Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Olá, meu nome é Dr.Robert Schaut e sou cientista do National Animal Disease Center em Ames, Iowa. Neste vídeo JoVE, compartilharemos com você informações sobre a coleta e processamento de linfonodos de animais de grande porte para uso em experimentos de RNA a jusante. Por exemplo, esses experimentos podem incluir PCR quantitativo em produtos transcritos reversos ou estudos de sequenciamento de RNA de transcriptomas.

Os linfonodos são amostras úteis para a avaliação das respostas imunes do hospedeiro, mas também podem fornecer uma fonte de RNA do patógeno para estudo, como é o caso de patógenos intracelulares presentes em células imunes dentro dos linfonodos. Amostras de animais de grande porte, incluindo espécies de gado e animais selvagens, são de interesse no estudo de doenças zoonóticas. Aqui, no Centro Nacional de Doenças Animais, estudamos infecções de gado com espécies como brucella abortus, que causa brucelose em bovinos e bisões, e E.Coli O157: H7 como eliminada das trilhas intestinais de bovinos.

Também recuperaremos amostras de tecido de espécies selvagens, como veados e alces. Uma variedade de gânglios linfáticos pode ser coletada de animais infectados com diferentes doenças. Estudos de tecidos nessas espécies hospedeiras naturais são geralmente mais relevantes para a progressão natural da doença do que modelos de camundongos.

No entanto, o processo de coleta de tecidos de espécies grandes é necessariamente mais complicado do que de camundongos, incluindo o maior atraso entre a eutanásia e a coleta de tecidos e um tamanho maior dos gânglios linfáticos. Aqui, apresentaremos um protocolo para o isolamento de linfonodos de grandes animais para estudo de RNA que será informativo para biólogos moleculares envolvidos nos estudos transcriptômicos de infecções de grandes animais, bem como pesquisadores veterinários que iniciam estudos transcriptômicos. Neste vídeo, demonstraremos procedimentos em gânglios linfáticos para bovinos.

Antes da necropsia, recomendamos a montagem dos seguintes suprimentos específicos para o procedimento de isolamento tecidual. Tubos de microcentrífugas preenchidos com cerca de 1 ml de conservante de tecido de RNA, como RNAlater, bisturis descartáveis, pinças limpas e em autoclave, agulhas de biópsia, um recipiente para perfurocortantes para bisturis e agulhas usados e uma tábua de corte ou bandeja descartável, dependendo do nível de infectividade dos materiais envolvidos. Neste caso, demonstraremos os principais elementos do procedimento usando gânglios linfáticos que geralmente coletamos do gado.

Eles estão infectados com bactérias que causam brucelose. Estes são os linfonodos pré-escapulares e o linfonodo parótido. Ao realizar uma necropsia de animais grandes para recuperação de RNA, é útil ter pelo menos três participantes trabalhando em tecidos animais.

O dissector um será responsável pelo corte de animais grandes de diferentes partes do animal, o dissector dois recuperará os linfonodos de diferentes seções de animais na mesa de necropsia principal e o dissector três trabalhará em uma mesa separada para isolar seções de cada linfonodo e transferi-los para tubos com solução conservante. Começaremos com a identificação e remoção do linfonodo pré-escapular. Idealmente, a palpação de um linfonodo, antes da dissecção, ajudará a identificar a localização do linfonodo.

Embora nem sempre seja possível detectar, o linfonodo pré-escapular é tipicamente palpável em um animal saudável. Comece colocando o animal em decúbito lateral. Estenda o ombro movendo o membro da frente para trás na altura do joelho.

Esse movimento trará o ombro para trás e permitirá uma fácil palpação do linfonodo. Sinta a presença do linfonodo conforme mostrado. Uma vez localizado, e com o ombro ainda estendido, use um bisturi ou faca de necropsia para fazer uma incisão na pele ao longo do contorno do ombro.

Retraia a pele para revelar o ponto da musculatura do ombro e pescoço. Uma seção de gordura subcutânea às vezes é observada, especialmente em animais supercondicionados. O linfonodo pré-escapular é freqüentemente encontrado com seções de gordura subcutânea.

Aqui você pode ver as três camadas da pele, músculo e gordura subcutânea. Mais uma vez, palpe a localização de um linfonodo. Ao contrário da gordura subcutânea, o linfonodo manterá sua forma quando palpado.

Depois de localizar o linfonodo pré-escapular, disseque cuidadosamente a gordura subcutânea e disseque o linfonodo. A aparência desses gânglios linfáticos no bisão, que usamos em estudos de brucelose devido à suscetibilidade do bisão na área da Grande Yellowstone à brucela, é semelhante. Aqui, demonstramos a aparência do linfonodo pré-escapular, dissecado do ombro direito de um bisão americano.

Em seguida, passaremos para o isolamento do linfonodo parótido. Com o animal em decúbito lateral, localize a articulação temporomandibular. Usando um bisturi ou faca de necropsia, faça uma incisão na pele com cuidado.

Comece dorsal à articulação e estenda verticalmente ao longo da linha da mandíbula. Disseque a pele para revelar o tecido subcutâneo. A glândula salivar parótida será visível, primeiro devido ao seu tamanho grande, aparência de superfície lobulada e coloração vermelha.

Usando uma pinça e bisturi, mova a glândula salivar parótida para o lado para encontrar o linfonodo parótida situado apenas cranial e medial à glândula salivar. Ao isolar o linfonodo parótido, é fundamental separar o tecido linfonodal do tecido da glândula salivar parótida. Os tipos de tecido parecem distintos, inclusive dentro da seção transversal do tecido.

Isso pode ser observado aqui, com o linfonodo parótida à esquerda e a glândula salivar parótida à direita. Certifique-se de examinar cuidadosamente o tecido do linfonodo parótida quanto à textura antes de processar mais. Em alguns casos, pode ser necessário excisar a glândula salivar parótida para localizar o linfonodo parótido.

Aqui está um exemplo de uma glândula parótida excisada de um novilho, na qual o linfonodo estava embutido na glândula salivar e não era visível antes da remoção da glândula. Informações adicionais sobre a identificação de linfonodos selecionados são fornecidas no manuscrito principal. Uma vez que os gânglios linfáticos tenham sido coletados, você está pronto para extirpar seções para preservação.

Use um bisturi ou faca de necropsia, remova uma seção do linfonodo e faça um corte sagital para abrir o linfonodo. Examine o interior do linfonodo, especialmente em amostras de animais infectados, procurando assimetrias, lesões, diferenças de cor, etc. Neste linfonodo pré-escapular bovino, várias características são visíveis a olho nu.

Isso inclui folículos que abrigam linfócitos B e unidades corticais profundas, que abrigam células T. Essas razões parecem mais escuras do que os seios medulares, que são mais claros. Aqui, outro exemplo de um linfonodo não infectado é descrito.

Este linfonodo é de um bisão mais jovem. Observe que os folículos são menos distintos neste exemplo. Para seccionar tecidos para processamento, uma opção é coletar pequenos pedaços de tecido de cada linfonodo com um bisturi para posterior recuperação do RNA.

No entanto, um grande desafio na comparação de perfis de expressão entre amostras é o grande tamanho dos linfonodos de animais grandes, em comparação com um linfonodo de camundongo que pode ser facilmente extraído inteiro para extração de RNA. Como resultado, pequenas seções de tecido não capturam uniformemente o perfil das células em um linfonodo. Em vez disso, para capturar células em todo o perfil de um linfonodo, retire uma cunha em forma de torta do linfonodo, corte em pequenos pedaços com espessura não superior a 5 mm e coloque, com uma pinça, em tubos contendo RNAlater.

Como alternativa, utilize metodologias de biópsia para extirpar seções de tecido de cada linfonodo. Selecione a ferramenta de biópsia por punção se desejar coletar seções específicas, como folículos específicos do nódulo e, em seguida, transferir, com fórceps, para RNAlater. Depois que as amostras forem transferidas para o RNAlater, transfira-as de volta para o laboratório e armazene-as a 4 graus Celsius durante a noite para permitir a penetração do tecido.

Depois, elimine o excesso de RNA e armazene amostras de tecido a 80 graus Celsius. Uma vantagem do uso de solução conservante de RNA é que o nitrogênio líquido não é necessário na necropsia, nem na coleta de amostras do campo. Antes de acessar as amostras, pré-alíquota do reagente Trizol em tubos para homogeneização.

Depois que as amostras forem removidas do freezer, transfira-as imediatamente para o reagente Trizol para processamento subsequente, com base nas recomendações do fabricante. Aqui, um pedaço de 50-100mg de tecido é transferido para o reagente Trizol. Limite o descongelamento antes da adição de Trizol o máximo possível.

O armazenamento em gelo seco pode ser usado quando várias amostras são removidas do freezer para processamento. Coloque os tubos no homogeneizador e homogeneize no reagente Trizol. Aqui, uma configuração de extração de RNA de dois minutos é usada.

Quando terminar, verifique se há uma aparência turva. Repita se necessário. Siga o protocolo do fabricante para gerar camadas aquosas e orgânicas para cada amostra.

Remova a fase aquosa clara superior com uma ponta de pipeta. Transfira para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, misture com um volume igual de 100% de etanol.

Homogeneizar. O tubo geralmente parecerá turvo. Com uma ponta de micropipeta, transfira o líquido para uma coluna de centrifugação comercial à base de sílica para purificar ainda mais e depois eluir seu RNA.

Para avaliar a qualidade do RNA, coloque um ou dois l da amostra de RNA eluída em um espectrofotômetro para análise. Após a conclusão do procedimento, observamos taxas de absorbância de aproximadamente dois para a proporção 260-280 e a proporção 260-230, indicando uma alta pureza com transporte químico mínimo. A contaminação por fenol seria observável a partir de uma diminuição na taxa de absorbância de 260-230 nm.

Durante o procedimento de necropsia, no caso de animais como o bisão, observamos um período de tempo de pelo menos 20 minutos entre a eutanásia e a transferência da primeira amostra de tecido para o conservante. Em contraste, os gânglios linfáticos de camundongos podem ser removidos e preservados após a eutanásia em questão de minutos. Portanto, estávamos interessados em caracterizar o perfil de degradação dos linfonodos ao longo do tempo.

No manuscrito principal, também compilamos um resumo dos perfis de estabilidade do RNA em uma variedade de outros tipos de tecidos que foram testados em outras publicações. Em experimentos representativos, conduzidos com linfonodos de bisão, a estabilidade do RNA foi relativamente consistente ao longo de uma hora após a eutanásia. Aqui, descrevemos uma imagem em gel de RNA total purificado de pedaços de tecido linfonodal supramamário de um bisão americano.

Esse achado é consistente com dados anteriores para outros tipos de tecidos compilados da literatura. Isso sugere que amostras de qualidade aceitável para análise a jusante da expressão gênica podem ser coletadas até mesmo de espécies mais desafiadoras, como bisões e alces. No entanto, é importante entender que tempos mais longos entre a morte e a preservação da amostra podem resultar em alterações nos perfis de expressão de RNA, incluindo aumento na degradação de três extremidades principais dos transcritos de mRNA.

Portanto, ainda é importante utilizar um fluxo de trabalho rápido e simplificado para a recuperação do tecido, a fim de reduzir ainda mais o atraso, uma vez que o animal esteja disponível para necropsia, a fim de obter os perfis de RNA mais biologicamente válidos. Além disso, observamos que deve-se tomar cuidado durante todo o procedimento para evitar a introdução de contaminantes de RNA nas amostras ao longo do processo, além daqueles que já estão presentes nos tecidos. Isso inclui o uso de luvas como parte do outro equipamento de proteção individual necessário.

Também alíquota do produto final de RNA em vários tubos para limitar ao máximo o freestalling de amostras de RNA. Por exemplo, alíquotas separadas podem ser armazenadas para uso em testes de controle de qualidade. Em resumo, neste vídeo, fornecemos informações importantes para o uso na identificação, coleta, amostragem representativa e processamento de linfonodos para análise de expressão gênica a jusante.

Embora nosso vídeo representativo tenha sido demonstrado com exemplos de gado e bisão, também trabalhamos com linfonodos de outras espécies grandes, incluindo cabras e alces. Esperamos que você ache este vídeo útil em seu trabalho, seja você um cientista veterinário considerando o uso de métodos transcriptômicos em seu trabalho ou um biólogo molecular interessado em se aventurar no campo da ciência de animais de grande porte.