Um modelo de coelho da expressão do Transgene durável na veia Jugular para enxertos de interposição da artéria carótida comum

Este método pode responder a perguntas-chave sobre a patogênese da falha do enxerto venoso. Por exemplo, poderia identificar mediadores da falha do enxerto e testar estratégias destinadas a prevenir a falha do enxerto. A principal vantagem desta técnica é sua capacidade de alcançar uma expressão transgênica durável e estável no endotélio do enxerto venoso.

Depois de anestesiar um coelho de acordo com o protocolo de texto, raspe o animal da fúrcula esternal até a borda da mandíbula. Após a conclusão do arranjo cirúrgico, use eletrocautério para cortar a pele ao longo da linha média entre a incisura esternal e a mandíbula, com aproximadamente sete a nove centímetros de comprimento. Em seguida, prenda grampos de toalha para manter aberta a incisão.

Dissecar sem corte sob a fáscia ao longo de toda a linha média. Em seguida, use eletrocautério para cortar a camada fascial dissecada ao longo da linha média. Em seguida, começando pelo lado direito, dissecar entre o músculo hióide esternal que recobre a traqueia e o músculo esternoefálico para expor a artéria carótida comum.

Em seguida, disseque cuidadosamente um segmento de quatro a cinco centímetros da artéria carótida comum e seus ramos maiores livres dos tecidos circundantes. Use suturas de seda 5-0 para ligar os ramos maiores da artéria carótida comum antes de cortar cada ramo distal à sutura. Depois de repetir a dissecção na carótida comum esquerda, use uma pinça de retenção de tecido para fechar temporariamente a camada de tecido subcutâneo.

Em seguida, disseque a fáscia superficial da pele do lado direito até que a veia jugular externa seja exposta. Disseque um segmento de quatro a cinco centímetros da veia jugular externa e libere seus ramos do tecido circundante. Use suturas de seda 5-0 para ligar os galhos e, em seguida, corte os galhos.

Em seguida, ligue a veia isolada em ambas as extremidades, corte a extremidade cranial e lave o lúmen com solução salina heparinizada. Para realizar o enxerto de veia, use um clipe vascular para pinçar a artéria carótida comum direita na extremidade cranial do segmento isolado. Em seguida, coloque um clipe vascular na extremidade caudal.

Agora execute uma arteriotomia caudal apenas cranial ao grampo caudal igual em comprimento ao diâmetro da extremidade cranial do segmento da veia. Em seguida, insira um cateter intravenoso conectado a uma seringa de solução salina normal heparinizada através da arteriotomia caudal e lave o lúmen da artéria carótida. O fluido sairá pela arteriotomia.

Voltando à veia jugular, excise a veia e coloque-a ao lado da artéria carótica. Usando pontos únicos de polipropileno 7-0, suture a extremidade caudal da arteriotomia caudal até a extremidade cranial do segmento da veia. Em seguida, coloque um segundo ponto 180 graus a partir do primeiro ponto para suturar a borda cranial da arteriotomia caudal até a extremidade cranial do segmento da veia.

Coloque um terceiro ponto em um ponto equidistante dos dois primeiros pontos na lateral da anastomose. Em seguida, coloque um quarto ponto no lado medial da anastomose equidistante dos dois primeiros pontos e em frente ao terceiro ponto. Coloque quatro pontos adicionais entre cada um dos pontos de um a quatro.

Realize a arteriotomia craniana no lado caudal do clipe distal. A distância entre a extremidade cranial da arteriotomia cranial e a extremidade caudal da arteriotomia caudal deve ser igual ao comprimento do segmento da veia. O comprimento da arteriotomia craniana é igual ao diâmetro da extremidade caudal do segmento da veia.

Com a veia estendida cranialmente a partir da anastomose ao longo da carótida, certifique-se de que a veia não esteja torcida. Em seguida, use solução salina normal heparinizada para lavar a artéria e a veia carótidas através da arteriotomia craniana. Em seguida, coloque um primeiro ponto para suturar a extremidade caudal da arteriotomia craniana até a extremidade caudal do segmento da veia.

Em seguida, coloque um segundo ponto 180 graus a partir do primeiro ponto para suturar a borda cranial da arteriotomia craniana até a extremidade caudal do segmento da veia. Complete a anastomose conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Solte temporariamente o clipe craniano para permitir que o enxerto de veia se encha de sangue e aplique uma leve pressão com gaze seca para parar qualquer sangramento.

Repita esta etapa até que a anastomose não sangre mais. Em seguida, remova os clipes cranial e caudal. Use gaze para parar qualquer sangramento adicional nas anastomoses.

Use uma sutura de seda 3-0 para ligar ambas as extremidades do segmento da artéria carótida comum entre as anastomoses. Em seguida, divida a carótida até a metade entre as ligaduras. Pulsações rápidas devem ser observadas no enxerto venoso.

Repita a colocação do enxerto de veia no lado esquerdo. Com uma sutura PGA 5-0, feche o tecido subcutâneo com um padrão contínuo. Em seguida, use uma sutura PGA 3-0 para fechar a pele com um padrão intradérmico e enterrar os nós em ambas as extremidades.

Realizar cuidados pós-operatórios e ultrassom transcutâneo de acordo com o protocolo de texto. Para realizar a cirurgia de transferência de genes, isole cuidadosamente o enxerto da veia direita, incluindo 1,5 a dois centímetros da artéria carótida adjacente ao enxerto nos lados cranial e caudal. Repita a dissecção do lado esquerdo da mesma maneira.

Use solução salina normal para preencher a cavidade da ferida cirúrgica no lado direito para permitir a transmissão de ondas sonoras. Conecte uma sonda de fluxo perivascular de dois milímetros a um medidor de fluxo de volume e mergulhe a sonda na solução salina na cavidade da ferida. Defina a taxa de fluxo para zero.

Coloque a sonda de fluxo ao redor da artéria carótida caudal ou cranial ao enxerto da veia. Em seguida, use um sistema eletrônico de aquisição de dados para registrar dados da sonda de fluxo. Depois de injetar heparina no coelho através do cateter IV e lavá-lo com solução salina, use um clipe vascular para prender a artéria carótida comum na extremidade cranial do enxerto de veia.

Em seguida, aplique um segundo clipe na carótida aproximadamente 10 milímetros caudal à anastomose caudal para deixar espaço para a arteriotomia. Em seguida, coloque dois laços de seda frouxamente ao redor da artéria carótida, caudal ao enxerto da veia. Em seguida, usando uma agulha dobrada de calibre 21 previamente preparada, perfure a carótida caudal ao enxerto e apenas cranial ao clipe vascular caudal.

Avance a agulha no lúmen para frente e para trás duas vezes para garantir que o lúmen esteja claro. Em seguida, retire cuidadosamente a agulha. Depois de preparar uma seringa e um cateter IV com DMEM de acordo com o protocolo de texto, insira-o na arteriotomia carotídea comum até o ponto de curvatura e lave o lúmen do enxerto venoso preenchendo-o com 0,5 mililitros de DMEM duas vezes.

Remova o DMEM do enxerto usando um dedo enluvado para pressionar levemente a extremidade cranial do enxerto. Em seguida, deslize cuidadosamente o dedo ao longo do enxerto em direção à extremidade caudal do enxerto para liberar o conteúdo luminal através da arteriotomia. Remova a seringa DMEM do cateter deixando o cateter no recipiente.

Conecte a seringa que contém a solução do vírus, certificando-se de que nenhum ar entre no cateter. Mova os laços de seda frouxamente atados pela artéria até que estejam ao redor da ponta do cateter, mas não os aperte. Infundir 0,03 mililitros de solução de vírus para empurrar o DMEM restante para fora do cateter.

Em seguida, usando um dedo, remova todo o fluido do lúmen do enxerto de veia pressionando suavemente do crânio para o caudal. Aperte os dois laços ao redor da artéria e da ponta do cateter para selar o lúmen. Em seguida, infundir a solução do vírus até que a veia esteja distendida.

Coloque suavemente a seringa em um ninho de gaze. Após 20 minutos, use uma seringa vazia para aspirar suavemente a solução contendo o vírus do enxerto até que o vaso entre em colapso. Remova a seringa deixando o cateter no lugar.

Em seguida, corte e desamarre as suturas de seda e retire o cateter do vaso. Agora use sutura de polipropileno 7-0 em um padrão X para fechar a arteriotomia. Em seguida, puxe suavemente as extremidades da sutura e amarre-as com dois nós quadrados.

Depois de restaurar o fluxo sanguíneo no enxerto da veia direita, conforme descrito no protocolo de texto, repita a infusão do vírus no lado esquerdo. Para colher os enxertos transduzidos, dissecar os enxertos de veia e as artérias carótidas comuns e fazer medições de fluxo nos lados esquerdo e direito, conforme demonstrado anteriormente. Use sutura de seda 3-0 para ligar a artéria carótida comum direita cranial ao enxerto.

Em seguida, use sutura de seda 3-0 para ligar a carótida caudal ao enxerto. Extirpar o enxerto da veia direita dividindo a artéria carótida adjacente entre cada uma das ligaduras e a anastomose adjacente. Em seguida, remova o enxerto de veia do coelho e use solução salina para lavar o lúmen.

O primeiro marco que um novo operador deve alcançar é a permeabilidade consistente do enxerto venoso após a cirurgia inicial de enxerto venoso e a subsequente cirurgia de transdução tardia. Quando um enxerto de veia é patente, o exame de ultrassom revelará um grande vaso sanguíneo com fluxo sanguíneo caudal ao craniano. Os enxertos foram colhidos três dias após a transdução, cortados em cortes e corados com X-gal.

A imagem em face das superfícies luminais mostrou enxertos de veias com transdução eficiente e transdução pobre. Como mostrado neste gráfico, os níveis de mRNA de beta galactosidase em enxertos de veia transduzidos pelo novo operador não foram significativamente diferentes dos níveis de mRNA de beta galactosidase em enxertos de veia transduzidos por um operador experiente. Ao realizar este protocolo, é importante lembrar de reverter o enxerto venoso cranial para caudal antes de contrair a anastomose.

Isso é necessário para evitar a obstrução do fluxo sanguíneo pelo bolo venoso. Uma vez dominadas, essas cirurgias podem ser concluídas em cerca de três horas para o procedimento de enxerto de veia, duas horas para o procedimento de transferência de genes de enxerto de veia e 45 minutos para o procedimento de coleta. Não se esqueça de que, como este protocolo requer o trabalho com vetores virais e objetos pontiagudos, os procedimentos adequados de biossegurança e perfurocortantes devem ser seguidos.