Um modelo em Ovo para testar compostos insulino-mimética

O objetivo geral do modelo de embrião de pintinho modificado apresentado é caracterizar substâncias com propriedades miméticas de insulina em um organismo vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de diabéticos, como encontrar extratos de ervas com propriedades miméticas de insulina que reduzem os níveis de glicose no sangue sem efeitos colaterais. A principal vantagem dessa técnica é que a eficácia dos compostos pode ser testada em um organismo vivo com taxas de rendimento adequadas e que a permissão de um comitê de ética não é necessária.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação e corte são difíceis de aprender, porque os vasos não são facilmente preparados ou muitas vezes cortam completamente e se perdem. Verifique os ovos para fertilização após a incubação a 38 graus Celsius com umidade média de 40 a 60 por cento por até 11 dias. Para fazer isso, mergulhe a franja da lâmpada de ovoscopia em uma almofada de tinta e, em seguida, coloque uma vela no lado pontiagudo do ovo.

Para identificar a bexiga de ar, verifique se há diferenças de brilho na parte superior do ovo. A bexiga de ar aparece como uma região redonda e mais transparente, enquanto a albumina parece mais escura. Marque a localização da bexiga de ar pressionando a lâmpada levemente contra o ovo com a tinta aplicada anteriormente.

Exclua os ovos não fertilizados, que não apresentam diferença de brilho entre a albumina e a bexiga de ar. Prepare a insulina-mimética, ou insulina, diluindo até a concentração desejada na solução salina balanceada de Hank. Para aplicar o composto selecionado, use uma pinça pontiaguda para bicar cuidadosamente a casca do ovo na área marcada da bexiga de ar para formar um orifício igual ao diâmetro da seringa da agulha.

Use uma seringa estéril de um mililitro para injetar 300 microlitros da solução tampão contendo a substância de interesse. Para determinar o efeito redutor da glicose no sangue de uma substância, coloque os ovos de volta na incubadora e meça a glicose no sangue após 60, 120 e 180 minutos. No momento apropriado, remova cuidadosamente a casca do ovo acima da bexiga de ar e equilibre a membrana da casca do ovo adicionando tampão PBS suficiente para cobrir toda a membrana.

Depois de despejar o excesso de PBS, use uma pinça pontiaguda para retirar cuidadosamente a membrana da casca do ovo. Use uma micro tesoura para cortar e remover a membrana corioalantóide, evitando grandes vasos na membrana. Localize o grande vaso originário do abdômen do embrião.

Retire este recipiente da albumina com uma microtesoura fechada e coloque-o sobre uma tira de pH de plástico. Mova a tira de pH sob o recipiente e puxe a microtesoura para trás com cuidado. É essencial preparar o grande vaso sanguíneo originado do abdômen, pois os menores podem se romper, impossibilitando a coleta de sangue.

Remova qualquer líquido ao redor do vaso com uma pipeta para evitar a diluição do sangue. Em seguida, use papel de filtro para secar o recipiente e a tira de pH. Para a coleta de sangue, é importante não cortar completamente o vaso, pois ele se perderá.

Em seguida, use uma micro tesoura para cortar o vaso sanguíneo cuidadosamente de um lado. Não corte mais do que a metade do recipiente para evitar cortá-lo completamente. Colete o sangue que vaza para a tira de pH com uma pipeta.

São necessários 10 microlitros de sangue para determinar os níveis de glicose usando o medidor de glicose no sangue. Após a aplicação do composto selecionado por 24 horas, equilibre a membrana da casca do ovo com PBS como antes por pelo menos 30 segundos. Remova o excesso de tampão PBS despejando-o.

Em seguida, retire a membrana da casca do ovo cuidadosamente com uma pinça pontiaguda. Verifique se há lesões nos vasos sanguíneos e confirme a vitalidade observando o movimento do embrião de galinha. Extratos preparados a partir de combretum indicum, ou trepadeira de Rangum, e um extrato não divulgado rotulado como extrato 0845 foram usados para esses experimentos.

Conforme indicado nesta figura, o extrato da trepadeira de Rangum não resultou em uma redução significativa da glicose no sangue no ovo. No entanto, a concentração de glicose no sangue foi reduzida com sucesso com o extrato 0845, com um efeito significativo observado quando o tempo de incubação foi prolongado. Em comparação com os ovos não tratados, o tratamento dos ovos com um extrato de ervas tóxicas no dia 10 por 24 horas levou a lesões graves dos vasos sanguíneos na membrana corioalantóide.

As lesões também foram aparentes no embrião tratado em comparação com o controle normal. Uma vez dominados, dois ovos podem ser analisados quanto aos níveis de glicose e toxicidade em cinco minutos, se executados corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar os vasos sanguíneos e coletar sangue no modelo de embrião de galinha para quantificar os efeitos redutores da glicose no sangue de compostos naturais ou sintéticos.