Canal de Microfluidic reconfiguráveis com Sidewalls Pin-diferenciado

O objetivo geral deste procedimento é fabricar um dispositivo microfluídico reconfigurável com paredes laterais feitas de uma matriz de pinos. A principal vantagem deste dispositivo microfluídico é sua capacidade de lidar com objetos e situações difíceis de fluir que podem ser desconhecidos no estágio de projeto do canal. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldade em gravar pequenos pinos em formas de ossos de cachorro.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a montagem de muitas peças microfluídicas e a montagem delas na base são difíceis de aprender apenas com o protocolo escrito. Esta foto é do dispositivo microfluídico completo com um canal reconfigurável. Aqui, a parte reconfigurável está na parte superior da imagem.

Um esquema de visão explodida revela alguns de seus principais componentes. Em particular, observe o microcanal e os pinos usados para reconfigurá-lo. Como primeiro passo, grave os pinos.

Comece com pinos de aço inoxidável desengordurados, com 0,3 milímetros de espessura, em forma de L, de diferentes comprimentos. Prepare quatro mililitros de ácido nítrico a 10% e mergulhe os pinos nele. Em seguida, coloque o recipiente em um forno a 65 graus Celsius por 30 minutos.

Depois de recuperar os pinos, transfira-os com uma pinça um a um para um recipiente com água deionizada. Em seguida, sonicá-los na água por cinco minutos. Quando terminar, seque-os com uma toalha de papel.

Tenha pronto 0,5 mililitros de agente desmoldante e mergulhe os pinos nele. Após duas horas, coloque os pinos em água deionizada e sonice-os por cinco minutos. Continuar requer um prato de gravação.

O prato de gravação é construído em vidro e adesivo de silicone. Comece o processo de gravação dispensando adesivo de silicone para as extremidades dos pinos no prato. Coloque os pinos de forma que as pontas em suas extremidades retas fiquem imersas no adesivo.

Este é o prato depois que todos os pinos estão no lugar e prontos para a próxima etapa. Transfira o prato de gravação para um fermentador umidificado aquecido a 38 graus Celsius e espere durante a noite para curar o adesivo. Quando estiver pronto, coloque a placa de gravação com pinos em uma placa de aquecimento de 65 graus Celsius.

Despeje 0,8 mililitros de ácido de condicionamento sobre a região descoberta dos pinos. Após 10 minutos, transferir o ácido para um copo utilizando um micropipetador. Em seguida, adicione mais ácido de condicionamento ao prato para repetir a etapa de condicionamento

Após a gravação, verifique se a largura da região gravada é de cerca de 0,2 milímetros. Em caso afirmativo, micropipete cinco mililitros de solução de bicarbonato de sódio na placa de condicionamento para neutralizar o ácido restante. Em seguida, use uma pinça para remover os pinos puxando longitudinalmente.

Comece com um molde fabricado. Como neste esquema, o molde é para um dispositivo com uma parede lateral fixa e espaço para pinos. Crie o molde em uma lâmina de vidro usando litografia.

Coloque a lâmina preparada no fundo de um prato de plástico. Agora, despeje o pré-polímero de PDMS no molde com uma espessura de três milímetros. Coloque o prato em um dessecador a vácuo por 10 minutos.

Depois disso, leve ao forno a 65 graus Celsius por uma hora. O resultado é uma laje parcialmente curada. Use um bisturi para desmoldar a laje para as próximas etapas.

Coloque a placa em um forno a 120 graus Celsius por uma hora para curá-la completamente. Agora, trabalhe com a laje totalmente curada. Ele terá bordas irregulares ao longo do padrão de linha-guia.

Use um bisturi para aparar com precisão e limpeza as bordas irregulares. Preste atenção especial à superfície dos slots de inserção do pino para criar o melhor dispositivo. Perfure os orifícios para entrada/saída da câmara principal e em outros lugares usando punções de biópsia.

Agora, fabrique um conjunto de microcanais. Aqueça uma solução de limpeza a 60 graus Celsius e obtenha uma lamínula número quatro. A lamínula mede 10 milímetros por 20 milímetros.

Mergulhe a lamínula na solução por 10 minutos. Colocou a lamínula enxaguada e seca e a placa PDMS no eletrodo inferior de um revestidor por pulverização catódica. Gere plasma de vácuo de ar por 30 segundos.

Cole o item recuperado para que as bordas se alinhem e os recursos do canal fiquem visíveis através da lamínula. Use um recipiente estéril para levar as camadas coladas a um capuz laminar para esterilizá-las. Quando terminar, insira os pinos no slot.

Os pinos adjacentes devem ter comprimentos diferentes. Os pinos formam a outra parede lateral da microcâmara. Continue a trabalhar na coifa laminar.

Para as próximas etapas, tenha uma base pronta para o dispositivo. Prepare o preenchedor de lacunas homogeneizando uma mistura de vaselina branca e pó de politetrafluoretileno. Despeje a mistura homogeneizada em uma seringa dispensadora e insira um êmbolo.

Empurre o êmbolo para encher a ponta da seringa. Em seguida, coloque uma agulha e empurre o êmbolo até que a agulha esteja cheia. Prepare uma segunda seringa com adesivo de silicone de maneira semelhante e conecte cada uma a um dispensador pneumático.

Agora, dispense adesivo de silicone na base. Coloque-o ao longo de um dos bolsos. Em seguida, coloque uma lamínula número quatro no bolso e pressione-a com firmeza para colá-la.

Em seguida, dispense o adesivo de silicone ao longo das duas ranhuras externas da base, desenhando segmentos com cerca de um milímetro de profundidade. Ao longo de outra ranhura no meio, dispense o preenchimento de lacunas em um segmento de um milímetro de profundidade. Coloque mais adesivo na borda do outro bolso.

Coloque um conjunto de microcanal no bolso e pressione-o com firmeza. Mais uma vez, coloque o preenchedor de lacunas na ranhura ao longo do meio da base. Em seguida, coloque adesivo nas ranhuras adjacentes.

Deixe o dispositivo repousar por um dia no capô estéril. Após a cura, na coifa laminar, mova cada pino até um milímetro ao longo de seus pinos adjacentes para liberá-los da barreira elastomérica. Configure um teste de fluorescência para vazamento diluindo o corante fluorescente verde em água ionizada.

Em seguida, abra o microcanal para ter uma largura consistente por toda parte. Use uma micropipeta para transferir o corante para uma porta final do microcanal e encha-o com a solução. Em um prato grande de plástico, coloque dois pedaços de papel absorvente úmidos com água deionizada e o dispositivo dentro.

Incube o prato em 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas a 37 graus Celsius. Visualize o dispositivo recuperado com um microscópio fluorescente invertido e registre imagens. Use-os para confirmar que não há vazamento ao redor dos pinos.

Essas imagens são de uma amostra com vazamento e sem vazamento. Outro teste envolve a semeadura de células. Abra o microcanal para fazer um canal reto de 400 mícrons de largura com a parede lateral o mais plana possível.

Adicione a suspensão de célula a uma porta final para preencher o canal. Localize os pinos que definem a parede lateral da região para iniciar a cultura de células e feche-os para envolver as células na região. Começando perto da região, feche todos os pinos para expelir as células do canal.

Depois de aspirar a suspensão das portas finais, adicione meio. Coloque o dispositivo em um recipiente de plástico com papel absorvente úmido. Incube-o por no mínimo 24 horas.

Procure que as células tenham cerca de 10 células por na área fechada. Em seguida, retraia lentamente um alfinete para ampliar a área de cultura. Essas imagens são de células COS-7 cultivadas em um microcanal reconfigurável.

Ao longo de nove dias, a área de cultivo de microcanais foi ampliada. Os dados coletados permitem um gráfico da contagem de células e da densidade em função do tempo. Os pontos azuis e o ajuste da curva são para a contagem de células.

Os símbolos e ajustes vermelhos são para a densidade. Para a densidade, as setas verticais indicam expansão da área de cultura celular em dois, cinco e seis dias. As densidades são calculadas para as mesmas áreas de cultivo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir uma parede lateral sem vazamentos de um canal microfluídico a partir de pequenos pinos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante fazer cada uma das etapas do protocolo com cuidado e minuciosamente.

Não se esqueça de que trabalhar com ácido forte pode ser extremamente perigoso, e precauções como a preparação de uma quantidade adequada de agente neutralizante devem sempre ser tomadas. Seguindo esses procedimentos, outras células com fluido podem ser introduzidas para estabelecer culturas celulares mais complexas.