Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

O objetivo geral da combinação de interferência de RNA mediada por microRNA artificial com optogenética é caracterizar o efeito do knockdown de genes na função pré-sináptica dentro de circuitos neuronais intactos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia sináptica, como abordar o papel fisiológico das proteínas pré-sinápticas em circuitos cerebrais intactos. A principal vantagem dessa técnica é que ela possibilita monitorar a transmissão sináptica seletivamente em neurônios com expressão reduzida da proteína pré-sináptica sob investigação.

Além disso, usamos esse método para investigar a função pré-sináptica em fatias cerebrais agudas. Também pode ser aplicado para manipular e sondar a segurança neuronal in vivo. Demonstrando o procedimento estará Carmela Vitale, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.

Depois de projetar os microRNAs e construir um vetor recombinante para expressar os microRNAs e a sonda optogenética, prepare culturas neuronais primárias da região cerebral de interesse. Para fazer isso, siga um protocolo de corticocultura estabelecido pela L.A.Cingolani and Company com as seguintes modificações. Primeiro, use placas de seis poços, placa de meio milhão de neurônios por poço e use 2,5 mililitros de meio de fixação por poço.

Depois de incubar a placa por quatro horas, mude para 3,3 mililitros de meio de manutenção por poço e, se for observado crescimento excessivo de astrócitos, adicione 0,5 mililitros de meio de manutenção suplementado com 7,5 micromolares de AraC em três a quatro DIVs. Em cinco a seis DIVs, infecte três poços para cada microRNA testar. Use a dose infecciosa mais baixa que infectará pelo menos 99% dos neurônios.

Adicione o vírus diretamente aos neurônios, misture delicadamente e coloque as placas de volta na incubadora a 37 graus Celsius. Em 17 a 18 DIVs, lise os neurônios para uma extração de RNA. Incline as placas e use pipetas de vidro para remover todo o meio de cada poço.

Em seguida, adicione imediatamente 700 microlitros de reagente de lise a cada poço. Após uma breve mistura, transfira o lisado celular para fora de cada poço e para tubos separados de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 140 microlitros de clorofórmio a cada lisado.

Tampe e agite rapidamente os tubos vigorosamente por 15 segundos para emulsionar o conteúdo. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior contendo RNA para um novo tubo.

Não deixe a ponta da pipeta tocar na fase orgânica. Para a fase aquosa, adicione 1,5 volumes de etanol a 100% e pipete a solução lentamente três vezes para misturar. Em seguida, purifique o RNA usando um kit disponível comercialmente e quantifique os rendimentos.

Espere pelo menos 3,5 microgramas por amostra. As proporções de pureza sobre proteínas e compostos orgânicos devem ser de pelo menos 1,9. Em seguida, use um kit para retrotranscrever 250, 500 ou 1.000 nanogramas de RNA.

Em seguida, quantifique a eficiência de knockdown para o gene endógeno de interesse por RTPCR quantitativo. Apontar para uma eficiência de knockdown de pelo menos 60%Para este protocolo, use um animal que 15 dias antes ou mais teve RAAV12 injetado no cérebro de acordo com um protocolo publicado anteriormente pela A.Cetin and Company. Isole o cérebro e faça fatias cerebrais agudas com um vibratomo e ACFF gelado gaseado.

Colete as fatias da região de interesse e minimize sua exposição à luz para evitar a ativação da sonda optogenética. Deixe as fatias se recuperarem por 30 minutos a 37 graus Celsius no mesmo ACFF. Use uma câmara projetada especificamente para segurar fatias de cérebro.

Em seguida, retorne as fatias à temperatura ambiente, onde permanecerão saudáveis por seis a oito horas. Para prosseguir, transfira uma fatia para a câmara de registro e superfunda-a a dois mililitros por minuto de ACFF. Em seguida, verifique brevemente o sinal do repórter fluorescente expresso para verificar a localização e a intensidade da infecção.

Em seguida, encha um eletrodo de remendo com a solução intracelular. Agora, sob iluminação infravermelha, obtenha uma configuração de atacado de vedação hermética em um neurônio que está recebendo entradas sinápticas dos neurônios infectados. A resistência em série pode ser deixada sem compensação, mas deve ser constante e baixa.

Por exemplo, se os neurônios piramidais CA3 foram infectados, remende os neurônios piramidais no trato proximal ao medial da região CA1. Quando as células começam a parecer encolhidas ou inchadas, quando o patch se torna difícil ou os lotes são instáveis, as fatias selecionadas não estão mais saudáveis o suficiente para gravar. Em seguida, use a farmacologia para isolar as correntes sinápticas sob investigação.

Por exemplo, se o objetivo é investigar a transmissão sináptica excitatória, bloqueie a transmissão sináptica inibitória adicionando bicuculina ao banho. Em seguida, evoque correntes sinápticas, como correntes pós-sinápticas excitatórias, usando um laser azul de 473 nanômetros acoplado a uma fibra óptica posicionada na somata dos neurônios infectados. Não direcione o laser para os axônios dos neurônios.

Por exemplo, evite iluminar as garantias de Shaffer. A despolarização direta dos axônios não é desejável. Em seguida, ajuste a duração da estimulação ao mínimo para reduzir a possibilidade de evocar mais de um potencial de ação por pulso de luz.

Em seguida, refine a intensidade do laser para evocar uma corrente sináptica pequena, mas claramente detectável. Por exemplo, para transmissão sináptica excitatória entre neurônios piramidais CA3 e CA1, ajuste a intensidade do laser para evocar correntes sinápticas de 20 a 50 picoamperes. No final do experimento, aplique tetrodotoxina a 0,5 micromolar para bloquear os canais de sódio.

A sensibilidade das correntes evocadas opticamente à tetrodotoxina indica que elas são acionadas pelo potencial de ação. Continue coletando dados até que pelo menos oito neurônios tenham sido corrigidos para uma determinada condição de pelo menos três animais diferentes. Esses são os dados mínimos necessários para analisar os resultados.

Usando o método descrito, isoformas alternativas de emenda dos canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo P / Q pré-sinápticos foram derrubadas. Acredita-se que esses canais regulem a plasticidade sináptica de curto prazo nas sinapses excitatórias CA3 a CA1. Quatro construções diferentes expressando microRNAs específicos da isoforma foram feitas; cada um foi expresso junto com um canal ultrarrápido de rodopsina junto com a proteína fluorescente Td-Tomato.

Primeiro, cada construção foi confirmada como tendo eficiência e seletividade suficientes em culturas neuronais primárias de ratos usando RTPCR quantitativo específico da isoforma. Em seguida, cada construto foi injetado no hipocampo de ratos P18. Em última análise, o efeito das construções na plasticidade sináptica de curto prazo nas sinapses CA3 a CA1 foi investigado estimulando neurônios piramidais CA3 infectados com pulsos breves de luz de 473 nanômetros e registrando as EPSCs resultantes na configuração de atacado de neurônios piramidais da região CA1.

O knockdown de diferentes isoformas de splice afetou as respostas à estimulação de pulso emparelhada em direções opostas. O knockdown da isoforma A aumentou a facilitação do pulso emparelhado; enquanto o knockdown da isoforma B o aboliu. A combinação de optogenética de interferências de RNA permite que a pesquisa no campo da fisiologia sináptica explore como as proteínas pré-sinápticas regulam a plasticidade sináptica de curto prazo em circuitos intactos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como validar microRNAs para interferência de RNA e como combiná-los com optogenética para investigar a transmissão sináptica em fatias cerebrais agudas.