Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca^{2 +}-imagens e ensaios de degranulação

Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização intracelular em células excitáveis, como quais canais iônicos são críticos para a ativação de células imunes e liberação de mediadores. As principais vantagens dessas técnicas são sua relativa simplicidade e a possibilidade de análise simultânea de um grande número de células. Demonstrando a imagem de cálcio Fura-2 em mastócitos estará Kathrin Ohlenschlager, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, borrife o camundongo eutanasiado com etanol 70% e fixe-o em um bloco de espuma com o lado dorsal voltado para baixo usando alfinetes. Usando uma tesoura de ponta romba, remova a pele sobre o abdômen do camundongo e evite danificar a cavidade peritoneal. Em seguida, injete sete mililitros de meio RPMI gelado na cavidade peritoneal, inserindo uma agulha de calibre 27 cuidadosamente no peritônio.

Não perfure nenhum órgão e use um ponto na região da gordura do epidídimo para reduzir o risco de perfuração de um órgão. Após a injeção, agite o mouse por um minuto para separar as células peritoneais no meio RMPI. Não agite o mouse com muita força para evitar danificar os órgãos internos e contaminar a cavidade peritoneal com o sangue.

Em seguida, reutilize a seringa equipando-a com uma nova cânula de calibre 20. Desloque os órgãos internos para um lado inclinando o bloco de espuma e batendo-o suavemente no banco para facilitar a aspiração média do outro lado. Em seguida, insira uma agulha de calibre 20 para aspirar o fluido do abdômen suave e lentamente para evitar o entupimento dos órgãos internos.

Colete o máximo de líquido possível. Em seguida, remova a agulha da seringa e transfira a suspensão celular coletada em um tubo de coleta no gelo. Descarte um sample tubo se houver contaminação visível do sangue.

Centrifugar o tubo com suspensão de células limpas a 300 g durante cinco minutos. Sob um capuz estéril, aspire o sobrenadante. Ressuspenda os pellets de amostra em meio PMC frio e transfira a suspensão celular para um frasco de cultura de células de 25 centímetros quadrados.

Em seguida, adicionar os fatores de crescimento IL-3 e SCF às concentrações finais de 10 nanogramas por mililitro e 30 nanogramas por mililitro, respectivamente. Incube as células por aproximadamente 48 horas a 37 graus Celsius até o próximo procedimento. Nos dias 12 a 15, se forem planejados experimentos com estimulação de receptores de IgE plasmalemmal, pré-trate as células durante a noite com 300 nanogramas por mililitro de IgE anti-DNP em meio de cultura padrão.

Para preparar a imagem de Fura-2, dilua a solução estoque de Fura-2, AM em HBSS de cálcio até uma concentração final de cinco micromolares para preparar o tampão de carga. Em seguida, misture 500 microlitros do buffer de carregamento com 500 microlitros da suspensão da célula PMC. Pipetar a mistura para a câmara de imagiologia e incubar as células durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.

Configure o sistema de aplicação alimentado por gravidade com diferentes soluções de acordo com o protocolo de estimulação. Em seguida, monte o sistema de aplicação no palco do microscópio invertido. Prepare uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura 40X colocando uma pequena gota de óleo de imersão sobre ela.

Coloque a câmara de imagem com as células carregadas no sistema de aplicação e prenda-a para evitar movimento durante a gravação. Em seguida, acenda a luz transmitida e concentre-se nas células. Posteriormente, inicie o programa de aquisição de imagens no modo de Aquisição Fisiológica.

Abra a janela de configuração e ajuste o foco e o tempo de aquisição ideal. Crie uma imagem de referência e marque as células como ROIs. Marque o último ROI em uma área onde nenhuma célula esteja presente e defina-o como plano de fundo.

Em seguida, conclua a configuração e inicie a medição com uma taxa de aquisição de cinco segundos. Em seguida, adicione soluções no número de ciclo adequado de acordo com o projeto do experimento. Para medir a elevação da concentração de cálcio intracelular induzida pelo antígeno, aplique a solução de seringa dois após o ciclo 20 e interrompa o registro após o ciclo 150.

Para medir a elevação da concentração de cálcio intracelular induzida pelo composto 48/80, aplique a solução de três seringas após o ciclo 20 e pare de registrar após o ciclo 150. Para medir a elevação da concentração de cálcio intracelular evocada pelo SOCE, aplique a solução de seringa quatro após o ciclo 10, aplique a solução de seringa cinco após o ciclo 70, aplique a solução de seringa quatro após o ciclo 120, aplique a solução de seringa após o ciclo 150 e pare de registrar após o ciclo 220. No programa de aquisição, pressione consecutivamente os botões Iniciar cortador, Marcar tudo, Converter tudo, Medições de fisiologia, OK e, em seguida, OK novamente.

Salve os arquivos como tabelas e pilhas de imagens para análise offline. Para medir a liberação de beta-hexosaminidase, transfira 100 microlitros da suspensão celular por poço para uma placa de poço de fundo em V de 96 poços. Adicione 25 microlitros de solução de estimulação ou controle a cada poço.

Em seguida, incube as células por 45 minutos a 37 graus Celsius. Depois, pare a reação colocando a placa de 96 poços no gelo por cinco minutos. Em seguida, centrifugue a placa a quatro graus Celsius por quatro minutos a 120 g.

Transfira 120 microlitros do sobrenadante para uma placa de fundo plano de 96 poços e coloque-a no gelo. Evite cuidadosamente tocar nos grânulos celulares, mas aspire completamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 125 microlitros de tampão de lise aos pellets de células.

Incubar os grânulos celulares durante cinco minutos à temperatura ambiente e ressuspendê-los após a incubação por pipetagem repetida. Pipetar 25 microlitros da solução de pNAG de quatro milimolares nos poços necessários de uma nova placa de fundo plano de 96 poços. Adicione 25 microlitros de cada sobrenadante e 25 microlitros de cada lisado celular separadamente à solução de pNAG preparada.

Incube os lotes de reação por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, pipetar 150 microlitros de solução de parada para cada poço para interromper a reação. Em seguida, analise a absorbância de luz da amostra de placa com um leitor de microplacas a 405 nanômetros com referência de 630 nanômetros para subtração automática de fundo.

No programa de aquisição, marque a caixa Referência, e no menu do elemento do programa de absorbância, selecione 630 nanômetros para subtração automática do fundo. O ensaio de liberação de beta-hexosaminidase foi realizado para testar a capacidade das PMCs isoladas que sofrem degranulação após a reticulação dos receptores plasmalemmal IgE de alta afinidade ou estimulação dos receptores Mrg PRB2. As células foram adicionadas a uma placa de 96 poços com fundo em V e estimuladas de acordo com este esquema por 45 minutos a 37 graus Celsius.

Após centrifugação e remoção do sobrenadante, os pellets foram lisados. O conteúdo de beta-hexosaminidase de sobrenadantes individuais e lisados de pellets foi então analisado por suas reações com pNAG durante uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius. A quantidade dos produtos da reação foi detectada colorimetricamente e a porcentagem da beta-hexosaminidase liberada foi calculada.

A liberação espontânea foi muito baixa, enquanto as respostas a estímulos de degranulação fortes, como ionomicina 10 micromolar e composto 48/80 a 50 microgramas por mililitro, foram superiores a 40% e 60%, respectivamente. As respostas de degranulação à estimulação do DNP foram dependentes da dose na faixa de concentração de 10 a 300 miligramas por mililitro. Juntos, esses dados indicam claramente um bom estado funcional das PMCs isoladas.

Usando esta técnica, você obterá uma população altamente pura de mastócitos de tecido conjuntivo maduro murino derivados do peritônio em duas semanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter condições estéreis durante o isolamento celular e cultura para evitar contaminação bacteriana. Após este procedimento, outros métodos, como medições eletrofisiológicas da corrente iônica patch-clamp, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as vias de entrada do cálcio nos mastócitos.

Após seu desenvolvimento, a técnica de imagem de cálcio intracelular Fura-2 abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia de células de massa explorarem a dependência de cálcio da degranulação de mastócitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de imagem de cálcio Fura-2 e ensaio de degranulação de beta-hexosaminidase com mastócitos. Não se esqueça de que trabalhar com radiação UV pode ser perigoso para os olhos e a pele, e a exposição desnecessária deve ser evitada durante a realização deste procedimento.