diferenciação no dia 20, substitua o meio de cultura por 100 microlitros de meio de cultura de células de hepatócitos frescos suplementado com 20 nanogramas por mililitro de oncostatina-M. Depois de incubar por 24 horas, recupere o meio de cultura em uma placa fresca de 96 poços e armazene a 20 graus Celsius.

Repita o mesmo procedimento de coleta para o restante das placas. Adicione 90 microlitros de meio de cultura de células de hepatócitos frescos suplementado com oncostatina-M em cada poço da placa de 96 poços. Adicione dez microlitros de cada composto escolhido de uma solução de material de trabalho previamente preparada.

Adicione DMSO a 0,2% aos poços de controle para corresponder à concentração final nas amostras tratadas. Depois de incubar por 24 horas, colete o meio de cultura em uma placa fresca de 96 poços e armazene a 20 graus Celsius. Repita o mesmo procedimento de coleta para o restante das placas.

Após cinco dias de tratamento, as células expressam proteínas que são caracteristicamente expressas no Endoderma Definitivo. Após mais cinco dias de diferenciação, o Endoderme se converte em um destino hepático e as células expressam FOXA2 e HNF 4a. Após a adição de HGF, as células expressam proteínas encontradas nos hepatócitos fetais e, ao completar a diferenciação, as células adotam uma morfologia cuboidal com um núcleo contendo nucléolos proeminentes e um grande citoplasma com múltiplas gotículas lipídicas.

A imunocoloração para detectar HNF 4a e albumina no dia 20 de diferenciação mostra que a distribuição dessas proteínas de hepatócitos é semelhante em todos os poços. As iPSCs foram usadas para rastrear compostos redutores de APOB para fornecer um exemplo de uso de hepatócitos derivados de iPSC para triagem de pequenas moléculas. O fator z do ensaio APOB é 0,73, o que confirma a adequação do uso da plataforma para a descoberta de medicamentos.

A proporção pós-droga e pré-droga de APOB foi determinada para cada composto. A identificação dos acertos foi obtida pela análise do escore z. Foram identificados 24 acertos potenciais com uma razão APOB de 0,86 a 0,44.

Após a exclusão de compostos que tiveram um impacto negativo na viabilidade celular, dois compostos foram considerados reprodutíveis para reduzir o APOB. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 25 dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar meio fresco diariamente.

A concentração incorreta de componentes devido à degradação alterará a capacidade de diferenciação das células. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da descoberta de medicamentos explorarem o tratamento terapêutico para doenças hepáticas usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e manter células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e realizar a diferenciação hepática em uma pequena forma de superfície prensada para triagem de alto rendimento.

Não se esqueça de que trabalhar com células-tronco pluripotentes induzidas por humanos pode ser extremamente perigoso e o equipamento de proteção individual, como luvas e jaleco, deve sempre ser usado durante a realização deste procedimento.