Um sistema de Microbiomechanical para estudar a formação de varizes e a recuperação no axônio do neurônio Central

O objetivo geral dessa configuração de fluido pressurizado é produzir inchaços repetíveis e consistentes ao longo dos axônios dos neurônios cultivados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da lesão cerebral, como os mecanismos por trás das alterações morfológicas subcelulares nos neurônios após a lesão. A principal vantagem dessa técnica é que o método produz mudanças morfológicas consistentes e repetíveis que se recuperam com o tempo.

Esta é uma técnica muito importante que desenvolvemos no laboratório. Isso ocorre porque podemos não apenas usar o sistema para identificar o mecanismo molecular que governa a mudança na morfologia do axônio induzida pelo estresse mecânico como uma nova forma de plasticidade neuronal, mas também usar o sistema como uma ferramenta de triagem para identificar novos medicamentos e a estratégia de tratamento para lesão cerebral leve ou traumática. Para iniciar este procedimento, coloque uma ou mais caixas de lamínulas de 12 milímetros ou 25 milímetros em um béquer de vidro contendo ácido nítrico a 70% e incube as lamínulas em temperatura ambiente durante a noite.

No dia seguinte, transfira todas as lamínulas para um copo de quatro litros cheio de 2,5 litros de água bidestilada Agite o copo que contém as lamínulas por uma hora a 100 RPM e não se esqueça de usar elásticos para segurar o copo durante a agitação. Em seguida, transferir as lamínulas limpas para um balão seco com a tampa metálica.

Asse as lamínulas em forno a 225 graus Celsius por seis horas. Em seguida, deixe-os esfriar até a temperatura ambiente e guarde-os em um recipiente de plástico esterilizado até o uso. Agora, coloque uma lamínula em cada poço de uma placa de 24 poços.

Adicione 30 microlitros de solução de revestimento de lamínula em uma lamínula de 12 milímetros e agite. Depois, adicione um mililitro de PBS estéril a cada poço. A placa pode ser usada imediatamente ou armazenada a quatro graus Celsius em PBS estéril por até uma semana.

No dia da dissecação, remova o PBS da placa. Seque ao ar livre e coloque a placa sob luz ultravioleta por duas a quatro horas. Para dissociar os neurônios do hipocampo para cultura, descongele a solução enzimática de protease e pré-aqueça o meio de plaqueamento a 37 graus Celsius.

Em seguida, enxágue o hipocampo dissecado com SLDS. Em seguida, remova-o e adicione dois mililitros de solução enzimática de protease e incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois, lave os explantes do hipocampo com cinco a 10 mililitros de meio de revestimento duas vezes e adicione cinco mililitros de meio de revestimento.

Dissocie os explantes do hipocampo em células únicas, gerando um pequeno vórtice usando uma pipeta com uma ponta de plástico de um mililitro. Pipete para cima e para baixo cerca de 40 vezes, evitando a formação de bolhas de oxigênio até que a solução fique turva e não restem grandes pedaços de explante. Em seguida, centrifugue as células a 1.125 vezes a gravidade por três minutos.

Remover o sobrenadante com as células submersas em meio e ressuspender as células em 145 mililitros de meio de plaqueamento. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão celular por poço a uma placa de 24 poços. Incube as células no meio de plaqueamento a 37 graus Celsius por duas a quatro horas.

Em seguida, remova o meio de revestimento e substitua-o por um novo meio de manutenção. Após dois dias, substitua metade do meio por dois RSC micromolares dissolvidos em meio de manutenção para inibir o crescimento de fibroblastos, células endoteliais e gliais. Em seguida, depois de expor as células ao RSC por dois dias, substitua o meio por um novo meio de manutenção.

Para transfectar para a visualização da morfologia celular, diluir a construção do estoque a um micrograma por microlitro em meio Opti-MEM e vórtice. Em seguida, dilua o reagente de transfecção mediado por lipossomas em meio Opti-MEM e vórtice. Posteriormente, prepare uma diluição de construção e uma diluição de transfecção para cada poço.

Em seguida, prepare uma mistura um-para-um da construção e do meio Opti-MEM e do reagente de transfecção e do meio e vórtice Opti-MEM. Incube a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos. Após 20 minutos, remova metade do meio de cada poço e transfira esse meio para um tubo cônico limpo.

Mantenha o tubo na incubadora e, em seguida, adicione 100 microlitros da mistura preparada na etapa anterior ao meio restante no poço. Deixe as células incubarem a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Durante a incubação, adicione um volume de meio de manutenção fresco ao meio no tubo cônico e coloque a mistura na mesma incubadora.

Após a incubação, remova os meios que contêm a solução de transfecção dos poços e substitua-os pela mistura um-para-um de meio de manutenção antigo e fresco no tubo cônico. Neste procedimento, insira a pipeta na tampa rosqueada do micromanipulador para mantê-la no lugar. Aparafuse o parafuso de topo plano de metal preso ao braço do micromanipulador de modo que ele segure a extremidade não puxada da pipeta logo acima de onde o tubo de borracha está conectado.

Incline a pipeta em um ângulo de 45 graus com a superfície do neurônio contendo lamínulas. Ligue o filtro de florescência. Abra a abertura e certifique-se de que um ponto fluorescente possa ser visto passando pela objetiva.

Usando o micromanipulador, mova a pipeta para uma posição que alinhe a ponta com o ponto fluorescente e abaixe a pipeta para uma posição logo acima da altura da placa de cultura de células. Quando estiver na posição, acenda a luz transmitida e desligue a florescência. Usando uma pinça, transfira uma lamínula com as células voltadas para a pipeta da placa de cultura de células para a placa de cultura de células contendo 2 mililitros de tampão de Hank à temperatura ambiente.

Usando o botão de foco fino e a objetiva de 20 vezes, concentre-se em um plano cerca de quatro voltas completas acima das células. Em seguida, use o micromanipulador para posicionar a ponta da pipeta de forma que fique focada e no lado central esquerdo do plano, conforme visto através das oculares. Quando a pipeta estiver posicionada, focalize o microscópio em um plano que contenha a região de interesse.

Na imagem de sete div, os neurônios do hipocampo de camundongos transfectados com GFP mostraram um axônio pré e pós-sopro, bem como um período de recuperação de 10 minutos seguinte. Aqui está o quimógrafo de imagens de lapso de tempo do mesmo neurônio. As setas vermelhas indicam as varicosidades que se formaram após 150 segundos de sopro de H2O de 190 mililitros, começando aos 30 segundos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como registro de células inteiras, imagens FRET e TIRF de lapso de tempo e imagens de cálcio, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como os impactos do estresse mecânico na sinalização neural e elétrica e de cálcio, tráfego de proteínas e interações. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da lesão cerebral fototraumática explicarem os mecanismos moleculares subjacentes à formação de varicosidades axonais em neurônios vivos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar os experimentos para estudar mecanosensações de neurônios centrais.