Name: Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a combinar microRNAs artificiais com optogenética para caracterizar o knockdown de genes na função pré-sináptica em circuitos neurais intactos. Este método permite investigar a transmissão sináptica em fatias cerebrais agudas com precisão.

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Agradecemos a F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) para suporte e Carmela Vitale para ajudar com a demonstração. Este trabalho foi financiado pelo IIT e Compagnia San Paolo (grant n º 9734 para LAC).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Co a expressão de uma sonda de optogenetic e um miR contra um gene pré-sináptica de interesse oferece uma abordagem poderosa para caracterizar o efeito de knockdown do gene na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intactas. Para esta abordagem experimental, é importante identificar e caracterizar miRs que são altamente eficientes e seletivas em derrubar o gene de interesse em sistemas nativos. Se possível, dois ou mais miRs independentes contra o mesmo mRNA de interesse devem ser usado para controle para que os eventuais efeitos fora do alvo. Experiências de resgate, no qual um gene resistente a miR foi reintroduzido no sistema, podem ser usadas como um controle para a especificidade.
Usando a mesma construção para expressar um optogenetic sonda e um miR permite estimulando opticamente apenas os neurônios pré-sináptica que tem sido manipulados. Isto não é possível com estímulos elétricos, porque eles não fazem distinção entre neurônios infectados e não infectados, assim produzindo resultados mistos e diluídos. Porque estímulos ópticos podem induzir vários potenciais de ação15, é importante escolher apenas as sondas mais rápidas de optogenetic, entre uma expansão paleta15,19,20,21. Além disso, é essencial para assegurar que a estimulação óptica não induz uma despolarização direta de boutons pré-sináptica, para evitar algumas das etapas da transmissão sináptica ignorando um deseja investigar22.
A abordagem experimental que descrevemos aqui, torna possível avaliar em paralelo a relevância fisiológica de múltiplos genes pré-sináptica de interesse dentro de um período de tempo limitado (4 – 6 meses). No entanto, é importante ter em mente que knockdowns raramente atingir 100%. Além disso, o rAAVs precisa ser expressa pelo menos duas semanas para permitir a máxima expressão knockdown e cheio da sonda optogenetic, que pode representar uma restrição de tempo, ao investigar os processos de desenvolvimento precoce. Embora mais ratos do knockout condicional, consumindo tempo limitados de neurônios pré-sináptica, geralmente resultam em completar a remoção do gene de interesse e, portanto, oferecer uma abordagem complementar válida.
Uma vantagem específica da tecnologia miR é que ele permite que a expressão de vários miRs o mesmo promotor. Essa propriedade tem sido usada principalmente para aumentar a eficiência "knockdown" inserindo várias cópias da mesma miR ou miRs diferentes contra o mesmo gene alvo. No entanto pode ser usada também para "knockdown" múltiplos genes expressando miRs contra alvo diferentes genes7,23. Esta propriedade pode ser usada para silenciar várias proteínas pré-sináptica para dissecar as vias de sinalização pré-sináptica.
Aqui, nós combinamos optogenetics com miRs artificiais para caracterizar os efeitos do knockdown do gene na função pré-sináptica em fatias hippocampal agudas. Uma abordagem semelhante também pode ser usada para manipular e sondar circuito neuronal na vivo. Além disso, combinando miRs artificiais com chemogenetic abordagens permitiria um circuito neuronal de escalas de tempo mais longos de interrogar.

Este protocolo descreve uma nova abordagem para caracterizar o efeito de knockdown do gene na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intactas. Investigando a função pré-sináptica em circuitos neuronais intactos é um desafio porque muitos boutons pré-sináptica são muito pequenas e longe do soma para permitir intervenções moleculares e eletrofisiológicas combinadas. Apesar de interferência do RNA oferece um meio poderoso e flexível para proteínas sinápticas "knockdown"1, esta abordagem tem sido usada frugalmente para investigar a função pré-sináptica, porque é difícil detectar os efeitos da derrubada usando tradicional estímulos elétricos, que não distinguem entre manipularam e ingênuo boutons pré-sináptica2. Aqui, descrevemos como combinar microRNA artificial (miR)-mediada por RNA interferência com optogenetic recentemente desenvolvido a tecnologia para obter estimulação seletiva de boutons pré-sináptica manipulados em fatias cerebral aguda.
Enquanto camundongos knockout condicional em combinação com a eletrofisiologia também podem ser usados para investigar a função das proteínas pré-sináptica3,4, nossa estratégia não exige o desenvolvimento e manutenção de geneticamente modificado em linhas de rato e também podem ser facilmente empregadas para derrubar isoformas específicas de um gene. Relativo a mais comumente usado gancho de cabelo curto RNAs (shRNAs), miRs artificiais, que empregamos aqui, oferecem importantes vantagens para a nocaute em neurônios. Ao contrário de shRNAs, possam ser expressos sob o controle de uma polimerase II promotor1. Assim, um único promotor pode ser usado para dirigir a expressão da miR e uma sonda de optogenetic, junto com um repórter fluorescente. Desta forma, o tamanho da construção pode ser mantido dentro dos limites de empacotamento de vírus adeno-associado recombinantes (rAAV, figura 1A). Além disso, o uso de uma construção única e um único promotor reduz a variabilidade experimental porque permite a expressão da miR, a sonda de optogenetic e o repórter fluorescente em uma proporção fixa.
Temos recentemente aplicado essa tecnologia para examinar o papel das isoformas alternativamente emendados de canais de cálcio pré-sináptica no hipocampo5. Tal estratégia é geralmente aplicável para estudar a relevância fisiológica de outras proteínas pré-sinapticamente expressas em qualquer circuito de cérebro de interesse.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma</td><td>Acrilamida / Bis-acrilamida, solução a 30%</td><td>Controlador</td>de</tr><tr><td>temperatura animal tóxico com almofada térmica</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensaio de proteína BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Fatias de cérebro Pré-câmara</td><td>Câmera</td> baseada em câmera <td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD da</td> Harvard Apparatus <td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; Reagentes da</td> cultura de células do MP <td></td></tr><tr><td></td><td>tecnologias da vida</td> Tecnologias quimioluminescentes <td></td><td></td></tr><tr><td>GE</td><td>Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Citosina tóxica &beta;-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de gentamicina</td><td>Farmácia</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de injeção</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Sais e detergentes inorgânicos</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- fosfato de creatina</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Laser Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0.2 &micro; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante ocular</td><td>Farmácia local</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de fosfato</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, Inibidores de protease sem EDTA Coquetel</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos de eletroforese e blotting de gel de proteína</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III</td> Iodoprovidona Farmácia <td></td></tr><tr><td></td><td>local</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol Lysis Reagent</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Tóxico QuantiTect Reverse Kit de Transcrição</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho estereotáxico</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

combinação de optogenetics com micrornas artificial para caracterizar os efeitos do gene knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

O propósito do presente protocolo é caracterizar o efeito de knockdown do gene na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intactas. Descrevemos um fluxo de trabalho sobre como combinar microRNA artificial (miR)-mediada por RNA interferência com optogenetics para conseguir a estimulação seletiva de boutons pré-sináptica manipulados em fatias cerebral aguda. A abordagem experimental envolve o uso de um único construto viral e um único promotor de neurônio-específico para dirigir a expressão de uma sonda de optogenetic e o miR(s) artificial contra genes pré-sináptica. Quando Estereotaxia injetado na região do cérebro de interesse, a construção expressa torna possível estimular com luz exclusivamente os neurônios com expressão reduzida dos genes sob investigação. Esta estratégia não exige o desenvolvimento e manutenção de linhas de rato geneticamente modificado e pode em princípio ser aplicada a outros organismos e a qualquer gene neuronal de escolha. Temos recentemente aplicado para investigar como o nocaute de isoformas de splice alternativas de canais de cálcio dependentes de voltagem P/Q-tipo pré-sináptica (VGCCs) regula a curto prazo plasticidade sináptica no CA3 para CA1 sinapses excitatórias em fatias hippocampal agudas. Uma abordagem semelhante também pode ser usada para manipular e sonda o circuito neuronal em vivo.

Os procedimentos descritos acima fornecem um método robusto para avaliar a transmissão sináptica como é afetado pelo nocaute de proteínas sinápticas nos neurônios pré-sináptica. Resultados representativos sobre como o nocaute de alternativa splice isoformas de pré-sináptica Cav2.1 (tipo P/Q) VGCCs regula a curto prazo plasticidade sináptica no CA3 para CA1 sinapses excitatórias são dadas abaixo como exemplo.
CAv2.1 (tipo P/Q) canais são os VGCCs pré-sináptica predominantes em sinapses mais rápidas no sistema nervoso central. Alternativas de splicing os exões mutuamente exclusivas 37a e 37b de formadoras de poros α1 subunidade de Cav2.1 (α1A) produz duas variantes principais, Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Para determinar se Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb] diferencialmente regulam a transmissão sináptica e plasticidade em neurônios piramidais hippocampal do rato, primeiro desenvolvemos miRs isoforma específica para nocaute seletivamente Cav 2.1 [EFa] ou Cav2.1 [EFb]5. Apesar do pequeno tamanho (97 bp) e alta similaridade (61.86% identidade no nível do nucleotide) entre exões 37a e 37b, nós poderíamos projetar três sequências de miR contra rato Cav2.1 [EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) e dois contra rato Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) com previsto alta eficiência knockdown. Como controlo negativo (miR controle), usamos o plasmídeo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg contendo uma sequência que não tem como alvo qualquer gene conhecido de vertebrados. Com base em uma primeira tela em células HEK 293 contra heterólogos canais, selecionamos miR EFa1, miR EFa3 e miR EFb2 e clonou suas fitas de expressão para o 3' UTR do vetor pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, que é projetado para a produção de rAAVs e onde o synapsin promotor conduz a expressão da channelrhodopsin ultra rápida ChETA, a proteína fluorescente vermelha TdTomato e a miR inserida (Figura 1). Também Duplicamos a gaveta de expressão de miR EFb2 para aumentar a eficiência "knockdown" deste miR.
Em seguida, preparados rAAV1/2 para as construções de quatro acima e quantificada sua eficiência knockdown e seletividade em culturas neuronal de rato primário usando isoforma específica qRT-PCR. miR EFa1 e miR EFa3 reduzida mRNA do nativo Cav2.1 [EFa] ~ 70%, mas não o da Cav2.1 [EFb], enquanto miR EFb reduzido mRNA do nativo Cav2.1 [EFb] ~ 60%, mas não o da Cav2.1 [EFa] (Figura 2).
Nós Estereotaxia injetou cada um dos quatro rAAV1/2 na área CA3 do hipocampo de ratos P18 (Figura 3A-C), com coordenadas de −2.6 (A-P/M-L/D-V de Bregma) / ± 2,9 / −2.9. Pós-injeção de quinze para vinte e quatro dias, estamos preparados fatias hippocampal agudas de ratos rAAV1/2-injetado e usado TdTomato fluorescência para confirmar a expressão e a localização de rAAVs (Figura 3B). Para investigar se pré-sináptica nocaute de Cav2.1 [EFa] ou Cav2.1 [EFb] afetadas a curto prazo plasticidade sináptica no CA3 para CA1 sinapses, nós estimulada seletivamente infectados CA3 neurônios com breve 473 nm laser pulsos de luz (2 ms-long ; A Figura 3) e gravou os EPSCs resultantes emendando neurônios piramidais no proximal ao trato medial da região CA1 (Figura 3). Nós achamos que o knockdown de Cav2.1 da tala isoformas afetou as respostas à estimulação emparelhado-pulso em direções opostas: nocaute de Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 ou miR EFa3) impulsionou emparelhado-pulso facilitação (PPF) Considerando que o knockdown de Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) aboliu (Figura 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figura 1: Esquema das construções para expressão combinada da sonda optogenetic ultra rápida ChETA e miRs isoforma específica contra Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb]. (A) mapa de rAAV a construir pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, contendo um promotor synapsin (Syn), a channelrhodopsin ultra rápida ChETA fundido para TdTomato e, no proximal 3' UTR, miR de isoforma específica um Cav2.1 da tala. Enzimas de restrição mostradas são cortadores único. (B) superior, regime de gaveta a expressão. O promotor synapsin drives expressão de ChETA-TdTomato e de uma isoforma específica miR. No fundo, complemento reverso das sequências alvo 21-nucleotide, que formam parte da fita miR. Para miR EFb2 duas fitas idênticas miR foram expressos em tandem, um após o outro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Figura 2. Avaliação da eficiência knockdown e seletividade de miRs isoforma específica para Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb]. Análise de isoforma específica qRT-PCR RNA isolado de culturas primárias de DIV de 17-18 infectadas ao DIV 6 com rAAVs expressando miRs direcionamento de qualquer Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 e miR EFa3) ou Cav2.1 [EFb] (miR. EFb2). Dados são normalizados para o controle negativo (miR controle). miR EFa1 e miR EFa3 significativamente e seletivamente reduzem mRNA do Cav2.1 [EFa] (n = 8 e 7 culturas, respectivamente), enquanto miR EFb significativamente e seletivamente reduz o mRNA do Cav2.1 [EFb] (n = 4 culturas; * * * p &lt; 0,001; unidirecional análise de teste de variância seguido do pós-teste de Tukey-Kramer). Os dados são apresentados como média ± SEM. Esta figura foi adaptada da Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Figura 3. Avaliar o papel da Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb] no hipocampo nativo por direcionados a estimulação dos neurônios batido para baixo com optogenetics. (A) esquema da fita expressão das construções rAAV usado para infecção na vivo . (B) seção Hippocampal mostrando essa fluorescência TdTomato é limitada à região CA3 e suas projeções. (C) configuração Experimental: feixe de laser foi dirigido para somata CA3, e gravações de braçadeira do remendo foram realizadas entre os neurônios piramidais do CA1. (D) 2 ms-long azul (473 nm) pulsos de laser luz brilhados a 20 Hz evocam EPSCs cujo PPF é aumentado pela miRs direcionamento Cav2.1 [EFa] e abolida pelo miR para Cav2.1 [EFb]. (E) Resumo do rácio emparelhado-pulso para experiências como em (D), mostrando um aumento em PPF para miR EFa1 e miR EFa3 e uma diminuição para miR EFb2, relativo à miR controle (n = 9-11 gravações; * p = 0,02; * * p = 0,01; * * * p &lt; 0,0004; análise de covariância). Os dados são apresentados como média ± SEM. Esta figura foi adaptada da Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho sobre como combinar artificial microRNA mediada por RNA interferência com optogenetics para estimular especificamente pré-sináptica boutons com reduzida expressão de genes seletiva dentro de circuitos neuronais intactos.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

O objetivo geral da combinação de interferência de RNA mediada por microRNA artificial com optogenética é caracterizar o efeito do knockdown de genes na função pré-sináptica dentro de circuitos neuronais intactos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia sináptica, como abordar o papel fisiológico das proteínas pré-sinápticas em circuitos cerebrais intactos. A principal vantagem dessa técnica é que ela possibilita monitorar a transmissão sináptica seletivamente em neurônios com expressão reduzida da proteína pré-sináptica sob investigação.Além disso, usamos esse método para investigar a função pré-sináptica em fatias cerebrais agudas. Também pode ser aplicado para manipular e sondar a segurança neuronal in vivo. Demonstrando o procedimento estará Carmela Vitale, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.Depois de projetar os microRNAs e construir um vetor recombinante para expressar os microRNAs e a sonda optogenética, prepare culturas neuronais primárias da região cerebral de interesse. Para fazer isso, siga um protocolo de corticocultura estabelecido pela L.A.Cingolani and Company com as seguintes modificações. Primeiro, use placas de seis poços, placa de meio milhão de neurônios por poço e use 2,5 mililitros de meio de fixação por poço.Depois de incubar a placa por quatro horas, mude para 3,3 mililitros de meio de manutenção por poço e, se for observado crescimento excessivo de astrócitos, adicione 0,5 mililitros de meio de manutenção suplementado com 7,5 micromolares de AraC em três a quatro DIVs. Em cinco a seis DIVs, infecte três poços para cada microRNA testar. Use a dose infecciosa mais baixa que infectará pelo menos 99% dos neurônios.Adicione o vírus diretamente aos neurônios, misture delicadamente e coloque as placas de volta na incubadora a 37 graus Celsius. Em 17 a 18 DIVs, lise os neurônios para uma extração de RNA. Incline as placas e use pipetas de vidro para remover todo o meio de cada poço.Em seguida, adicione imediatamente 700 microlitros de reagente de lise a cada poço. Após uma breve mistura, transfira o lisado celular para fora de cada poço e para tubos separados de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 140 microlitros de clorofórmio a cada lisado.Tampe e agite rapidamente os tubos vigorosamente por 15 segundos para emulsionar o conteúdo. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior contendo RNA para um novo tubo.Não deixe a ponta da pipeta tocar na fase orgânica. Para a fase aquosa, adicione 1,5 volumes de etanol a 100% e pipete a solução lentamente três vezes para misturar. Em seguida, purifique o RNA usando um kit disponível comercialmente e quantifique os rendimentos.Espere pelo menos 3,5 microgramas por amostra. As proporções de pureza sobre proteínas e compostos orgânicos devem ser de pelo menos 1,9. Em seguida, use um kit para retrotranscrever 250, 500 ou 1.000 nanogramas de RNA.Em seguida, quantifique a eficiência de knockdown para o gene endógeno de interesse por RTPCR quantitativo. Apontar para uma eficiência de knockdown de pelo menos 60%Para este protocolo, use um animal que 15 dias antes ou mais teve RAAV12 injetado no cérebro de acordo com um protocolo publicado anteriormente pela A.Cetin and Company. Isole o cérebro e faça fatias cerebrais agudas com um vibratomo e ACFF gelado gaseado.Colete as fatias da região de interesse e minimize sua exposição à luz para evitar a ativação da sonda optogenética. Deixe as fatias se recuperarem por 30 minutos a 37 graus Celsius no mesmo ACFF. Use uma câmara projetada especificamente para segurar fatias de cérebro.Em seguida, retorne as fatias à temperatura ambiente, onde permanecerão saudáveis por seis a oito horas. Para prosseguir, transfira uma fatia para a câmara de registro e superfunda-a a dois mililitros por minuto de ACFF. Em seguida, verifique brevemente o sinal do repórter fluorescente expresso para verificar a localização e a intensidade da infecção.Em seguida, encha um eletrodo de remendo com a solução intracelular. Agora, sob iluminação infravermelha, obtenha uma configuração de atacado de vedação hermética em um neurônio que está recebendo entradas sinápticas dos neurônios infectados. A resistência em série pode ser deixada sem compensação, mas deve ser constante e baixa.Por exemplo, se os neurônios piramidais CA3 foram infectados, remende os neurônios piramidais no trato proximal ao medial da região CA1. Quando as células começam a parecer encolhidas ou inchadas, quando o patch se torna difícil ou os lotes são instáveis, as fatias selecionadas não estão mais saudáveis o suficiente para gravar. Em seguida, use a farmacologia para isolar as correntes sinápticas sob investigação.Por exemplo, se o objetivo é investigar a transmissão sináptica excitatória, bloqueie a transmissão sináptica inibitória adicionando bicuculina ao banho. Em seguida, evoque correntes sinápticas, como correntes pós-sinápticas excitatórias, usando um laser azul de 473 nanômetros acoplado a uma fibra óptica posicionada na somata dos neurônios infectados. Não direcione o laser para os axônios dos neurônios.Por exemplo, evite iluminar as garantias de Shaffer. A despolarização direta dos axônios não é desejável. Em seguida, ajuste a duração da estimulação ao mínimo para reduzir a possibilidade de evocar mais de um potencial de ação por pulso de luz.Em seguida, refine a intensidade do laser para evocar uma corrente sináptica pequena, mas claramente detectável. Por exemplo, para transmissão sináptica excitatória entre neurônios piramidais CA3 e CA1, ajuste a intensidade do laser para evocar correntes sinápticas de 20 a 50 picoamperes. No final do experimento, aplique tetrodotoxina a 0,5 micromolar para bloquear os canais de sódio.A sensibilidade das correntes evocadas opticamente à tetrodotoxina indica que elas são acionadas pelo potencial de ação. Continue coletando dados até que pelo menos oito neurônios tenham sido corrigidos para uma determinada condição de pelo menos três animais diferentes. Esses são os dados mínimos necessários para analisar os resultados.Usando o método descrito, isoformas alternativas de emenda dos canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo P / Q pré-sinápticos foram derrubadas. Acredita-se que esses canais regulem a plasticidade sináptica de curto prazo nas sinapses excitatórias CA3 a CA1. Quatro construções diferentes expressando microRNAs específicos da isoforma foram feitas; cada um foi expresso junto com um canal ultrarrápido de rodopsina junto com a proteína fluorescente Td-Tomato.Primeiro, cada construção foi confirmada como tendo eficiência e seletividade suficientes em culturas neuronais primárias de ratos usando RTPCR quantitativo específico da isoforma. Em seguida, cada construto foi injetado no hipocampo de ratos P18. Em última análise, o efeito das construções na plasticidade sináptica de curto prazo nas sinapses CA3 a CA1 foi investigado estimulando neurônios piramidais CA3 infectados com pulsos breves de luz de 473 nanômetros e registrando as EPSCs resultantes na configuração de atacado de neurônios piramidais da região CA1.O knockdown de diferentes isoformas de splice afetou as respostas à estimulação de pulso emparelhada em direções opostas. O knockdown da isoforma A aumentou a facilitação do pulso emparelhado; enquanto o knockdown da isoforma B o aboliu. A combinação de optogenética de interferências de RNA permite que a pesquisa no campo da fisiologia sináptica explore como as proteínas pré-sinápticas regulam a plasticidade sináptica de curto prazo em circuitos intactos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como validar microRNAs para interferência de RNA e como combiná-los com optogenética para investigar a transmissão sináptica em fatias cerebrais agudas.

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Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a inibição mediada por microRNA de correntes sinápticas excitatórias em fatias de cérebro de hipocampo de camundongos. Os neurônios CA3 foram infectados com um vetor viral recombinante que abriga uma construção para expressar um repórter fluorescente, um canal de membrana ativado por luz e um microRNA que regula negativamente a expressão de canais de cálcio dependentes de voltagem. Ao colocar uma fatia em uma câmara de gravação e remendar um neurônio CA1 com uma pipeta de...

Inibição de correntes pós-sinápticas excitatórias mediada por microRNA em fatias de hipocampo de camundongo

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar...

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

A optogenética tornou-se uma ferramenta poderosa para uso em experimentos de neurociência comportamental. Este protocolo oferece um guia passo a passo para o projeto e configuração de sistemas de laser e fornece um protocolo completo para a realização de estímulos optogenéticos in vivo múltiplos e simultâneos compatíveis com a maioria dos paradigmas de teste comportamental de roedores.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

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Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Aprenda a combinar microRNAs artificiais com optogenética para caracterizar o knockdown de genes na função pré-sináptica em circuitos neurais intactos. Este método permite investigar a transmissão sináptica em fatias cerebrais agudas com precisão.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta (Vídeo) | JoVE Journal

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

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