Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica

O objetivo geral deste procedimento é gerar seções de biofilme embebidas em parafina que podem ser usadas para avaliar a distribuição da expressão gênica conforme relatado pela produção de proteínas fluorescentes dentro de morfologias nativas intactas. Este método pode ajudar a responder questões-chave no estudo de comunidades microbianas, como a expressão de genes específicos na produção de substâncias exopoliméricas distribuídas no contexto da arquitetura de biofilme nativo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise da expressão gênica dentro da morfologia preservada das seções transversais do biofilme, ao mesmo tempo em que é passível de tratamentos a jusante, como coloração de características distintas e imagens de alta resolução, como microscopia confocal ou eletrônica.

Depois de preparar a solução de ágar-triptona de acordo com o protocolo de texto, use um tubo cônico de 50 mililitros para despejar 45 mililitros da solução em um prato quadrado de 100 milímetros por 100 milímetros. Deixe o ágar-ágar solidificar por aproximadamente 20 a 30 minutos. Despeje uma segunda camada de 15 milímetros em cima da primeira camada, deixe solidificar durante a noite e, se necessário, use um lenço de papel sem fiapos para remover a condensação das tampas.

Em seguida, para detectar biofilmes de colônias, após o cultivo de uma única colônia isolada de P.Aeruginosa a partir de um estoque congelado de acordo com o protocolo de texto, pipetar 2,5 a 10 microlitros de suspensão celular em uma placa de bicamada média. As colônias podem ser incubadas no escuro a 25 graus Celsius em 80 a 100% de umidade relativa por até quatro dias. Despeje delicadamente 15 mililitros da solução de ágar sobre o meio de crescimento e a colônia e deixe o ágar formar um gel em temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, use uma lâmina de barbear afiada para cortar um mandril quadrado de três camadas com a colônia laminada entre as duas camadas superiores. Se estiver preparando várias amostras, certifique-se de que cada mandril seja cortado em um tamanho comparável. Remova cuidadosamente qualquer excesso de ágar da colônia contendo o mandril.

Em seguida, molhe a cabeça chata de uma espátula em PBS ou água e insira-a suavemente entre as camadas superior e inferior do ágar. Transfira imediatamente a colônia laminada para um de incorporação rotulado com uma caneta marcadora resistente a produtos químicos. Coloque o de embutir em uma mala direta de vidro contendo o fixador previamente preparado.

Processe as amostras. Use 1X PBS para lavá-los duas vezes por uma hora cada. Para obter melhores resultados, automatize a homogeneização do reagente usando a configuração baixa na função de centrifugação de um processador automático de tecidos.

Para incorporar as amostras, encha um molde de cera com cera de parafina derretida aquecida a 55 graus Celsius e, em seguida, use uma espátula plana aquecida para transferir rapidamente o mandril infiltrado do de incorporação para o molde de cera, garantindo que o mandril fique paralelo à base do molde. Deixe a cera solidificar durante a noite a quatro graus Celsius. Amostras moldadas em cera sólida podem ser armazenadas indefinidamente a esta temperatura.

Depois que a cera solidificar, retire a amostra do molde e use uma lâmina de barbear para aparar o excesso de cera ao redor da amostra. Deixe um pouco de cera que se estende de uma extremidade da amostra que pode ser usada para prendê-la no micrótomo. É importante aparar a amostra embebida em cera de forma que sua forma facilite a coleta de fitas lineares lisas.

Pequenas imperfeições no corte podem produzir artefatos na fita e comprometer a integridade da seção. Em seguida, aqueça um banho-maria a 42 graus Celsius. Em seguida, prenda a amostra no micrótomo com a superfície da colônia orientada perpendicularmente à borda da lâmina.

Apare a amostra em intervalos de 50 micrômetros até que o plano desejado da colônia seja alcançado, a partir do qual as seções serão coletadas usando um micrótomo ajustado para uma velocidade de corte de 75 a 80 RPM e um ângulo de folga de seis a 10 graus. Corte uma fita com o número desejado de seções de 10 micrômetros de espessura. Em seguida, use um pincel de ponta fina para soltar a fita da lâmina.

Agora, com uma pinça ou uma gota d'água na ponta de uma pipeta Pasteur, transfira suavemente a fita para o banho-maria. Insira imediatamente uma lâmina no banho-maria e posicione-a abaixo da fita em um ângulo de 45 graus. Toque a borda estreita da fita no slide logo abaixo da etiqueta fosca.

A fita deve aderir. Puxe a corrediça para fora do banho-maria e ajuste o ângulo para que fique perpendicular à superfície da água, permitindo que a fita fique plana contra a lâmina ao longo de seu comprimento. Evite prender o excesso de água sob a fita.

Coloque suavemente a corrediça em um lenço absorvente sem fiapos, absorvendo o excesso de água da seção. Em seguida, coloque a lâmina sobre uma toalha de papel e deixe-a secar no escuro em temperatura ambiente durante a noite. Aqueça uma placa quente nivelada a 45 graus Celsius e coloque a lâmina na placa por 30 a 60 minutos.

A cera ficará semi-derretida e achatada contra a lâmina. Levante suavemente a lâmina da placa quente e coloque-a plana sobre uma superfície lisa e nivelada em temperatura ambiente por aproximadamente um minuto até que a cera solidifique. Certifique-se de que a cera derretida não puxe para nenhum dos lados da lâmina.

Com as amostras dentro de uma mala direta de vidro, descere as lâminas em quatro lavagens de agente de limpeza por cinco minutos cada. Use um aspirador Buchner para remover a solução entre as lavagens. Use 100% de etanol para lavar as lâminas três vezes por um minuto cada.

Em seguida, depois de reidratar as lâminas de acordo com o protocolo de texto, monte imediatamente as seções em um meio de montagem com buffer tris e aplique uma lamínula. O ágar de sobreposição ao redor da seção não reage com o fixador, portanto, não adere à lâmina de acelga. Este ágar pode se desalojar durante a reidratação e danificar a seção, portanto, deve-se tomar cuidado para não agitar a solução durante a reidratação.

Deixe o meio de montagem polimerizar à temperatura ambiente durante a noite. Depois de polimerizado, use esmalte transparente para selar a lamínula na lâmina. Por fim, guarde as lâminas seladas indefinidamente no escuro a quatro graus Celsius.

Embora a imagem DIC usando uma objetiva de imersão em óleo de 40 vezes possa ser suficiente para mostrar algumas características morfológicas de seções finas de biofilme, a microscopia de fluorescência de cepas projetadas para expressar constitutivamente proteínas fluorescentes fornece visualização aprimorada da distribuição celular dentro das amostras. Conforme mostrado nesses painéis, as imagens de seções individuais podem ser costuradas para gerar uma seção transversal de toda a colônia e fornecer contexto para a localização de características estruturais dentro da morfologia geral no nível macroscópico. O uso de uma cepa projetada para expressar proteína fluorescente sob o controle de um promotor específico permite a visualização da distribuição da expressão gênica.

Além disso, as colônias podem ser cultivadas em corantes contendo meios, ou corantes podem ser adicionados pós-seccionamento a polissacarídeos específicos de manchas. Finalmente, as amostras também podem ser preparadas e visualizadas em resolução mais alta usando microscopia eletrônica de transmissão, conforme apresentado aqui. É importante, ao tentar este procedimento, estar atento à fragilidade das amostras e ao potencial de introduzir artefatos fluorescentes e estruturais, seja por meio de fixação, seccionamento ou reidratação, o que pode influenciar sua interpretação dos dados.

Este procedimento permite uma análise quantitativa de imagens, como correlacionar os perfis de expressão de repórteres fluorescentes com características morfológicas e o eixo Z de um biofilme. Este protocolo pode ser aplicado a diversas espécies de micróbios formadores de biofilme com importância médica e industrial, como Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae e Bacillus subtilis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e preparar biofilmes de colônia para seccionamento por meio de incorporação de parafina.