Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato

Por assumirem um efeito positivo na cicatrização do tecido, as folhas ASC foram testadas em muitos modelos de doenças, como infarto do miocárdio. Este experimento mostra que as folhas de ASC podem ser usadas intra-abdominalmente e aplicadas no intestino. A principal vantagem das chapas ASC é que não são necessários materiais sintéticos.

Além disso, o transplante de folhas ASC é relativamente fácil de realizar, com apenas uma pequena quantidade de prática. Esta nova aplicação do transplante de folha ASC foi desenvolvida para evitar vazamentos após a ressecção intestinal e oferece um primeiro passo para o qual uma nova estratégia terapêutica. As lâminas de ASC aplicadas à anastomose intestinal têm se mostrado promissoras na prevenção de vazamentos.

As folhas ASC também podem ser aplicadas a outros órgãos intra-abdominais, como o trato urinário. Comece dissecando o tecido adiposo abdominal subcutâneo humano em pedaços de 0,5 cm, com lâmina cirúrgica estéril tamanho 10, pinça de tecido Adson-Brown e tesoura de Metzenbaum. Pesar a quantidade total de tecido dissecado em um frasco de vidro estéril.

Adicionar 30 ml de meio isolante por frasco. E digerir o tecido adiposo dissecado em uma incubadora agitadora a 150 rpm e 37 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, dividir a solução de tecido digerido em tubos de 50 ml e centrifugar os tubos durante 10 minutos a 390 G.

Adicionar meio para ressuspender os sedimentos celulares e adicionar mais meio de cultura, até 45 ml. Centrifugar as células combinadas durante cinco minutos a 390 G e remover o sobrenadante. Ressuspenda o sedimento celular com 10 ml de meio de cultura.

E filtre a suspensão celular através de um filtro de 100 mícrons. Adicione 50 l de solução de azul de metileno de ácido ácido a 3% a 50 l de suspensão celular aos glóbulos vermelhos dos piolhos. Depois de misturar a solução, pipetar 10 l para um hemocitômetro e contar as células.

Plaquear as células com uma densidade de 40000 células por centímetro quadrado, num balão T175 contendo meio de cultura. E incubar as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, lave as células com solução salina tamponada com fosfato quente para remover os detritos celulares.

Em seguida, substitua o meio por meio de cultura 10% FBS, além de ácido ascórbico-2-fosfato recém-adicionado e fator de crescimento de fibroblastos recombinantes humanos dois. Incubar até que as células atinjam 90% de confluência. Subcultive as células-tronco adiposas a 90% de confluência, usando solução padrão de 0,25% de tripsina-EDTA.

Após três a cinco minutos, neutralizar a solução de tripsina-EDTA a 0,25% com 10 ml de meio de cultura. Transferir para um tubo de centrifugação e centrifugar as células durante oito minutos a 250 G. Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura. Após a contagem das células com um hemocitômetro, colocar as células em frascos de cultura T175, a uma densidade de 8000 células por centímetro quadrado.

Congelar os ASCs restantes em nitrogênio líquido, com 10% de dimetilsulfóxido em meio de cultura antes de usar novamente. Pré-revestir placas de cultura termorresponsivas de 3,5 cm de diâmetro, com 1 ml de soro fetal bovino. Em seguida, coloque os pratos em uma incubadora a 37 graus Celsius, por pelo menos 30 minutos antes da semeadura.

Para auxiliar a adesão do ASC à placa termorresponsiva e reduzir o risco de descolamento prematuro da folha de ASC na cultura, a placa termorresponsiva deve ser pré-revestida com soro fetal bovino antes da semeadura celular. Tripsinize ASCs como antes, se houver aglomerados de células após a tripsinização, filtre as células através de um filtro de 100 mícrons antes de contar. Retire os pratos da incubadora e transfira para uma placa de aquecimento a 37 graus Celsius.

Retire o FBS do prato. Após ressuspender o pellet celular em LG DMEM, com 10%FBS, e contar as células, diluir 3,52 vezes 10 elevado ao 6º ASCs em 2 ml de meio de cultura por placa, para semear 400000 células por centímetro quadrado em cada placa de 3,5 cm. Distribua cuidadosamente as células o mais uniformemente possível, balançando suavemente o prato.

Em seguida, cultive folhas de ASC por 48 horas a 37 graus Celsius em uma atmosfera úmida com 5% de CO2. No dia do transplante, deixe as placas de cultura esfriarem até a temperatura ambiente 40 minutos antes do transplante in vivo para facilitar o descolamento da lâmina de ASC. Depois de arrefecido, retirar o meio de cultura e substituí-lo por 1 ml de LG DMEM sem soro.

Para transplantar a folha de células, segure suavemente a borda da folha ASC com uma pinça atraumática e coloque o lado da placa da folha ASC no topo da linha anastomótica. O manuseio cuidadoso da folha e a colocação correta da folha são essenciais para garantir o transplante bem-sucedido da folha intacta. Estique cuidadosamente a folha ASC para aproximadamente 0,25 cm acima e abaixo da linha da anastomose.

Enrole a folha ao redor do cólon, levantando o cólon, para enrolar a folha ASC ao redor do lado dorsal. Os animais controle, que não receberam lâminas de ASC transplantadas, apresentam vazamento fecal próximo à linha anastomótica, indicado pela seta branca no terceiro dia de pós-operatório. Os animais com folhas de ASC transplantadas, indicadas pela seta preta, apresentaram redução do extravasamento fecal e da formação de abscesso no terceiro dia de pós-operatório.

O mesmo resultado foi observado sete dias após a cirurgia. Esta imagem mostra um corte transversal representativo do local da anastomose colorretal em um animal transplantado corado com H e E. A estrutura da lâmina pôde ser identificada no local da anastomose, até sete dias de pós-operatório. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucos minutos se for executada corretamente.

A folha ASC será espontaneamente aderente à superfície celular zero do cólon, não há necessidade de usar cola ou sutura para encaixar a folha ASC. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e transplantar folhas de ASC para anastomose colorretal em ratos, para evitar vazamentos após colectomia parcial.