Name: Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprenda a coletar e processar linfonodos de animais de grandes porte para análise de RNA. Este protocolo padronizado garante amostras consistentes para estudos transcriptômicos em bovinos, búfalos e outras espécies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostaria de agradecer James Fosse pelo seu excelente trabalho em todos os Videografia e processamento de vídeo; Michael Marti pelo seu excelente trabalho na geração de imagens digitalizadas de gado; Lilia Walther por sua ajuda com a extração do RNA e Bioanalyzer é executado; Mitch Palmer e Carly Kanipe para sua revisão útil e feedback sobre imagens de linfonodo; e os cuidados com animais e pessoal veterinário no centro nacional de doença Animal para todos de seu trabalho árduo e assistência com a pecuária e a preparação para necropsias.

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar. Toda pesquisa é financiada com fundos intramurais do departamento de agricultura dos EUA, Agricultural Research Service. Todas as referências a produtos específicos são fornecidas com a finalidade de reprodutibilidade experimental e não representam qualquer endosso destes produtos pelo governo federal.

A maioria dos estudos de transcriptomic e os protocolos associados concentrar em amostras humanas, rato, rato ou post-mortem. No entanto, investigações em animais e animais selvagens fornecem uma ampla gama de oportunidades para a caracterização da resposta imune à doença, tanto como aplicáveis à medicina veterinária e, no que diz respeito a doenças zoonóticas, a saúde pública. Este protocolo fornecido um resumo das considerações-chave para extração de RNA de alta integridade de tecidos de animais de grandes porte, tais ...

A sequenciação do ARN da transcriptoma de linfonodos fornece a oportunidade para caracterizar a resposta imune dos animais para uma variedade de agentes patogénicos. Enquanto esta metodologia tem sido utilizada extensivamente em camundongos, análises tem recentemente expandido para maiores mamíferos1,2. Pecuária/grandes animais linfonodos podem ser usados para caracterizar respostas do hospedeiro a uma infecção, não só para a sua utilização em estudos de susceptibilidade genética ou vacina e para a identificação de alvos para o desenvolvimento de drogas, mas também como sistemas modelo para estudos em humanos em doenças zoonóticas. Por exemplo, no caso da brucelose (uma doença bacteriana zoonótica que impactos meio milhão de pessoas ao redor do mundo cada ano), apesar do aumento significativamente os custos, estudos em ovinos ou caprinos são mais relevantes para a infecção humana e vacina humana desenvolvimento de modelos animais de laboratório. Modelos de infecção mouse recapitular a infecção do sistema reticuloendotelial, mas não os sinais clínicos característicos3.
Em experimentos com animais grandes em comparação com estudos de animais de laboratório, o processo de tecido colheita necessariamente envolve um atraso maior entre a eutanásia e a coleção de tecido, que apresenta um potencial desafio para a preservação da RNA de alta qualidade. O RNA intacto é essencial para a geração de dados transcriptomic biologicamente relevantes. A geração do RNA de alta qualidade das amostras de tecido é particularmente crítico para estudos de grande patógeno animal realizado em instalações de contenção. Tais estudos são inerentemente mais difíceis de executar, como eles não só exigem aprovado instalações e pessoal altamente treinado, mas também carregam custos financeiros significativos, que, dependendo do trabalho, que podem variar de dezenas a centenas de milhares de dólares. Estes tipos de estudos envolvem também uma colaboração interdisciplinar e o conhecimento interdisciplinar para a sua conclusão, adicionando à sua complexidade. Portanto, formação sobre, desenvolvimento e adesão a um sistema simplificado para a coleta de amostra e preservação fornece benefícios significativos para a jusante estudos moleculares de tecidos de animais infectados.
A coleção de linfonodos maiores apresenta desafios adicionais para a coleta de tecido, em comparação com a amostragem semelhante de murino linfonodos. A preparação para a excisão de amostra exige um conhecimento básico da anatomia do nó de linfa, incluindo as estruturas internas relevantes. A estrutura de um nó de linfa é composta por lóbulos linfoides rodeados por seios cheios de linfa. Estas estruturas são colocadas dentro de uma cápsula fibrosa, resistente. 4 um lóbulo linfoide é "anatômica e funcional unidade básica do nó de linfa" e é composto de folículos, uma unidade profunda cortical e cordões medulares e seios4 (figura 1A). Linfócitos B e T são home aos folículos e profundo corticais unidades, respectivamente. Essas estruturas fornecem um andaime 3D e facilitam a interação entre os linfócitos e antígeno ou células apresentadoras.
Grosseiramente, folículos e unidades profundo corticais podem ser identificadas na superfície de corte como eles contêm uma malha reticular mais densa e aparecem mais escuros do que os seios, que são compreendidos por uma malha reticular mais delicada e aparecem mais leves (figura 1B). Por convenção, os patologistas referem-se às regiões dos gânglios linfáticos como o córtex superficial (folículos), o paracórtex (fundo corticais unidades) e a medula (cordões medulares e seios). Um exame adequado das três regiões tem sido considerado como a melhor prática em diretrizes de exame patológico de rotina para linfonodos5. Observe que há uma variação considerável a consistência, tamanho e cor dos gânglios linfáticos, mesmo dentro de um único animal. Como idade de animais, os gânglios linfáticos tendem a diminuir de tamanho e tornam-se mais firme do que aqueles de animais mais jovens, normalmente devido a um aumento em seu tecido conjuntivo e uma redução do linfoide normal estrutura6,7.
<img alt="Seção transversal do diagrama de linfonodos e tecido real mostrando córtex, paracórtex, medula, folículos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Seção transversal do diagrama de linfonodos e tecido real mostrando córtex, paracórtex, medula, folículos."> Figura 1. Anatomia do nó de linfa. (A), esta imagem mostra a anatomia do nó de linfa, representando estruturas chaves. (B) ainda esta imagem mostra um nó de linfa bovina cortado em secção transversal. Destacam-se as estruturas relevantes/camadas que são visíveis a olho nu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dependendo a questão experimental, linfonodos diferentes será de interesse para a recolha e análise. Linfonodos periféricos são aqueles localizados profundamente no tecido subcutâneo. Nos bovinos, linfonodos periféricos ou superficiais frequentemente utilizados na prática clínica e experimental incluem parótida, submandibular, retrofaríngeos, pré-escapulares, pré-femurais (precrural) e superficial inguinal (supramamários nas fêmeas, escrotal nos machos) ( A Figura 2). Na tabela 1, as propriedades de chaves linfáticos superficiais, conforme descrito no gado sistema8, são descritas. Abaixo, alguns planos de recolha de linfonodo potenciais para doenças infecciosas bacterianas, de gado são apresentados como ponto de partida para a investigação.
Brucella abortus/Brucella melitensis: padrão necropsies por b. abortus-infectados de gado e b. melitensis-cabras infectadas no centro nacional de doença Animal recuperar supramamários das, prescapular e tecido de linfonodo parotídeo , tanto para a moagem para a enumeração de bactérias e para a preparação de RNA para o perfil de expressão acolhimento do RNA. B. abortus regularmente podem ser recuperados em cada um destes gânglios linfáticos em bovinos experimentalmente infectados9. A presença de bactérias em cada um desses tipos de nó de linfa pode ser detectada em b. melitensis-infectados cabras até pós-infecção pelo menos nove meses, utilizando as metodologias baseadas em RNA de nossos estudos (Boggiatto et al, inédito). Salmonela SP.: O prescapular, subiliac (pré-femurais), e linfonodos mesentéricos foram úteis durante a criação de perfil de carcaças de gado para uma prevalência de Salmonella 10,11,12 e seria de interesse potencial para estudos de transcriptomic. Escherichia coli O157: H7: linfonodos mesentéricos (no intestino médio e intestino delgado distal locais) podem ser os sites de uma recuperação ocasional das bactérias em bezerros infectados (mas não em bovinos adultos infectados)13. Leptospirose (Leptospira SP.): uma crônica persistência das bactérias tem sido observada em linfonodos drenam a glândula mamária14. Mycobacterium bovis : Nos bovinos, as bactérias foram recuperada infecção pós-experimental de gânglios linfáticos do mediastino e traqueobrônquica de bezerros15. Além disso, o linfonodo RNA tem sido utilizado para examinar as respostas de grande animal hospedeiro de vírus, tais como a síndrome respiratória e reprodutiva suína vírus2. A Figura 2 mostra a localização de um subconjunto desses principais linfonodos do corpo de bovinos.
<img alt="Localizações dos linfonodos no diagrama da vaca: parótida, submandibular, retrofaríngea, pré-escapular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Localizações dos linfonodos no diagrama da vaca: parótida, submandibular, retrofaríngea, pré-escapular."> Figura 2: Cartoon retratando locais selecionados do nó de linfa no Bos taurus . Os linfonodos numerados são anotados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Este documento e o vídeo associado, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes linfonodos animais para estudos de RNA, projetados para ser informativo para biólogos moleculares envolvidos em estudos de transcriptomic de infecções de animais grandes. Primeiro, nós fornecemos uma visão geral do procedimento de isolamento para os gânglios linfáticos, usando amostragem de tecidos bovinos e bison como exemplos. Emparelhado com esta demonstração, conforme exibido no vídeo, é um fluxo de trabalho para uma amostra de tecido pode ser reproduzido para isolamento de RNA. Em seguida, descrevemos considerações importantes para o processamento de um linfonodo infectado, com foco na segurança, consistência e qualidade do RNA.
A preparação do RNA do tecido com um reagente de isotiocianato de guanidina-fenol acidificado é baseada no método original de Chomczynski e Sacchi16,17, com uma purificação sobre colunas de rotação silicone-baseado na presença de agentes de caotrópicas baseados no trabalho de Vogelstein e Gillespie18original. Também examinamos o potencial para a recuperação do RNA para transcriptomics de gado gânglios linfáticos preservados por métodos alternativos. Finalmente, podemos explorar o impacto da variável tempo sobre a qualidade do RNA em necropsias de animais grandes, incluindo uma experiência representativa, retratando o efeito de um aumento no tempo entre a eutanásia e a amostragem no perfil de RNA recuperado de bison e linfonodos de bovinos. Este artigo será útil não apenas para biólogos moleculares, mas também ao veterinários pesquisadores iniciando estudos transcriptomic.

<table><tbody><tr><td>Solução de preservação de RNA (usamos RNALater para todos os experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml ou 2 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis descartáveis</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tecido, dente de rato</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Outras pinças de tecido disponíveis, incluindo ponta curvada, borda cônica, etc., dependem da preferência do usuário</td></tr><tr><td>Agulhas de biópsia por punção de 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente para objetos cortantes (pequeno e transportável para necropsia)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. tamanho mostrado aqui</td></tr><tr><td>Tábuas de corte ou bandejas descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Disponível em uma variedade de tamanhos, depende da preferência do usuário</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td> de proteção individual <td>Varia com o patógeno (luvas, máscaras respiratórias, óculos, etc.)</td></tr><tr><td>Reagente de extração de RNA à base de fenol (usamos o reagente TRIzol para todos os experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>kit de extração de RNA baseado em coluna de sílica (usamos o kit PureLink RNA Mini para todos os experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Projetado para até 100 mg de</td></tr><tr><td>tecido 100% etanol (200 provas para biologia molecular)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos com tubos de homogeneização fechados (usamos o dissociador gentleMACS para todos os experimentos)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Geral, para eletroforese em gel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X</td><td>TBE Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Também pode fazer do zero em laboratório Formamida</td></tr><tr><td>deionizada</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)</td><td>Espectrofotômetro Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis (usamos o espectrofotômetro NanoDrop)</td><td>Dispositivo ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>para avaliação quantitativa de RNA (usamos o Bioanalyzer, com componentes e protocolos associados)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA FFPE (usamos o Kit de Isolamento de Ácido Nucleico Total RecoverAll para Tecido Fixado em Formalina, Embebido em Parafina)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Espalhador de plástico (espalhador em forma de L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Necessário apenas para testes de esterilidade para amostras de animais infectados</td></tr><tr><td>Facas de necropsia</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do rna: preparando-se para estudos de linfonodo transcriptomic de espécies de animais grandes

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Animais de grandes porte (gado e animais selvagens) servem como importantes reservatórios de agentes patogénicos zoonóticos, incluindo Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellae Escherichia colie são úteis para o estudo da patogênese e/ou propagação das bactérias em hospedeiros naturais. Com a função chave de linfonodos na resposta imune do hospedeiro, linfonodo tecidos servem como uma fonte potencial de RNA para análises de transcriptomic a jusante, a fim de avaliar as mudanças temporais na expressão gênica em células no decorrer de uma infecção. Este artigo apresenta uma visão geral do processo de coleção de nó de linfa, amostragem de tecido e a jusante do RNA processamento em gado, usando bovinos (Bos taurus) como um modelo, com exemplos adicionais provenientes do Bisão-americano (bison Bison ). O protocolo inclui informações sobre a localização, identificação e remoção dos gânglios linfáticos de diversos sites chaves no corpo. Além disso, uma metodologia de amostragem de biópsia é apresentada que permite a uma consistência de amostragem em vários animais. Várias considerações para preservação de amostra são discutidas, incluindo a geração de RNA apropriado para jusante metodologias como a sequenciação do ARN e RT-PCR. Devido os longos atrasos inerentes a estudos de curso de tempo grandes animais vs rato, apresentam-se resultados representativos de bison e tecidos de bovinos do nó de linfa para descrever o tempo de degradação neste tipo de tecido, no contexto de uma revisão da trabalho metodológico anterior na degradação de RNA em outros tecidos. Em geral, este protocolo será útil para ambos os pesquisadores veterinários começando transcriptome projetos em grandes amostras de animais e biólogos moleculares interessados em aprender técnicas para processamento de em vitro e em vivo amostragem de tecido.

O uso das considerações apresentadas neste artigo (passos 1-4 do protocolo) vai ajudar na recuperação do RNA de grandes amostras de animais que é adequada para uma análise a jusante em estudos de expressão de gene de anfitrião. A qualidade do RNA para aplicações a jusante é avaliada através de várias medidas padrão. Por espectrofotometria, a uma260/A280 ratio fornece uma medida da contaminação da proteína, e a uma260/A230 ratio fornece um outro meio de avaliação de pureza que i...

Este protocolo fornece uma visão geral dos procedimentos para o isolamento do RNA para o perfil de transcriptomic do nó de linfa de tecidos de animais de grandes porte, incluindo etapas na identificação e excisão dos gânglios linfáticos do gado e animais selvagens, abordagens de amostragem para fornecer consistência em vários animais e considerações mais resultados representativos para a preservação de pós coleta e processamento para a análise do RNA.

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Olá, meu nome é Dr.Robert Schaut e sou cientista do National Animal Disease Center em Ames, Iowa. Neste vídeo JoVE, compartilharemos com você informações sobre a coleta e processamento de linfonodos de animais de grande porte para uso em experimentos de RNA a jusante. Por exemplo, esses experimentos podem incluir PCR quantitativo em produtos transcritos reversos ou estudos de sequenciamento de RNA de transcriptomas.Os linfonodos são amostras úteis para a avaliação das respostas imunes do hospedeiro, mas também podem fornecer uma fonte de RNA do patógeno para estudo, como é o caso de patógenos intracelulares presentes em células imunes dentro dos linfonodos. Amostras de animais de grande porte, incluindo espécies de gado e animais selvagens, são de interesse no estudo de doenças zoonóticas. Aqui, no Centro Nacional de Doenças Animais, estudamos infecções de gado com espécies como brucella abortus, que causa brucelose em bovinos e bisões, e E.Coli O157: H7 como eliminada das trilhas intestinais de bovinos.Também recuperaremos amostras de tecido de espécies selvagens, como veados e alces. Uma variedade de gânglios linfáticos pode ser coletada de animais infectados com diferentes doenç

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Apresentamos um procedimento cirúrgico para cateterizar o tronco linfático intestinal em porcos neonatais para coletar grandes quantidades de componentes do metabolismo lipídico da linfa eferente.

Long-Term Cateterismo do tronco linfa intestinal e Recolha de linfa no Neonatais Pigs

Aqui, descrevemos uma técnica laparoscópica minimamente invasiva para a amostragem de série do fígado e linfonodos mesentéricos (MLN) em macacos que permite o aumento da frequência de amostragem, e reduz o potencial de complicações cirúrgicas quando comparada a realização de uma laparotomia.

Técnica laparoscópica para a coleção de série do fígado e mesentérica linfonodos em macacos

O objetivo deste trabalho é apresentar um procedimento passo a passo para coletar os diferentes tecidos adiposo brancos de ratos, processar as amostras de gordura e extrair o RNA.

Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para o processamento de codificação (mRNA) e não-codificantes (ncRNA) globina reduzido RNA-seq bibliotecas de uma amostra da unidade de sangue total.

Identificação de codificação e Classes de RNA não-codificante expressa em suínos, sangue total

Este é um protocolo para a preparação óptima do tecido para análises genomic, transcriptomic, e proteômica dos bastões capturados no selvagem. Inclui protocolos para captura e dissecção de morcegos, preservação tecidual e cultivo celular de tecido morcego.

Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias

Aqui, descrevemos um método simples e barato que permite a quantificação de células tumorais adesivos para genimosgenas de nódulos linfáticos (LN). As células tumorais aderentes de LN são prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmadas por um método baseado em fluorescência, dando um índice de adesão que revela a afinidade de ligação celular tumoral ao parenchyma lN.

Quantificação da adesão celular tumoral em crioseções de nó linfático

Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

Esse protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada.

Linfodenectomia Renal Bilateral Murina

Este protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia mesentérica murina segura e bem tolerada em cada uma das quatro estações ao longo da cadeia do linfonodo mesentérico. Esse procedimento é adaptável para permitir a interrupção seletiva da comunicação linfática com o cólon distal, cólon proximal e/ou intestino delgado.

Linfodenectomia mesentérica murina para interrupção seletiva da comunicação linfática com intestino específico de região

Aprenda a coletar e processar linfonodos de animais de grandes porte para análise de RNA. Este protocolo padronizado garante amostras consistentes para estudos transcriptômicos em bovinos, búfalos e outras espécies.

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes (Vídeo) | JoVE Journal

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Explorar mais vídeos